Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
Глава 2.1. Общая характеристика Helicobacter pylori 11
2.1.1. История открытия рода Helicobacter 11
2.1.2. Виды Helicobacter spp 14
2.1.3. Морфологические и физиолого-биохимические свойства
рода Helicobacter 16
2.1.4. Методы диагностики H.pylori 19
2.1.5. Значение H.pylori в экологии и патологии человека 20
Глава 2.2. Уреаза H.pylori 25
2.2.1. Фермент - характеристика и свойства 25
2.2.2. Методы определения уреазной активности микроорганизмов 27
2.2.3. Идентификация H.pylori с помощью уреазы 28
Глава 2.3. Культивирование H.pylori 30
2.3.1. Культивирование на полноценных средах 30
2.3.2. Анализ известных синтетических сред для культивирования H.pylori 33
Глава 2.4. Антигены H.pylori 34
2.4.1. Белки и липопротеины 34
2.4.2. Липополисахариды 38
Глава 2.5. Заключение по обзору литературы 39
3. Собственные исследования 41
Глава 3.1. Объекты и методы исследования 41
Глава 3.2. Создание коллекции штаммов H.pylori 48
Глава 3.3. Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori 49
3.3.1. Разработка метода 49
3.3.2. Сравнение уреазной активности биоптатов и культур H.pylori 54
3.3.3. Изучение уреазной активности культур H.pylori в разных фазах роста 54Глава 3.4. Разработка новой синтетической среды для культивирования H.pylori 56
3.4.1. Разработка среды 56
3.4.2. Влияние концентрации лошадиного гемоглобина на рост H.pylori 74
Глава 3.5. Получение клеточных и внеклеточных антигенсо держащих
препаратов из H.pylori и их оценка методом иммуноблоттинга 79
Глава 3.6. Исследование бактериологических, биохимических и иммунологических показателей, связанных с носительством H.pylori в группе больных язвенной болезнью 87
3.6.1. Изучение взаимосвязи между количественной уреазной активностью биоптатов и тяжестью течения заболевания 87
3.6.2. Оценка наличия IgG-антител к H.pylori методом ИФА в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров 92
3.6.3. Расчет скорости выделения [ОН ] ионов пилорическим отделом желудка (в случае наличия H.pylori в слизистой оболочке) 95
3.6.4. Расчет потребления гемоглобина хеликобактером в пилорическом отделе среднестатистического желудка 97
4. Заключение 100
5. Выводы 112
6. Литература 114
- История открытия рода Helicobacter
- Значение H.pylori в экологии и патологии человека
- Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori
- Влияние концентрации лошадиного гемоглобина на рост H.pylori
Введение к работе
Актуальность проблемы
Helicobacter pylori - микроаэрофильные, неспорообразующие, грамотрицательные, изогнутые палочковидные или кокковидные бактерии, населяющие слизистые оболочки нижних отделов желудка и двенадцатиперстной кишки [Marshall B.J., 1984]. В настоящее время принято считать, что H.pylori ассоциирован с хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, а также является фактором риска при развитии карциномы желудка [Perez-Perez G.I., Blaser M.J, 2003]. Присутствие H.pylori не всегда подразумевает наличие болезни - носительство среди здоровой части популяции составляет 20-84% [Axon А., 1999]. Есть мнение, что H.pylori может играть позитивную роль для человека, поскольку его удаление имеет и отрицательные последствия [Blaser M.J., 1997; Blaser M.J., 1999; Labenz J. et al., 1997; Chow W.H. et al., 1998; Werdmuller B.F. et al., 1997]. Однако конкретных гипотез и доказательств возможной положительной роли H.pylori в доступной литературе до сих пор не представлено. Какой бы ни была роль данных бактерий в организме здоровых и иммунокомпрометированных носителей, диагностика хеликобактериоза остается актуальной.
