Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9-34
Глава 2. Материалы и методы исследований 35-43
2.1. Общая характеристика клинических наблюдений 35-36
2.2. Методы исследований 36-43
Результаты собственных исследований
Глава 3 . Результаты исследований морфологическріх изменений слизистой оболочки желудка 44-57
3.1. Характеристика полипов 44-45
3.2. Характеристики очаговых гипертрофии слизистой оболочки желудка 46
3.3. Характеристика эрозий 47
3.4. Характеристика рака желудка 48
Глава 4. Изучение биологических свойств выделенных штаммов н. pylori 58-68
4.1. Изучение вирулентности и адгезивности выделенных штаммов Н. pylori 58-64
4.2. Возможность длительного сохранения культур Н. pylori 64-68
Глава 5 . Изучение влияния эрадикационнои терапии на динамику морфологических изменений слизистой оболочки желудка 69-73
Обсуждение полученных результатов 74-81
Выводы 82
Практические рекомендации л 83
Список литературы 84-108
Приложения 109
- Общая характеристика клинических наблюдений
- Характеристика полипов
- Изучение вирулентности и адгезивности выделенных штаммов Н. pylori
- Возможность длительного сохранения культур Н. pylori
Введение к работе
Актуальность темы. В последние десятилетия рост онкологических заболеваний сохраняет свою динамику, и проблема лечения и профилактики болезней злокачественного роста стоит достаточно остро. В структуре злокачественных болезней рак желудка (РЖ) занимает одно из ведущих мест. Ежегодно во всем мире регистрируют 798 тысяч новьж случаев, и каждый год они становятся причиной смерти 628 тысяч человек (Аксель Е.М., Давыдов М.И., Ушакова Т.И., 2001). Наряду с некоторыми государствами Юго-Восточной Азии, Южной Америки и Европы, Российскую Федерацию относят к странам с наиболее высоким показателем случаев РЖ, где регистрируют более 30 случаев на 100 тыс. населения (Aspinall R.J. et al., 2002). При этом в РФ РЖ устойчиво занимает второе место среди прочих онкологических заболеваний (Мерабишвили В.М., 2001; Чиссов В.И., Дарьялова СЛ. и др., 2000).
Известно, что РЖ практически никогда не возникает на фоне неизмененной слизистой. Ему предшествуют процессы, обозначаемые как предраковые (Серов В.В., Пальцев М.А., 1998). Поэтому основу профилактики злокачественных заболеваний желудка может составить своевременная диагностика и коррекция изменений слизистой оболочки желудка (СОЖ), вовлеченных в этапы канцерогенеза по схеме Соггеа Р. (1995): хроническое воспаление —* кишечная метаплазия —> дисплазия —* рак.
Как известно, развитию РЖ предшествует хронический атрофический гастрит, в этиологии которого важную роль играет персистенция Helicobacter pylori, что приводит к прогрессированию патологических изменений в СОЖ. Установлено, что у лиц, инфицированных Н. pylori, РЖ встречают в 4-8 раз чаще, чем у здоровых, что послужило одним из аргументов в пользу доказательства канцерогенности бактерий (Eurogast Study Group, 1993; АруинЛ.И., 1994; Forman D., 1996). Установление связи между инфицированностью Н. pylori и РЖ дало основание Международному агентству
РОСНАи* -ЛАЛЬМАЯ і
БИБЛИОТЕКА |
Cflmpfrpr и у *
I м -с1
2 по изучению рака отнести его к канцерогенам I группы (IARC, 1994). Эпидемиологические исследования, показали, что в развитых странах Н. pylori инфицирован каждый третий, а в развивающихся практически каждый взрослый человек. Однако у исследователей закономерно возникает вопрос, почему при такой высокой инфицированности онкология развивается далеко не у каждого человека? (АруинЛ.И., 1997). Очевидно, что для возникновения неопластических процессов только микробной колонизации СОЖ явно недостаточно. Возможно, что условиями для их развития являются эндогенные факторы: генетические особенности, иммунный статус организма (Е.М. El-Omar et al., 2000; Кононов А.В., 2003); экзогенные факторы: характер питания, стрессы, социально- экономические условия (Соггеа Р., 2000; YouW.C. et al., 2000; Zaridze D. et al, 2000; Siman D.H. et al. 2001; Brenner H. et al, 2002), а также давность и степень инфицирования вирулентными штаммами Н. Pylori (Forman D., 2000). Бактерии не синтезируют веществ, обладающих прямым мутагенным действием, но некоторые ферменты и токсины, можно рассматривать как пусковые механизмы для развития патологических процессов, приводящих к раку (Parsonnet J. et al., 1997; Домарадский И.В., 2001). Последние исследования показывают, что Н. pylori непосредственно способствует повреждению эпителиальных клеток посредством выработки цитотоксинов VacA и CagA (Бондаренко В.М., 2001; Бондаренко В.М., Червинец В.М., Воробьев А.А., 2003). Риск развития РЖ больше у лиц, инфицированных штаммами Н. pylori, образующих CagA и VacA (Crabtree J.E. е.а.,1993; Blaser M.J. e.a., 1995).
