Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Метод криоскалывания в исследовании биологических мембран 9
1.1.1. Методологические проблемы криоскалывания 9
1 1.2. Интерпретация изображений сколов биологичес ких мембран 13
1.2. Структурная организация и топография мембран микросом печени 27
1.2.1. Структура микросомальных мембран 28
1.2.2. Поперечная топография микросомальных мембран 31
1.2.3. Продольная топография микросомальных мембран 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Электронная микроскопия 43
2.2. Препаративные методы 44
2.3. Аналитические методы 46
2.4. Солюбилизация и реконструкция мембран 50
2.5. Методы физического и химического воздействия на мембраны 52
Глава 3. Результаты исследований 56
3.1. Формирование ВМЧ в искусственных мембранах 56
3.1.1. Полиморфные превращения кардиолипина и смеси кардиолипин:лецитин в присутствии двухвалентных катионов 56
3.1.2. Влияние ионов Са^+ на морфологию мембран из N-ацетилфосфатидилэтаналамина 64
3.1.3. Участие периферических белков в формировании ВМЧ 67
3.2. Формирование ВМЧ в тенях микросомальных мембран печени 79
3.2.1. Ультраструктурная характеристика теней микросомальных мембран 79
3.2.2. Формирование ВМЧ в тенях микросом с изменённым химическим составом 81
3.2.2.а. Индукция синтеза цитохрома Р-450 ксенобиотиками 81
3.2.2.6. Изменения ультраструктуры мембран при обработке гидролитическими ферментами 87
3.2.3. Самосборка и реконструкция "теней" микросом 94-
3.2.3.а. Самосборка микросомальных мембран после солюби-лизации детергентами 94-
3.2.3.6. Ультрафрагментация микросомальных мембран и реконструкция мембранных фрагментов 105
3.2.3.в. Реконструкция отдельных компонентов микросомальных мембран 118
Глава 4. Обсуждение результатов 122
Выводы 131
Список литературы 133
- Интерпретация изображений сколов биологичес ких мембран
- Поперечная топография микросомальных мембран
- Влияние ионов Са^+ на морфологию мембран из N-ацетилфосфатидилэтаналамина
- Изменения ультраструктуры мембран при обработке гидролитическими ферментами
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение ультраструктурной организации биологических объектов вообще и мембран в частности связано с рядом трудностей, которые возникают при интерпретации изображений, получаемых различными методами электронной микроскопии. Эти трудности связаны с тем, что биологические объекты прозрачны для электронного луча и исследователь в большинстве случаев наблюдает не сами объекты, а обусловленное ими перераспределение атомов тяжелых металлов.
В последние два десятилетия в практике исследования ультраструктурной организации модельных и биологических мембран все большее место занимает метод криоскалывания, позволяющий наблюдать металлические реплики, полученные с поверхности скола замороженных тканей, клеток или изолированных мембран /98,99,116/. Главное достоинство этого метода заключается в том, что исследуемый объект фиксируется замораживанием со скоростью охлаждения в несколько тысяч градусов в секунду до температуры жидкого азота [-196С /, в следствии чего он не подвергается значительншл изменениям, обычно возникающим при любых других способах фиксации /65,95,152/. Кроме того, этот метод позволяет наблюдать довольно обширные мембранные поверхности, причем наиболее распространенным элементом рельефа сколов мембран являются внутримембранные частицы /ВМЧ/, /116/.
Не будет преувеличением сказать, что значительная часть работ, посвященных исследованию ультраструктурной организации мембран, в той или иной мере использует метод криоскалывания, причем главное внимание уделяется наблюдению структуры, размеров и распределения ВМЧ. Однако до настоящего времени нет единого мнения о природе, механизмах и условиях формирования ВМЧ. Более того, по мере изучения структуры мембран наши представления о природе частиц все более усложнялись и в настоящее время мы вынуждены признать,.что вряд ли нам удастся создать единую теорию происхождения ВМЧ, поскольку существуют частицы частиц различного происхождения. Так, большинствбУиндупируется присутствием определенных белков. Однако они могут появляться в мембранах, не содержащих белка, но характеризующихся специфическим липидным составом /145,146/. Кроме того, частицы аналогичные ВМЧ могут возникать также в качестве артефакта при неблагоприятных условиях вакуума /72,73,133/.