Существующие методы диагностики включают
бактериологические, гистологические, биохимические (разновидности уреазного теста), иммунологические и молекулярно-генетические методы [Лапина Т.Л., 1999]. Обычно для клинической диагностики проводят эндоскопию с последующим исследованием образцов биоптатов слизистой оболочки: посевом на селективную среду, окрашиванием мазков-отпечатков по Граму, качественным определением уреазной активности. Уреаза Н. pylori составляет до 10%
от общего белка клетки [Bauerfeind P. et al., 1997]. Этот фермент разлагает мочевину с образованием гидроксил анионов, обеспечивая бактериям возможность персистенции в агрессивной среде желудка, и является одним из главных антигенов Н. pylori. Количественный метод определения активности уреазы в разных вариациях используется в исследовательских целях для оценки активности суспензий клеток различных микроорганизмов и препаратов фермента разной степени очистки [M.-Plaza I., R.-Herrera J., 1967; Юодвальките С.-Д., 1983], однако, до сих пор не был разработан для биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.
При проведении скрининговых эпидемиологических исследований, а также в случаях невозможности проведения эндоскопии, чаще всего в мировой практике используют иммунодиагностику. За рубежом создан ряд коммерческих препаратов для иммунной диагностики, основанный на использовании антигенов H.pylori. Первое поколение антигенных препаратов из H.pylori, используемых и в настоящее время, включает: целые бактериальные клетки; кислотно-глициновые экстракты биомассы; клетки, обработанные формалином; ультразвуковые экстракты клеток [Perez-Perez G.I., Blaser MJ, 2003]. Известны антигенные белки клеток H.pylori: Vac А - вакуолизирующий цитотоксин (мол.масса 87 кДа); Cag А - цитотоксин ассоциированный белок (140 кДа); субъединицы уреазы - Ure А (29.5 кДа) и Ure В (66 кДа); Hsp 60 - белок теплового шока (59-60 кДа); жгутиковый флагеллин - Fla (55 кДа); мембранный белок - аналог флаводоксина Fid А (19 кДа) и др. В новом поколении антигенных препаратов используют комплекс высокоочищенных белков - клеточных антигенов H.pylori. Известны также специфичные антигены, выделяемые H.pylori в окружающую среду, набор которых значительно уже, чем клеточных [Lindholm С. et al, 1997].
Важным звеном при получении антигенсодержащих препаратов для последующей разработки диагностикумов являются питательные среды и процессы культивирования. Учитывая, что некоторые высокоспецифичные антигены Н. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве, очень актуально использование синтетических сред определенного химического состава. В доступной литературе описаны такие среды, однако, все они содержат бычий или лошадиный сывороточный альбумин [Albertson N. et al., 1998; Nedenskov P., 1994; Reynolds D.J. and Penn C.W., 1994; Testermann T.L. et al., 2001]. Более или менее значимый прирост биомассы H.pylori отмечен лишь при невысокой степени очистки данного белка. Очевидно, что до сих пор не найден тот основной компонент синтетической среды, который дал бы возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы.
Изложенное свидетельствует о том, что для усовершенствования диагностики Hpylori необходимо наличие чувствительного экспресс-метода определения уреазы и высококачественных антигенных препаратов, получаемых с помощью синтетической питательной среды.
Цель исследования:
Исследование активности уреазы и оценка влияния состава питательной среды на накопление биомассы и образование клеточных и внеклеточных белоксодержащих антигенов Hpylori.
Задачи исследования:
Создание коллекции штаммов Hpylori.
Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori.
Разработка новой синтетической среды для культивирования H.pylori.
Получение клеточных и внеклеточных антигенсодержащих препаратов из H.pylori при культивировании на поноценной и синтетической средах.
Оценка методами ИФА и иммуноблоттинга специфических IgG-антител в сыворотках крови больных язвенной болезнью и бессимптомных доноров с использованием полученных антигенсодержащих препаратов из H.pylori
Научная новизна
С помощью разработанного количественного метода показано, что уреазная активность биоптатов коррелирует с активностью уреазы выделенных их них культур H.pylori. Уреазная активность культур зависит от фазы роста: в фазе замедления она в 1,4-10 раз выше, чем в стационарной фазе.
Сопоставление количественной уреазной активности и тяжести течения заболевания в группе больных язвенной болезнью показало отсутствие корреляции между этими показателями.