Данные литературы об обратимости последовательности желудочного канцерогенеза: атрофический гастрит —> кишечная метаплазия —> дисплазия слизистой оболочки желудка также очень противоречивы (MeiningA. et al., 2001). Часть авторов склоняется к выводу о необратимости данной последовательности, а элиминация Н. pylori, возможно, приводит к замедлению её развития (Feldman R.A., 2001; ValleJ., Gisbert J.P., 2001), другая часть исследований свидетельствует об обратном (Ковалева Н.Б. и соавт., 2002; Кашин СВ., Надежин А.С. 2003, Крылова И.В. и соавт., 2003).
Вышеуказанное свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения роли Н. pylori в патогенезе онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта и совершенствования методов их профилактики.
Цель исследования. Определить значимость инфицирования Н. pylori в развитии злокачественных опухолей желудка.
Задачи исследования:
Выявить частоту инфицирования Н. pylori у больных с предраковыми состояниями и онкологическими заболеваниями желудка
Изучить гистологическую картину морфологических изменений СОЖ при очаговой патологии желудка
Определить вирулентность и адгезивность штаммов Н. pylori, выделенных от больных с очаговой патологией желудка
Исследовать возможность обратимости морфологических изменений СОЖ после элиминации Н. pylori
Изучить возможность длительного сохранения штаммов Н. pylori.
Научная новизна. Разработаны методики определения вирулентных свойств Н. pylori в пробе с красителями Романовского-Гимзы и изучения адгезивности в реакции прямой гемагглютинации с эритроцитами барана в присутствии D-маннозы. Впервые предложено использование выявленных адгезивных свойств Н. pylori в качестве маркера вирулентности данного микроорганизма. Выявлена высокая частота инфицирования Н. pylori, сочетающаяся с высокой степенью обсемененности СОЖ, у больных воспалительными и неопластическими заболеваниями. Разработан алгоритм
4 повторного обследования больных очаговой патологией желудка комплексным методом Впервые разработана методика длительного сохранения Н. pylon при -20 С в специальной консервирующей смеси
Практическая значимость. Доказана зависимость развития очаговой патологии, имеющей различный злокачественный потенциал, от частоты, степени обсемененности вирулентными штаммами Н pylon.
Предложен алгоритм повторного обследования больных очаговой патологией желудка комплексным методом, включающим бактериоскопический, бактериологический, биохимический, гистологический методы исследования с целью определения эффективности эрадикационной терапии и возможного регресса морфологических изменений эпителия СОЖ.
Предложены доступные методики определения вирулентности и адгезивности выделенных штаммов Н. pylon. Предложена сахарозо-желатиновая среда в буферном растворе для консервирования штаммов Н. pylori при -20 С.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу бактериологической лаборатории Казанской государственной медицинской академии МЗ РФ, в работу клинического онкологического диспансера МЗ РТ, в учебный процесс кафедр микробиологии Казанского государственного медицинского университета и Казанской государственной медицинской академии МЗ РФ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Большинство форм очаговой патологии желудка ассоциировано с колонизацией Н. pylon.