Выяснение вопросов происхождения ВМЧ, а также их связи с проявлением тех или иных функций мембран являются важными задачами современной мембранологии, от решения которых зависит не только адекватность наших представлений о пространственной организации мембран, но раскрытие механизмов их функционирования.
Яель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является решение проблемы интерпретации электронно-микроскопических изображений, получаемых методом криоскалывания и, прежде всего, выяснение природы и происхождения ВМЧ .в определенных модельных и клеточных мембранах. В качестве основного объекта исследования в работе были использованы мембраны эндоплазматического ретикулума клеток печени /микро-сомы/, а также некоторые искусственные мембраны. Выбор мембран эндоплазматического ретикулума клеток печени обусловлен не только важностью происходящих в них процессов, таких как метаболизм ксенобиотиков и эндогенных ^субстратов > но также наличием в литературе сведений о топографии этих мембран, что облегчает соотнесение их ультраструктурных и топографических характеристик /4,5,60,61/. Исследование искусственных мембран было необходимо для выяснения таких вопросов, как участие некоторых водорастворимых агентов в формировании ВМЧ.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Выяснить механизмы образования ВМЧ в модельных мембранах при образовании комплексов фосфолипидов /кардиолипин, лецитин, /\/-ацетилкефалин/, с двухвалентньми катионами /Са , Mn , Mq и т.д.] и водорастворимым белком цитохромом с.
Определить участие различных компонентов микросомаль-ных мембран печени в формировании ВМЧ в таких условиях, как : а/ самосборка микросомальных мембран после их солюбилиза-ции детергентами; б/ встраивание в фосфолипидный бислой протеолипидных комплексов, полученных в результате ультрафрагментации микросомальных мембран; в/ встраивание в фосфолипидный бислой очищенных интегральных белков микросомальных мембран /цитохромов Ьс и Р-450У; г/ индукция синтеза In vivo цитохрома Р-450; д/ удаление периферических компонентов микросомальных мембран обработкой гидролитическими ферментами.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе экспериметально доказано, что'липидные частицы"в модельных мембранах возникают в результате изменения геометрии липидного бислоя в местах слияния смежных мембран. На примере цитохрома с впервые показано каким образом периферические белки в процессе перекисного окисления и образования высокомолекулярных комплексов способны индуцировать появление ВМЧ на гидрофобной поверхности скола.
В работе проведен анализ факторов, отвественных за формирование рельефа гидрофобной поверхности скола мембран микросом печени. Проведена серия экспериментов, доказывающих участие цитохромов Ьц и Р-450 в формировании ВМЛ. В то же время, показано, что появление ВМ в реконструированных микросомальных мембранах не связано с восстановлением таких функциональных характеристик монооксигеназной системы микросом, как нативность цитохромов bg и Р-450, способность окислять различные субстраты и связано, прежде всего, с концентрациями этих белков в реконструированной мембране.
Обнаружено явление ультрафрагментации биологических мембран. Показано, что образующиеся в результате ультрафрагментации протеолипидные комплексы являются факторами, ответственными за формирование ВМЧ в микросомальных мембранах.
Разработан метод ультрафрагментации биологических мембран, а также создана оригинальная конструкция дезинтегратора, специально предназначенного для повышения выхода фрагментированных мембран при сохранении нативности белков. Метод может быть применен в биохимических исследованиях мембран различного происхождения.
Интерпретация изображений сколов биологичес ких мембран
Метод криоскалывания позволяет исследовать обширные мембранные поверхности, характеризующиеся определенной топографией и динамикой структурных изменений. Для правильной интерпретации полученных изображений необходимы знания механизмов раскалывания мембран и формирования рельефа.