Метод дает возможность оценить продукцию хеликобактером гидроксил анионов в желудке и, таким образом, судить об участии бактерий в поддержании кислотно-щелочного баланса.
Обнаружено, что именно гемоглобин является тем принципиальным компонентом синтетической среды, который дает возможность культивировать H.pylori с высоким выходом биомассы.
Практическая значимость
Создана лабораторная коллекция клинических изолятов, насчитывающая 30 штаммов H.pylori.
Разработан количественный метод определения уреазной активности применительно к биоптатам слизистой оболочки желудка и клеточным суспензиям H.pylori, основанный на регистрации изменения рН в реакционной смеси. Метод прост в исполнении и дает полезную информацию в течение 10-40 минут, в отличие от нескольких часов при определении активности уреазы на качественном уровне. В группе из 51 больного язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки данным методом показано наличие H.pylori у 87.7% пациентов.
Создана синтетическая среда для культивирования H.pylori, содержащая минеральные соли, витамины, антибиотики, аминокислоты, гемоглобин, глутамин в качестве основного источника углерода и энергии, 0,1% агарозы для адгезии клеток.
Установлено, что антигенсодержащий препарат из культуральной жидкости после выращивания H.pylori на синтетической среде является более перспективным для создания диагностикума, чем препараты, полученные из клеток H.pylori, выращенных на синтетической или полноценной среде, поскольку содержит минимум антигенов, не имеющих значения для диагностики.
Основные положения, выносимые на защиту
Разработан количественный высокочувствительный метод определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori, основанный на учете скорости продукции гидроксил анионов.
Разработана новая эффективная синтетическая среда для культивирования H.pylori, содержащая в качестве основных органических компонентов глутамин и гемоглобин.
Культивирование H.pylori на разработанной синтетической среде
обеспечивает получение внеклеточных специфических диагностических антигенсодержащих белков без дополнительной очистки. 4. Экспериментально обосновано предположение о роли Н.pylori в качестве биохимического барьера, регулирующего кислотность на границе желудка и двенадцатиперстной кишки на основании соотнесения скорости продукции гидроксил анионов клетками H.pylori со скоростью выделения протонов слизистой оболочкой желудка.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (2001); на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (2003); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Москве (2003); на заседании Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (2004). Диссертация апробирована на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН 4 марта 2005 года.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
История открытия рода Helicobacter
Впервые спиралевидные микроорганизмы в желудке животных были описаны немецким гистологом Bottcher G. в 1874 году. В 1881 году Rappin L. также упомянул об обнаружении спиралевидных бактерий (которые он гордо назвал Spirocheta rappini) в желудке собак. Итальянский анатом Bizzozero G. в 1893 году опубликовал изображения спирохетоподобных организмов, найденных в желудке собак. Тремя годами позже, в 1896 г. Salomon Н. дал подробное описание свойств спиралевидных микроорганизмов, обнаруженных в желудке животных, включая структуру жгутиков, подвижность, и перечень хозяев. Первые данные об обнаружении спиралевидных бактерий в желудке человека появились в 1889 году. Польский гастроэнтеролог Jaworski W. заметил их в смывах со слизистой желудка, полученных от человека, и предположил, что они могут играть роль в возникновении язвенной болезни. В 1899 году сходные микроорганизмы описал датский гастроэнтеролог Pel Р.К., и также предположил их участие в язвенной болезни [Pantoflickova D. and Blum A.L., 2001]. Немецкий ученый Krienitz U. в 1906 году впервые описал спирохеты на изъязвившейся карциноме желудка человека (при аутопсии). Среди ранних работ следует отметить труд датского ученого Fibiger J. (1913), которому впервые удалось создать экспериментальную модель рака желудка на мышах при введении в их пищу бактерий. Данные бактерии он назвал Spirocheta carcinoma. Через 14 лет, в 1927 году за эти работы он был удостоен Нобелевской премии. В 1916 японские ученые Kassi К. и Kabayashi R. описали спирохеты в желудке млекопитающих [Баранская Е.К., 1999]. В 1939 году в ходе аутопсии большого количества молодых людей американский ученый Doenges J.L. обнаруживал спиралевидные микроорганизмы в 40% случаев. Другой исследователь из США Freedberg S. впервые описал спиралевидные микроорганизмы в прижизненном материале -слизистой резерцированного желудка больных язвой и раком [Pantoflickova D. and Blum A.L., 2001].