2. Тяжесть морфологических изменений СОЖ зависит от степени
вирулентности штаммов Н. pylori.
Адгезивность Н. pylori, выявленная в реакции D-маннозонезависимой гемагтлютинации (МНГА), является маркером вирулентности.
Эрадикаиия Н. pylori может приводить к регрессу морфологических изменений преимущественно на начальных стадиях канцерогенеза.
5. Возможно длительное сохранение штаммов Н. pylori при -20 С в
специальной консервирующей смеси.
Апробация материалов работы. Основные положения диссертации доложены на юбилейной конференции, посвященной 55-летию онкологической службы Тюменской области (Тюмень, 2001); на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (Москва, 2002); на научно-практических конференциях молодых ученых (Казань, 2002; 2003); на X научно-практической конференции Поволжского региона «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань, 2002); на VI КАНТовской научно-практической конференции «Проблемы человека в современном обществе» (Казань, 2003); на юбилейной научной конференции с международным участием «Современная микробиология - клинической медицине и эпидемиологии» (Санкт-Петербург, 2003); на VI Международном симпозиуме «Диагностика и лечение заболеваний, ассоциированных с Helicobacter pylori» (Екатеринбург, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, получен патент на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов
исследования, раздела собственных исследований, включающего три главы, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 36 отечественных и 201 зарубежных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на ПО страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами, 12 рисунками. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Общая характеристика клинических наблюдений
В работе были использованы следующие методы исследования: гистологический, бактериоскопический, биохимический, бактериологический, статистический. Для изучения морфологических изменений слизистой оболочки желудка биоптаты из патологических участков мы подвергали гистологическому исследованию. Биоптаты фиксировали в 70% этиловом спирте и, после соответствующей проводки, заливали в парафин. Срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону и микроскопировали. Морфологически оценивали изменения слизистой оболочки желудка в виде хронического воспаления (рис.2.2.2.), воспалительной гиперплазии, атрофии (рис.2.2.1), кишечной метаплазии, дисплазии (рис.2.2.3.), аденокарциноми.
Для обнаружения Н. pylori использовали комплексный метод, включающий бактериоскопический, биохимический, бактериологический методы исследования. Материалом для данного исследования служили биоптаты, полученные при ФЭГДС больных, по два из области патологии и прилегающей визуально неизмененной слизистой. Биоптаты помещали в пробирки с 5 мл транспортной полужидкой тиогликолевой средой и в течение 4-6 часов с момента взятия материала доставляли в лабораторию. Один кусочек биоптата использовали для бактериоскопического и биохимического исследования, а другой - для приготовления гомогената, необходимого для бактериологического и биохимического исследования.
Из одного кусочка биоптата готовили мазки-отпечатки, окрашивали по Граму и разведенным фуксином и микроскопировали. Из второго кусочка биоптата, взятого из той же области, готовили взвесь, растирая его в ступке с 1 мл физиологического раствора. Затем производили посев по одной капле гомогената на три чашки: с кровяным агаром (контроль), кровяным и эритрит агаром, дополненными амфотерицином В (опыт). Контрольные чашки (с кровяным агаром) инкубировали при 37 С в аэробных условиях. Опытные чашки с кровяным агаром и эритрит-агаром, дополненными амфотерицином В, культивировали в микроаэрофильных условиях в течение 4-6 дней при 37 С. Микроаэрофильные условия создавали путем внесения в эксикатор зажженной парафиновой свечи и стаканчика с 10% раствором серной кислоты, в который помещали пакетик из фильтровальной бумаги с питьевой содой. Раствор кислоты и соды брали из расчета 10 мл и 1 грамм соответственно на 1 литр эксикатора. После герметизации эксикатора и угасания свечи его встряхивали, и пакетик с содой погружался в кислоту. В результате химической реакции выделялся углекислый газ и, таким образом, создавались благоприятные условия для культивирования микроаэрофильных и капнофильных бактерий (содержание ССЬ — 10-15%, повышенная влажность). Принадлежность культур к Н. pylori определяли по характерной морфологии колоний, изучения морфологии бактерий при микроскопии мазков из выросших колоний, окрашенных по Граму и разведенным фуксином, изучения «винтообразной подвижности» в препарате «раздавленная капля» методом фазово-контрастной микроскопии, способности к росту в микроаэрофильных условиях, отсутствию роста в аэробных условиях, а также определением оксидазной, каталазной и уреазной активности. Параллельно подсчитывали количество выросших колоний Н. pylori, пересчитывая на биоптат.