В 1966 году Д.Брайтон, исследуя сколы мембран корешков лука до и после экстракции липидов, пришел к выводу, что скол проходит по гидрофобной области мембраны. В последствии Д.Брайтон с соавторами провел серию работ, доказывающих правильность этой гипотезы /45,47/. Среди них,прежде всего, следует упомянуть эксперимент по раскалыванию искусственной мембраны из меченной по С стеариновой кислоты, вмороженной между двумя стеклянными поверхностями. После раскалывания метку можно было обнаружить на обеих поверхностях стекла. Заслуживает внимания также эксперимент с тенями эритроцитов, меченными на поверхности ферритином. В этой работе также показано, что молекулы ферритина обнаруживаются только после травления, т.е. только после обнажения истинной поверхности мембран. На поверхности скола мембраны ферритиновых частиц обнаружить не удавалось.
Недавно Ф.С.Шёстрандом был проведен подробный анализ всех перечисленных выше экспериментов /125/. Справедливо ссылаясь на методические трудности интерпретации электронно-микроскопического изображения, автор пытается убедить нас в том, что все эти работы не достаточны для доказательства раскалывания мембраны в гидрофобной области. Далее автор приводит примеры сколов таких сложных мембранных систем, как диски наружных сегментов фоторецепторных клеток и внутренние мембраны митохондрий. В обоих случаях Шёстранд пытается доказать, что скол может проходить по истинной поверхности мембраны. Эта работа не кажется нагл убедительной, поскольку изучение топографии таких сложных складчатых мембран чрезвычайно затруднительно. В то же время,доказательством правильности гипотезы Д.Брайтона являются не отдельные эксперименты, а огромная совокупность работ по криоскалыванию различных объектов.
Мы можем привести следующие аргументы в пользу гипотезы Д.Брайтона : 1. Раскалывание мембран различного происхождения всегда позволяет обнаружить только две морфологически различных поверхности, а не четыре. Следовательно, скол не может проходить по гидрофильным поверхностям мембраны. /Рисі/. 2. При обработке мембран протеолитическими ферментами частицы не исчезают, а перераспределяются симметрично на обе поверхности скола /25,154/. Поскольку известно, что большинство частиц связано с присутствием в мембране белков, а в результате протеолиза поверхностные белки удаляются, скол, проходящий по поверхности мембраны, не обнаруживал бы частиц вообще. 3. Частицы появляются на поверхности скола мембран, содержащих белки с выраженными гидрофобными свойствами, водорастворимые белки в большинстве известных случаев не участвуют в формировании ВМЧ /47,58,116,123/. 4. Детальный анализ поверхности скола сетчатки и внутренних мембран митохондрий позволяет описать топографию скола в соответствии с гипотезой Д.Брайтона /58,119/. Всеобщее признание гипотезы Д.Брайтона было закреплено в международной номенклатуре сколов мембран - принятой в 1975г. /46/. В соответствии с номенклатурой, гидрофобную поверхность расщепленной мембраны,-прилежащую к цитоплазме, необходимо обозначать буквами PF , а комплементарную ей поверхность, прилежащую к экстраклеточному пространству, - буквами EF . Гидрофильные поверхности, обнажающиеся после травления мембраны, -- PS и ES для цитоплазматической и экстраклеточной поверхностей соответственно. Как можно заметить, некоторые из приведенных нами аргументов в пользу гипотезы Д.Брайтона основаны на предположении о белковой природе;_;ВМЧ. Однако вопрос о природе ВМЧ до настоящего времени нельзя считать полностью решенным. В настоящее время существуют следующие методы решения этой проблемы : 1. Создание модельных и искусственных мембран с различным белковым и липидным составом. 2. Изменение белкового и липидного состава мембран путем воздействия различными агентами /например, литическими ферментами или агентами, изменяющими биосинтез определенных компонентов мембраны/;
Поперечная топография микросомальных мембран
Для изучения поперечной топографии микросомальных мембран немаловажным является тот факт, что большинство микросомальных пузырьков вывернуто цитоплазматической поверхностью наружу» К сожалению, получить обратную ориентацию мембран до сих пор не удавалось. Микросомальные мембраны непроницаемы для различных заряженых молекул и таких макромолекул, как протео- и липолити-ческие ферменты /101/, что обычно используется исследователями для изучения их поперечной топографии. В таблице I представ- а также лены данные о топографии некоторых белковуметоды, с помощью которых они были получены /61/. Однако, эти данные требуют дальнейшего уточнения, поскольку о топографии даже наиболее хорошо изученных белков, таких как питохромы Ь5» Р-450 и их дегидро-геназы до сих пор нет единого мнения. Так, по мнению некоторых исследователей, не вызывает сомнения локализация цитохрома g на внешней поверхности мембраны /15/. Об этом свидетельствует его доступность протеолитическим ферментам и акцепторам электронов. Наблюдения под электронным микроскопом, меченных ферри-тином антител к этому белку также свидетельствуют о его поверхностной локализации /112,113/. Однако в отношении локализации НАДЕНЇЇІ.. мнения довольно противоречивы.