Параллельно с описанием спирохет появлялись данные, косвенно указывающие на присутствие бактерий в желудке. В 1852 году Bidder и Schmidt обнаружили в желудке животных уреазу, затем Luck J.M. и Seth T.N. в 1924 выявили присутствие большого количества активной уреазы в желудке человека, а в 1955 Kornberg H.L. и Davis R.E. сделали заключение об ее бактериальном происхождении. После появления работы Palmer Е. (1954), который подтвердил стерильность желудка и объявил спиралевидные бактерии контаминантами, временно находящимися в желудке на пути транзита в кишечник, исследования в этой области приостанавливаются на 20 лет [Баранская Е.К., 1999]. Таким образом, этапы активных исследований сменялись годами отсутствия работ. Все находки спиралевидных бактерий ограничивались лишь их описанием, получить чистую культуру и идентифицировать микроорганизмы никто не пытался.
В 1975 году Steer H.W. показал, что данные бактерии прикреплены к эпителиоцитам желудка и выявил их муколитические свойства [Steer H.W., 1975]. Однако, его предположение об их возможной этиопатологической роли в образовании гастрита и язвы желудка было столь осторожно, что не вызвало отклика в научном сообществе, которое на тот момент было сосредоточено на других теориях возникновения этих заболеваний.
В 1982 году на западном побережье Австралии, в Перте, в Королевском госпитале ученые Marshall В. и Warren R. в биоптатах слизистой оболочки желудка человека описали короткие спиралевидные бактерии с пятью униполярно расположенными жгутиками, которые находились в тесной связи с поверхностным эпителием желудка непосредственно под слоем слизи. Присутствие бактерий всегда сопровождалось морфологическими изменениями слизистой, характерными для хронического активного гастрита [Warren J.R., Marshall B.J., 1983]. На следующем этапе исследования ученые пытались получить чистую культуру микроорганизмов, чтобы в дальнейшем провести их идентификацию. Первые 34 биоптата инкубировали с использованием стандартной неселективной среды для кампилобактерий в течение 48 часов и не дали роста. Один биоптат был к счастью забыт в инкубаторе и через 5 дней обнаружили обильный рост бактерий, которые назвали Campylobacter pyloridis [Marshall B.J. et al.,1984].
Далее были продолжены клинические исследования и выявлены бактерии у всех пациентов с дуоденальными язвами и у 70% больных с язвами желудка Ученые предположили, что заселение бактериями желудка играет важную роль в развитии болезни, и антибактериальная терапия может оказаться успешной для заживления язв [Marshall B.J. et al.,1985].
Открытие данных микроорганизмов инициировало одну из главных революций в медицине 20-го века и дало толчок к дальнейшим исследованиям в области гастроэнтерологии, микробиологии, иммунологии, генетики, фармакологии. Кроме научно-исследовательских программ, стали создаваться новые технологии и промышленные производства диагностических средств, лекарственных препаратов; образовались специализированные образовательные программы и общественные научные организации.
Значение H.pylori в экологии и патологии человека
Основные методы, разработанные для диагностики H.pylori можно группировать следующим образом: на инвазивные и неивазивные, на прямые и косвенные.
К инвазивным методам относят методы, для проведения которых необходима эзофагогастродуоденоскопия, так как материалом для исследования служат биоптаты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки [Cohen Н. and Laine L., 1997]. Неинвазивными названы методы, не требующие эндоскопического исследования [Atherton J.C., 1997]. Некоторые авторы не согласны с таким названием, поскольку, например, для серологического исследования необходима «инвазивная» процедура забора крови. Неинвазивные методы используют, как правило, для эпидемиологических исследований распространенности H.pylori, особенно среди детей [Лапина Т.Л., 1999].