Биохимическое исследование проводили с биоптатом, использованным также для приготовления мазка-отпечатка, и 0,5 мл взвеси, приготовленной гомогенизированием второго биоптата в 1 мл стерильного физиологического раствора. Для определения уреазной активности использовали С1о-тест (мочевина 10 мг, тетрациклин 10ЕД, феноловый красный 8-10 кристаллов). При pH 6,8 индикатор имеет желтый цвет, при рН 8,4 - малиново-красный. Среду готовили ежемесячно и хранили при 4 С. Учет результатов С1о-теста производили через 1, 3, 6 часов и окончательно через 24 часа. Положительный ответ об обнаружении Н. pylori мы выдавали по совокупности положительных результатов при бактериоскопическом, бактериологическом и биохимическом исследованиях. В тех случаях, когда в мазках-отпечатках обнаруживали характерные грамотрицательные палочки и С1о — тест был положительным, также выдавали ответ об обнаружении Н. pylori. В случаях отрицательной бактериоскопии и отсутствия роста, характерного для Н. pylori, но при положительном С1о - тесте мы выдавали отрицательный ответ, так как С1о тест неспецифичен и может быть положительным при других инфекциях, вызванных уреазоположительными микроорганизмами (протеем, стафилококками, кандидами и другими).
Характеристика полипов
Характеристика полипов. Нами обследовано 83 больных с полипами желудка, из них у 28 был диагностирован аденоматозный полип, у 55 - гиперпластический. Н. pylori был обнаружен у 56 пациентов (67,5%): — у больных с аденоматозными полипами Н. pylori обнаружен в 22 из 28 случаев (78,6%+7,8); — у больных с гиперпластическими полипами — в 34 из 55 случаев (61,8%±6,6). Частота обнаружения Н. pylori при полипах была достоверно выше, чем в контрольной группе (р 0,05). У больных с аденоматозными полипами тубулярные аденомы были покрыты соединительно-тканной капсулой. Паренхима опухоли представлена тяжами достаточно дифференцированного цилиндрического эпителия. Эпителий мономорфный с сохранной способностью к слизеобразованию, что придает опухоли характер микрокистозной структуры. Строма выражена, богато васкуляризирована, с признаками лейкоцитарной и лимфоцитарной инфильтрации. Эпителий расположен на собственной мембране, сохраняет полярность и комплексность (рис.3.1.).
При гистологическом изучении аденоматозных полипов были определены следующие морфологические изменения: хроническое воспаление— 3, гиперплазия— 2, атрофия— 2, кишечная метаплазия— 9, дисплазия— 12. При морфологическом изучении гиперпластических полипов были обнаружены: хроническое воспаление- 7, атрофия— 1, гиперплазия—-20, кишечная метаплазия — 21, дисплазия — 6.
При сравнительном исследовании частоты обнаружения Н. pylori из области патологии и визуально неизмененной слизистой оболочки желудка обсемененность Н. pylori области патологии была незначительно ниже, чем из прилегающей слизистой, и составила соответственно 72,7±7,8% и 93,9+4,2% (при гиперпластических полипах), 72,7±9,5% и 90,9+6,1% (при аденоматозных полипах), но достоверных различий обнаружено не было (р 0,05). У 19 больных Н. pylori не был обнаружен в биоптате из области патологии, при этом прилегающая слизистая была инфицирована. При бактериологическом исследовании больных полипами было выделено 54 штамма. В двух случаях из-за пророста среды Н. pylori выделить не удалось, но по положительным результатам бактериоскопии и С1о — теста был дан положительный ответ.