В пользу локализации этого флавопротедда на внешней поверхности мембраннного пузырька свидетельствуют данные о его доступности протеолитическим ферментам, в то же время,по характеру его взаимодействия с НАДН можно прийти к выводу о его локализации на внутренней стороне /15/: Наибольшие трудности вызывает определение локализации ци-тохрома Р-450. Несомненно, что часть молекул этого белка экспонирована на цитоплазматическую поверхность мембраны. Об этом свидетельствуют, прежде всего, данные о его доступности для меченных ферритином антител. Однако не все молекулы цитохрома доступны действию протеолитических ферментов. Возможно, что часть молекул экспонировала на внутреннюю поверхность пузырька, а часть погружена вглубь мембраны и остается полностью недоступной действию протеаз /51,52/ Возможно, что различная локализация характерна разным формам цитохрома Р-450. Так, имеются данные о локализации фенобарбитал-иццуцируемой формы цитохрома Р-450 на цитоплазматической стороне мембраны /150/, причем,.эта форма цитохрома представлена четырьмя различными пептидами с различной доступностью для протеаз /147/.
Данные о доступности НАДФН-ФП для антител,меченных ферритином /82/, также недостаточны для утверждения о локализации всех молекул-этого белка на цитоплазматической поверхности мембранных пузырьков, поскольку протеолиз свидетельствует о том, что часть молекул может быть экспонирована на внутреннюю поверхность /51/. Исследование поперечной топографии фосфолипидов микросом также связано с определенными трудностями. Микросомальные мембраны характеризуются довольно большим набором различных липи-дов /4/, среди которых фосфолипиды составляют 85%. В расчете на фосфор, фосфатидилхолин составляет 61$, фосфатидилэтаноламин- - 26$, фосфатщшлинозит - 10$, фосфатидилсерин - 8,5%, сфинго-миелин - 5,8$; необходимо отметить сравнительно высокое содержание лизофосфатидилхолина - 4,7$. Нейтральные жиры составляют 15$ от общего содержания липидов. Они представлены холестерином - 38$, триглицеридами - 48$, свободными жирными кислотами - 40$ и эфирами холестерина - 10$. Одним из наиболее распространенных методов изучения поперечной топографии фосфолшшдов является использование фосфоли-паз. Результаты анализа топографии с использованием фосфолипазы А2 /61/ свидетельствуют о том, что на цитоплазматическои стороне находится фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин, а на лю-миналыюй- сфингомиелин и фосфатидилинозитол. Фосфатидилхолин распределен равномерно на обеих поверхностях. Следует отметить аналогичную картину распределения фосфолипвдов в мембранах лизо-сом, аппарата Гольджи, и внутренних митохондриальных мембранах, полученную тем же методом /61/. Однако было показано, что за 30 минут фосфолипид-обменивающие белки способны заменить на 80-85$ фосфолипиды микросом на меченные фосфолипиды, выделенные из тех же мембран, из чего можно предположить, что быстро обмениваются фосфолипиды как внешнего, так и внутреннего монослоев "мембраны. При этом, асимметрия фосфолшшдов, определяемая с использованием фосфолипазы С, практически не изменяется /76/. Следовательно, либо различная доступность фосфолшшдов для фос-фолипаз свидетельствует не об асимметрии микросомальных мембран, а о каких-то других параметрах бислоя, либо асимметрия фосфолшшдов является динамическим параметром, сохраняющимся наряду с быстрым обменом фосфолшшдов между монослоями.