Прямые методы позволяют непосредственно выявить микроорганизм, например, под микроскопом в гистологическом препарате. Косвенные методы регистрируют не сами бактерии, а последствия их пребывания в организме [Лапина Т.Л., 1999]. Так, с помощью серологического метода определяются антитела к Hpylori, а при дыхательном тесте с меченной 13С или 14С мочевиной - приращение углекислого газа с меткой изотопа в выдыхаемом воздухе.
Таким образом, методами диагностики H.pylori являются:
1. Бактериологический (посев биоптатов слизистой оболочки на селективную среду) [Аруин Л.И. с соавт., 1993; Megraud F., 1997].
2. Гистологический (исследование окрашенных гистологических препаратов слизистой оболочки - возможность оценить состояние слизистой, а не только наличие H.pylori) [Аруин Л.И. с соавт., 1993; Cohen Н. and Laine L., 1997].
3. Цитологический (выявление H.pylori в мазках-отпечатках биоптатов) [Аруин Л.И. с соавт., 1993; Cohen Н. and Laine L., 1997].
4. Основанные на уреазной активности H.pylori (см. Главу 2.2.3.): - уреазные тесты с биоптатами; - дыхательные тесты с мочевиной, меченной 13С или 14С.
4. Иммунологические [Atherton J.C., 1997; Megraud F., 1997]: - серологические (определение антител к H.pylori в сыворотке крови); - иммуногистохимический (выявление антигенов H.pylori в гастробиоптатах).
5. Молекулярно-генетические - полимеразная цепная реакция (идентификация видоспецифичного фрагмента ДНК) [Пасечников В.Д., 1998; Monteiro L. et al., 1996].
В желудок попадает множество бактерий, но они быстро погибают, не выдерживая кислой среды, либо проходят транзитом в кишечник. Лишь при гипоацидозе слизистая желудка заселяется интестинальной (т.е. типичной для кишечника) микрофлорой, но это уже вторичная инфекция - результат патологии [Маянский А.Н.,1999]. Для вида H.pylori человек - один из немногих хозяев, а его желудок -уникальная экологическая ниша, в которой микроб способен длительно персистировать, не вступая в патогенетически значимый конфликт с хозяином. Микроорганизм и его носитель эволюционировали вместе и адаптированы друг к другу в форме «продолжительного динамического равновесия» [Blaser M.J., Atherton J.C., 2004]. Взаимоотношения H.pylori и человека парадоксальны, поскольку их нельзя назвать ни
паразитизмом, ни комменсализмом, ни симбиозом [Blaser M.J., 1997а]. Присутствие H.pylori не всегда подразумевает наличие болезни. Далеко не у всех носителей H.pylori обнаруживают язву двенадцатиперстной кишки или рак желудка, а серьезные заболевания могут быть и у людей, не имеющих H.pylori [Axon А., 1999]. В таблицах 3 и 4 приведены данные о частоте встречаемости этих микроорганизмов у бессимптомных добровольцев и у больных различными желудочно-кишечными заболеваниями.
Есть данные о том, что H.pylori может являться возможной причиной железодефицитной анемии, особенно у подростков [Choe Y.H. et al., 1999; Choe Y.H. et al., 2003; Milman N. Et al., 1998]. Ha больших группах взрослых людей [Milman N. Et al., 1998] и подростков от 10 до 18 лет [Choe Y.H. et al., 1999; Choe Y.H. et al., 2003] авторами показано, что носительство H.pylori коррелирует с пониженным уровнем сывороточного ферритина и гемоглобина. Известно, что в цитоплазме клеток хеликобактера ферритин депонируется в высоких концентрациях на случай лимитирования железа в среде обитания [Waidner В. et al., 2002]. Некоторые исследователи, однако, полагают, что Н pylori лишь усугубляет железодефицитную анемию, но отнюдь не является причиной ее возникновения [Cuoco L. et al., 2000].