При определении степени обсемененности слизистой оболочки желудка было установлено, что она была на порядок выше в области, прилегающей к полипу, чем в области самого полипа. У больных полипами преимущественно была выявлена умеренная степень обсемененности (10"-10 КОЕ/мл) - в 47 случаях из 55 и высокая (104-105 КОЕ/мл) - в 8 случаях.
При гистологическом исследовании среди 22 пациентов с аденоматозными полипами и диагностированным Н. pylori были обнаружены: хроническое воспаление — у 2, атрофия — у 2, гиперплазия — у 1, кишечная метаплазия— у 8, дисплазия— у 10. При морфологическом изучении слизистой оболочки желудка среди 34 пациентов с гиперпластическими полипами, ассоциированными с Н. pylori было выявлены: хроническое воспаление— у 6, гиперплазия— у 11, кишечная метаплазия— у 12, дисплазия — у 4 Характеристика очаговых гипертрофии слизистой оболочки желудка.
В группу очаговых гипертрофии слизистой оболочки желудка были объединены больные, у которых при ФЭГДС были обнаружены папиллярные разрастания, одиночные утолщенные складки и одиночные очаги гипертрофии. Было обследовано 35 пациентов, из которых у 28 был обнаружен Н. pylori (80,0±6,8%). Частота обнаружения Н. pylori при очаговых гипертрофиях слизистой желудка была достоверно выше при сравнении с контрольной группой (р 0,01). Было выделено 28 штаммов Н. pylori.
У пациентов с очаговой гипертрофией слизистая оболочка утолщена, находится в состоянии воспаления, проявляющегося слущиванием эпителия. В просвете присутствуют слущенные эпителиальные клетки и лейкоциты. В строме слизистой оболочки и подслизистой основы определяются лейкоциты. Сосуды полнокровны (рис.3.2.).
При гистологическом исследовании биоптатов были выявлены следующие морфологические изменения: хроническое воспаление— в 10 случаях, атрофия— в 1, гиперплазия— в 10, кишечная метаплазия— в б, дисплазия— в 8. Из них Н. pylori диагностировали при хроническом воспалении— в 7 случаях, атрофии— в 1, гиперплазии— в 8, кишечной метаплазии — в 4, дисплазии — в 8.
При сравнительном изучении инфицированности Н. pylori области патологии и прилегающей слизистой было выявлено, что частота обнаружения Н. pylori в области патологии была незначительно ниже, чем в области прилегающей слизистой — 22 и 27 соответственно (78,6+7,8% и 96,4±3,5%), но достоверных различий не было обнаружено (р 0,05). При определении степени обсемененности слизистой оболочки желудка при очаговых гипертрофиях преимущественно была выявлена умеренная степень (10 -10 КОЕ/мл)— у 22 больных, у 2 — низкая степень (101 КОЕ/мл), у 4 — высокая (104-105 КОЕ/мл).
Изучение вирулентности и адгезивности выделенных штаммов Н. pylori
От больных с различной очаговой патологией слизистой оболочки желудка было выделено 146 штаммов Н. pylori. Нами была изучена вирулентность выделенных штаммов в пробе с анилиновыми красителями. Включение анилиновых красителей в цитоплазму бактериальных клеток позволяет косвенно судить об их вирулентности (Григорьева Л.В., Корчак Г.И., Малахова Л.А, 1992).