Влияние ионов Са^+ на морфологию мембран из N-ацетилфосфатидилэтаналамина
Из преведенных в предыдущем разделе экспериментов по влиянию двухвалентных катионов на морфологию мембран из кардиоли-пина и лецитина очевидно, что липидные частицы морфологически существенно отличаются от ВМЧ клеточных мембран. Так, липидные частицы характеризуются более крупными размерами, они часто или имеют воронковиднук кратерообразную форму, а на комплементарной поверхности скола таким частицам соответствуют впадины, что свидетельствует о наличии изогнутостей бислоя.
Возникает вопрос, могут ли в фосфолипидных мембранах возникать частицы более похожие на ВМЧ клеточных мембран, имеющие глобулярную форму, и характеризующиеся отсутствием комплементарных впадин и близкими к ВМЧ размерами?
Частицы, отвечающие почти всем этим требованиям, были обнаружены нами в мембранах из N -ацетилфосфатидилэтаноламина [ N - ацетилкефалина/ в присутствии- ионов Са . Как видно из ри-сунка 9А, этот липид в отсутствии ионов Са образует многослойные липосомы с гладкой поверхностью скола. Добавление к фос-фолипиду эквимолярных количеств ионов Са т приводит к появлению на поверхности скола частиц глобулярной формы /рис.9 БJ. Такие частицы, однако, мельче обычных ВМЧ и поэтому харошо видны только при благоприятных углах оттенения мембран платиново-уг-леродной смесью. Частицы располагаются на обеих сторонах скола мембраны и не имеют комплементарных впадин, что делает их чрезвычайно похожими на ВМЧ клеточных мембран. Сходство увеличивается ещё в связи с тем, что эти частицы , возможно, способны к латеральной диффузии и"вымораживанию" в плоскости мембраны. К такому предположению можно прийти на основании того, что по характеру распределения частиц в плоскости мембраны мы можем выделить две фазы. В одной фазе частицы располагаются хаотически, а в другой - склонны к агрегации и образуют характерный сетчатый рисунок, при этом часто видна резкая граница, разделяющая обе фазы /рис.9 Г7, что напоминает перераспределение ВМЧ в клеточных мембранах при температуре ниже фазового перехода фосфолипидов /явление "вымораживания !/
Не исключено, однако, что, аналогично липидным частицам в мембранах из кардиолипина и лецитина, обнаруженные нами частицы возникают в местах контактов между мембранами в многослойной ли-посоме, поскольку в некоторых случаях удаётся наблюдать, как сетчатый рисунок, образуемый частицами на поверхности скола одной мембраны, точно повторяет рисунок на поверхности скола соседних мембран и является его продолжением /рис.9 Б-В7. Этот факт свидетельствует о взаимодействии смежных мембран.
Обнаруженное нами разнообразие фаз: наличие гладкого би-слоя и частиц, способных располагаться как случайно, так и в виде сетчатого рисунка, вызывает некоторое удивление, поскольку мы имеем дело с химически однородным фосфолипидом. Такой полиморфизм в поведении даже чистых фосфолипидов указывает на необходимость чрезвычайной осторожности при интерпретации рельефа ско По общепринятым представлениям, ВМЧ в биологических мембранах возникают в присутствии гидрофобных белков, располагающихся трансмембранно, либо погружённых в гидрофобную область мембраны. Однако в последнее время появились сообщения об участии в формировании ВМЧ также периферических белков, например, цитохрома с /59,88/. Напротив, в нашей лаборатории было показано, что цитохром с при реконструкции в фосфолипидный бислой, содержащий кислые фосфолипиды /лецитин и фосфатидная кислота, или липиды из мембран митохондрий/, не индуцируют образование ВМЧ. Более того, даже при реконструкции этого белка после растворения про-теолипидных комплексов в изооктане, когда степень гидрофобных взаимодействий существенно возрастала, ВМЧ не индуцировались Поскольку данный вопрос имеет принципиальное значение для понимания механизмов формирования ВМЧ, мы посчитали необходимым провести более детальные исследования этого процесса.