Успешное удаление H.pylori зачастую приводит к излечению гастрита, язвенной болезни и большинства случаев легкой формы MALT лимфомы желудка. Однако лечение хеликобактериоза не облегчает состояние больных с неязвенной диспепсией [Blum A.L. et al., 1998; Talley N.J. et al., 1999a; Talley N.J. et al., 1999b; Pantoflickova D. et al., 2000], и значение такого лечения в профилактике рака желудка остается невыясненным [Cheli R. et al., 1998; Farinati F. et al., 1998]. Отсюда следует, что не связанные с H.pylori факторы, например, состояние макроорганизма или окружающей среды, имеют значение для развития болезни.
Разработка количественного метода определения уреазной активности биоптатов слизистой оболочки желудка и суспензий клеток H.pylori
На протяжении всего периода работы исследован 51 биоптат. Свежевыделенные штаммы были идентифицированы по совокупности тестов как Helicobacter pylori и обладали следующими одинаковыми признаками: грамотрицательные извитые подвижные палочки длиной 1.5-5.0 мкм, положительные в оксидазном, каталазном и уреазном тестах. Штаммы сохраняются в 20% растворе глицерина в дистиллированной воде при -30 С или в сахарозо-желатиновой среде в лиофилизованном или замороженном состоянии. Таким образом, создана лабораторная коллекция, состоящая из 30 клинических штаммов Н. pylori с порядковыми номерами №1, №2, №3 и т.д.
Видовая принадлежность штамма № 2 подтверждена путем тестирования по 23 признакам, заложенным в коммерческую тест-систему "ApiCampy".
Известно 3 основных метода количественного определения активности уреазы:
1. Колориметрический метод, основанный на измерении количества образующегося аммиака с помощью реактива Несслера [Sumner J.B. et al.,1953].
2. Титриметрический метод, заключающийся в определении расхода соляной кислоты, необходимой для нейтрализации аммиака [Юодвальките С.-Д.Ю., 1983].
3. Метод, который основан на измерении рН, меняющегося в результате выделения аммиака при гидролизе мочевины, в незабуференной реакционной смеси [M.-Plaza J., R.-Herrera J., 1967].
Прототипом нашего метода явился 3-й метод. Модификация заключалась в использовании метода не только для суспензий клеток, но и для биопсийного материала, что потребовало 10-кратного уменьшения объема реакционной смеси за счет использования портативного рН-метра. В пробирку, содержащую 1.5 мл незабуференного физиологического раствора (рН 6.9 ± 0.1), помещали биоптат и погружали электрод рН-метра (Piccolo-2, фирма Наппа) диаметром 12 мм. Пробирку термостатировали при 37С 10-15 минут, после чего дважды измеряли величину рН с интервалом 10 минут, не вынимая пробирку из термостата, но перемешивая реакционную смесь. При этом значения рН регистрировали как исходные (7.0 ± 0.2). Затем в пробирку добавляли 80 мкл раствора мочевины (конечная концентрация 600 мкг/мл) и сразу измеряли рН. Измерения проводили каждые 1-Ю минут (в зависимости от активности) в течение 10-40 минут, после чего биоптат взвешивали. На рис.1 представлены типичные кривые изменения рН во времени, отражающие уреазную активность биоптатов. Активность уреазы рассчитывали как начальную линейную скорость изменения рН: разность значений рН, взятых в начале и в конце прямолинейного отрезка кривой, относили к массе биоптата и ко времени. Величину уреазной активности выражали в АрН/ час х мг биоптата.
С помощью количественного метода было показано носительство Н. pylori в группе из 49 больных язвенной болезнью в 87.7% случаев, а с помощью качественного - в 73.1% случаев. Можно утверждать, что количественный метод более чувствителен, чем качественный, поскольку даже при очень низкой активности (пологая кривая зависимости величины рН от времени) в течение 1 часа можно с уверенностью констатировать наличие уреазы, тогда как при качественном тесте необходимо значительное изменение величины рН (и, соответственно, время), чтобы краситель феноловый красный поменял цвет с желтого на малиновый.
Данным методом оценивали уреазную активность культур H.pylori, выращенных на кровяном агаре. Для измерения использовали суспензии клеток, дважды отмытых физиологическим раствором. В пробирку, содержащую 1,5 мл незабуференного физиологического раствора вносили аликвоту суспензии клеток К pylori, содержащую 2-15 мкг белка в 5-20 мкл, и мочевину (см. выше).