Проведенные исследования показали, что вирулентность выделенных штаммов Н. pylori составила 79,97±3,79%. (табл. 4.1.1). При этом вирулентность штаммов коррелировала со степенью тяжести последовательных патологий на этапах канцерогенеза (хроническое воспаление —» кишечная метаплазия - дисплазия -» рак). При злокачественных опухолях и предраковых изменениях (кишечной метаплазии, дисплазии) количество вирулентных штаммов составляло абсолютное большинство изолятов (95,2±4,7% и 84,2+5,9% соответственно) по сравнению с изолятами, выделенными на начальных этапах данной последовательности (хроническое воспаление, атрофия, гиперплазия) - 54,9+6,98% (р 0,001). Развитие неопластического процесса наблюдали у лиц, инфицированных высоковирулентными штаммами бактерий: при кишечной метаплазии, дисплазии, аденокарциноме большинство изолятов принадлежало к высоко - и умеренновирулентным штаммам, тогда как при хроническом воспалении, атрофии и гиперплазии большинство составляли штаммы со слабовирулентными свойствами (р 0,05). В наших исследованиях при предраковых состояниях слизистой оболочки желудка и аденокарциноме преимущественно выделяли штаммы Н. pylori, отличающиеся интенсивным включением красителя Романовского-Гимзы, что позволяет предположить их более высокую вирулентность по сравнению со штаммами, выделенными от больных с патологическими изменениями слизистой оболочки желудка на начальных стадиях канцерогенеза (хроническое воспаление, атрофия, гиперплазия). Таким образом, одним из возможных факторов, определяющих степень злокачественных изменений слизистой, может являться степень вирулентности Н. pylori.
При изучении вирулентности штаммов Н. pylori в зависимости от нозологической формы патологического процесса было установлено, что при раках желудка авирулентных штаммов было выделено меньше, чем при полипах и эрозиях, а большинство изолятов принадлежало к высоковирулентным (р 0,05) (табл. 4.1.2).
Субкультивирование 30 выделенных культур Н. pylori на эритрит-агаре показало прогрессивное сокращение роста с увеличением пассажей. Большинство культур (27) прекратили рост между 2-3 пассажами. Только 3 культуры выдержали 4 пересева. С каждым пассажем происходило уменьшение зоны газонного роста и размеров колоний до точечных. В мазках-отпечатках преобладали инволюционные кокковидной формы палочки. При рекультивировании изолятов Н. pylori мы отмечали изменения не только морфологических и культуральных свойств, но и вирулентности. При изучении вирулентности субкультивированных культур в пробе с красителем Романовского - Гимзы мы наблюдали менее выраженную окраску, чем у свежевыделенных штаммов: от светло-синего и светло-зеленого цвета до бесцветного, что соответствует слабой степени и авирулентности. При этом колониям Н. pylori требовался более длительный срок для включения красителя (более 15 минут). Таким образом, мы предлагаем проводить исследование вирулентности в пробе с анилиновыми красителями только свежевыделенных штаммов, изолированных из биоптата, без дополнительных пересевов для предупреждения ложноотрицательных результатов.
Нами была изучена способность выделенных штаммов H.pylori адгезии к различным эритроцитам в присутствии D-маннозы. Адгезивность составила 71,7+2,75%. Наиболее активно бактерии адгезировали к эритроцитам барана и к эритроцитам человека, реже— к эритроцитам лошади (р 0,01) (рис. 4.1.1.). Поэтому для изучения гемагглютинирующих свойств Н. pylori предпочтительно применение эритроцитов барана.
Возможность длительного сохранения культур Н. pylori
Основная задача хранения культур — поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности важных таксономических свойств, представляющих интерес для науки и практики. Известны различные способы длительного хранения культур микроорганизмов: субкультивирование, хранение под минеральным маслом, высушивание, лиофилизация, хранение при низких ультранизких температурах. Наиболее эффективными из них являются методы сублимационной сушки и хранение при низких температурах.
Несмотря на огромное количество публикаций, посвященных изучению биологических свойств Н. pylori, вопросы сохранения этого микроорганизма остаются недостаточно изученными. В литературе предложены различные методы длительного сохранения культур Н. pylori.