Цитохром с небольшой /М.В. 12 00Q7, практически сферический /радиус 12-14 7, сильно основной /8 положительных зарядов при нейтральном рН7, водорастворимый белок. Ранее было показано, что цитохром с при инкубации с липосомами, сформированными из кардиолипина, образует протеолипидные комплексы с молярным отношением 1:43 /59/. В наших экспериментах,при определении методом гель-фильтрации, в липопротеиновых комплексах молярное отношение белок:липид составляло 1:44. Для проверки специфичности взаимодействия цитохрома с с кардиолипином нами была использована смесь кардиолипина и тионфосфатидилхолина / тион-ФХ7. Химический сдвиг в спектрах Р-ЯМР тион-ФХ составляет 56 м.д. В спектре неозвученной водной дисперсии кардиолипина и тион-ФХ при молярном отношении I : 4 наблюдаются раздельные сигналы двух липидов и, как видно из рисунка 10 А, обе кривые имеют форму сигналов, соответствующую бислойной организации фосфо-липидов. При добавлении в смесь этих липидов цитохрома о проис-ходит формирование комплексов, при этом в спектрах Р-ЯМР регистрируется нарушение бислойной организации только кардиолипина, тогда как сигнал тион-ФХ остаётся без изменений. На фоне сигнала кардиолипина появляется узкий изотропный сигнал /рис.10 В/. На основании изложенных экспериментальных данных мы сделали вывод, что взаимодействие цитохрома с осуществляется только с кардиолипином. Поэтому, в данной работе мы исследовали эффект взаимодействия цитохрома с с липосомами, состоящими только из кардиолипина. Было показано, что при формировании липолротеино-вых комплексов из цитохрома о и кардиолипина происходит изменение упаковки этого липида в мембранах: на фоне широкого сигнала с анизотропией химического сдвига, равной 40 м.д. и плечом, направленным в сторону слабого поля, появляется узкий сигнал, отвечающий фракции липидных молекул, двигающихся изотропно /рис. ПА,В7. При этом выяснено, что появление"изотропного" сигнала зависит от степени окисленности кардиолипина и интенсивность этого сигнала растёт с увеличением времени инкубации суспензии при 37С /рис.11 В,Q7. Примерно через 24 часа инкубации спектр ХР-ЯМР уже представляет собой узкий симметричный "изотропный" сигнал /рис. II Д7.
Изменения ультраструктуры мембран при обработке гидролитическими ферментами
Изучение изменений ультраструктуры мембран в результате обработки протео- и липолитическими ферментами не лишено определённых недостатков, о которых было сказано в обзоре литературы, однако это один из наиболее простых и распространённых методов, дающих существенную информацию о структурной организации биологических мембран. Несомненно, что обработка мембран низкими концентрациями протеолитического фермента приводит к солюбилизации белков, находящихся на поверхности мембранного пузырька. Однако увеличение концентрации протеолитического фермента, особенно при добавлении липолитических ферментов, может приводить к разрушению мембранного пузырька и проникновению фермента на его внутреннюю поверхность. Представляет интерес проследить динамику солюбилизации мембранных белков при одновременном анализе изменений морфологии скола мембраны.