Влияние концентрации лошадиного гемоглобина на рост H.pylori
Одним из методов обнаружения H.pylori является определение уровня специфических антител в сыворотке крови. За рубежом создан ряд коммерческих препаратов для иммунной диагностики, основанных на использовании антигенных комплексов H.pylori. Одной из задач данного исследования является отработка метода получения подобного антигенного комплекса и определение возможности его использования в диагностических целях.
Нами получено три антигенсодержащих препарата: препарат I -из клеток H.pylori, выращенных на плотной полноценной среде с кровью; препарат II - из клеток H.pylori, выращенных в жидкой синтетической среде; препарат III - из культуральной жидкости, взятой после выращивания H.pylori в жидкой синтетической среде.
Для получения антигенсодержащего препарата клетки H.pylori (штамм № 2), выращенные на 4 чашках Петри диаметром 90 мм на плотной среде Columbia с кровью в течение 4 суток, собирали, промывали физраствором, центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин и осадок суспендировали в 1 мл дистиллированной воды. Суспензию озвучивали 40 мин с частотой 50 Гц при температуре 10-15 градусов, после чего вновь центрифугировали 20 минут с той же угловой скоростью. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0.2 мкм, лиофилизировали и использовали для иммунологических исследований.
Аналогично обрабатывали осадки клеток H.pylori (выращенных во флаконах с синтетической средой), полученные путем центрифугирования при 6000 об/мин. Культуральные лиофилизировали для последующего изучения.
Проведено исследование полученных антигенных препаратов методом иммуноблоттинга с сыворотками крови больных язвенной болезнью. Из имеющихся в наличии сывороток были выбраны 17 сывороток больных, у которых обнаруживали H.pylori. Данные сыворотки изучили с препаратом I, полученным из культуры H.pylori, выращенной на плотной среде. Как видно на рис. 12, разные сыворотки содержат различное количество антител к белкам этого препарата. Далее, выбрали сыворотки № 11, 12, 31 и «Оля» (ОС), содержащие антитела к максимальному числу антигенов. Сыворотка «Оля» (ОС) -положительная сыворотка, проверенная с импортным препаратом "ИммуноХром-анти HP-Экспресс" на наличие антител к H.pylori.
Все данные сыворотки исследовали на наличие антител к препарату, полученному из клеток H.pylori, выращенных на синтетической среде (рис. 13), и к препарату из культуральной жидкости, взятой после выращивания на синтетической среде (рис. 14). Можно заметить, что количество треков на рис. 13 (и белков, соответственно) снизилось по сравнению с первым препаратом (рис.12). При сравнении второго и третьего препаратов можно наблюдать заметное уменьшение количества антигенных белков. Исследовали также зависимость количества антигенных белков от фазы роста на синтетической среде. Из таблицы 12 видно, что их количество разное.
Мы посчитали целесообразным проверить препарат лошадиного гемоглобина на наличие антигенных белков с теми же сыворотками (рис. 15). Оказалось, что данный препарат не содержит антигенных белков. На основании данных иммуноблоттинга для наиболее сыворотки № 31, содержащей антитела к наибольшему числу белков, рассчитали мол.массы антигенных белков в трех изучаемых препаратах из Hpylori. В таблице 12 представлены результаты расчета. Таким образом, можно заключить, что: - все препараты, кроме гемоглобина, содержат антигенные белки, а все сыворотки содержат антитела к белкам из Hpylori; - препарат I, полученный из клеток, выращенных на полноценной среде, содержит минимум 39 антигенных белков, - препарат II, полученный из клеток, выращенных на синтетической среде до фазы замедления роста, содержат 15 антигенных белков; а до стационарной фазы - 13 антигенных белков; - препарат III из культуральной жидкости после выращивания Hpylori на синтетической среде содержат 9 антигенных белков независимо от фазы роста, причем 3 из них по молекулярной массе соответствуют специфическим антигенам Hpylori: UreB-66 кДа; NapA - 26 кДа; FldA - 19 кДа.