R Ansorg. и др. (1991) провели серию экспериментов по сохранению Н. pylori при -70 С в 10% растворе муцина, плодной сыворотке теленка и в коммерческой криопресервной жидкости. Из 30 изолятов от 77 до 90 % культур было рекультивировано на кровяном агаре с добавлением овечьей крови после сохранения при -70 С во всех трех консервирующих средах. R Ansorg. и др. пришли к заключению, что из всех изученных сред 10% раствор муцина — наиболее эффективная среда для сохранения Н. pylori при -70 С. М. Shahamat с соавт. (1992) сравнивали различные криопресервные среды (кровь овцы, лошади, сыворотка лошади с глицерином и без него) для хранения культур Н. pylori при -70 С в жидком азоте. После хранения 32 культур в течение 24-месяцев было рекультивировано в 87,5% случаях, а через три года - в 60%. Авторы пришли к заключению, что большинство культур Н. pylori могут быть сохранены при -70 С в жидком азоте в течение года и более. S.J. Liaw и соавт. (1998) изучали длительное хранение 40 культур Н. pylori в пяти средах, приготовленных на основе бульона для выделения бруцелл с различными дополнениями (с 17% глицерина, с 17 % глицерина и 2% эмбриональной сывороткой теленка (FCS), с 17% глицерина и 10% FCS, с 17% глицерина и 2% крови лошади) и в 10% растворе муцина при -70 С в течение 4, 6, 9 месяцев. Авторы пришли к выводу, что добавки в виде эмбриональной сыворотки теленка и крови лошади к среде для выделения бруцелл с глицерином увеличивают сроки выживания Н. pylori при низких температурах. Хранение в 10% муцине - наиболее простой способ длительного сохранения культур Н. pylori. A. Spengler и соавт. (1992) предложили методы сохранения Н. pylori при -75 С в глицерине и при +4 С после сублимационной сушки. Л.В Кудрявцева и др. (1999) применяли замораживание выделенных штаммов Н. pylori в 0,5 мл цельной кроличьей крови при -70 С с дальнейшим субкультивированием на колумбийском агаре с 10% бараньей крови. Но все эти методики могут быть осуществимы при наличии жидкого азота, рефрижераторов для его хранения, аппаратов для создания вакуума и т.д., что может ограничивать их применение в лабораториях, не оснащенных специальным оборудованием.
Известен способ длительного сохранения культур Bordetella pertussis в консервирующей смеси по рецепту МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского (Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше, 1983). Для ее приготовления используют два раствора: первый - 80% раствор глицерина в буферном растворе и второй -10% раствор сахарозы и 1% раствор желатина. Культуры В. pertussis хранят в консервирующей смеси при -30 С длительностью до года.
Нами была изучена способность Н. pylori (30 изолятов) к длительному сохранению в морозильной камере в модифицированной консервирующей смеси (сахарозо-желатиновая среда в буферно - физиологическом растворе) (приложение 1). Для защиты клеток Н. pylori от отрицательного воздействия низких температур мы использовали криопротекторы двух типов: желатин, который легко переходит через клеточную мембрану и обеспечивает внутри- и внеклеточную защиту, и сахарозу, обеспечивающую защитное действие на наружной поверхности мембраны.
Культуры Н. pylori, выделенные от больных с очаговой патологией желудка, по 3-4 петли помещали на дно агглютинационной пробирки с консервирующей смесью и хранили при -20 С в морозильной камере. Через 6-9-12-15-18 месяцев производили медленное размораживание культур при комнатной температуре с последующим высевом на эритрит - агар и кровяной агар с добавлением 10% бараньей крови, дополненных амфотерицином В. Материал брали пипеткой со дна пробирки и производили посев по 2 капли на чашки с питательными средами. Капли растирали петлей по всей поверхности среды во взаимноперпендикулярных направлениях. Засеянные чашки культивировали в микроаэрофильных условиях при +37 С в течение 3 дней. Наилучшие результаты были получены при высевах на эритрит-агар с амфотерицином В. Из 30 изученных культур Н. pylori 27 изолятов были рекультивированы на эритрит агаре по сравнению с 18 культурами, рекультивированными на кровяном агаре. После хранения выделенных штаммов в течение 6 и 9 месяцев нами было рекультивировано 100% культур, после 12 месяцев— 90%. При сравнительном изучении частоты рекультивирования мы обнаружили снижение высеваемости культур Н. pylori при хранении свыше 12 месяцев (рис.4.2.1).