В качестве протеолитического фермента была выбрана неспецифическая протеаза К из Jr Air&cWmm dhum , обладающая приблизительно в б раз большей активностью, чем обычно используемая про-наза из Ь , gmea . Объектом исследования служили"тенип микросомальных пузырьков. На рис. 22 приведены данные по титрованию мембран "теней" микросомальных пузырьков возрастающими концентрациями протеазы К. При увеличении концентрации протеолити-ческого фермента с 0,25 до I мкг/мг белка теней содержание белка в мембранах падает до 65% от исходного уровня. Дальнейшее увеличение концентрации протеазы К до 10 мкг/мг белка не приводит к дополнительной солюбилизации-.мембранных белков. При этих концентрациях протеазы К липиды мембраны, по-видимому, защищают оставшиеся белки от действия фермента. При увеличении концентрации протеазы от 10 до 40 мкг на мг белка наблюдается дополнительная солюбилизация мембранных белков до 50% от исходного со, -держания, что объясняется, по-видимому, частичным нарушением ли-пидного бислоя. При концентрациях от 40 до 100 мкг/мг белка наблюдается второе плато: в области этих концентраций не происходит дальнейшей солюбилизации мембранных белков. В результате действия протеазы К часть белков теряет связь с мембраной и обнаруживается в надосадочной жидкости. На основании полученных резуль татов можно прийти к выводу, что около 35% всех мембранных белков атакуется низкими концентрациями протеазы К. Ещё 15% белков может быть атаковано высокими концентрациями фермента. Примерно половина микросомальных белков остаётся недоступной действию протеазы. На фоне значительной солюбилизации белков микросо-мальной мембраны под действием протеазы К содержание фосфолипида не изменяется вплоть до концентрации фермента равной 100 мкг/мг белка /рис.227. Следовательно, эндогенная фосфолипазная активность мембран и фосфолипазные загрязнения в препарате протеазы незначительны.
Если провести предварительный гидролиз фосфолипидов фосфо-липазой А2,то последующая обработка протеазой К /Ї00 мкг/мг белка/ солюбилизирует 80% мембранного белка вместо 50% в интактных мембранах. Можно думать, что оставшиеся 20$ белка либо относятся к классу белков, не атакуемых данным протеолитическим ферментом, либо продолжают оставаться экранированными от про-теазной атаки продуктами лизиса фосфолипидов.
Особый интерес для выяснения участия белков в формировании рельефа скола представляет анализ атакуемости отдельных белков протеазой К. Такой анализ мы провели для белков-переносчиков электронов, которые, как было указано в обзоре литературы, являются претендентами на участие в формировании ВМЧ.
Результаты, представленные на рис. 23, сведетельствуют о том, что при низких концентрациях протеазы /до I мкг/мг белка/ практически полностью инактивируется два фермента: НАДФН-ФП /кривая I на рис 237 и цитохром Ь /кривая 27. В то же время НАДН-ФП /кривая 37 и цитохром Р-450 /кривая 4/ остаются в мембране. При высоких концентрациях протеазы цитохром Р-450 переходит в свою неактивную форму - цитохром Р-4-20 /кривая Ъ] но остаётся в мембране.
Полученные данные по инактивирующему действию протеазы К на цитохром Ь и НАДФН-ФП не противоречат имеющимся в литературе. Сложнее обстоит дело с цитохромом Р-4-50. На основании полученных результатов цитохром Р-450 может быть отнесён к белкам, расположенным в глубине мембраны так, что часть его молекулы выходит на поверхность и доступна для протеазной атаки, благодаря чему наблюдается инактивация этого белка при относительно низких концентрациях протеолитического фермента. Сама же молекула цитохрома Р-4-50 прочно встроена в мембрану и экранирована фосфолипидами от протеазной атаки. Расчёты показали, что цитохром Р-420 составляет около 40$ мембранного белка, не атакуемого протеазой К после фосфолипазной обработки.
Электрофоретический анализ белкового состава микросомаль-ных мембран, обработанных различными концентрациями протеазы К, представлен на рис.24. Видно, что при низких концентрациях протеазы /до I мкг/мг белка7 происходит уменьшение числа белковых фракций с 13 в исходных тенях /рис.24а/ до 7 при обработке протеазой /рис.2467. Начиная с концентрации протеазы 10 мкг/мг белка и выше,отмечалось наличие всего двух фракций с молекулярным весом 40 000 и не более 20 000/рис.24в7. Первая из них может быть цитохромом Р-420, вторая представлена продуктами протеолиза , кроме того, в её состав входит сама протеаза, имеющая молекулярный вес 20 000. Основной вклад в эту фракцию вносят, вероятно, продукты протеолиза, представленные исключительно гидрофобными полипептидами, поскольку дополнительные промывки препарата с целью удаления сорбированной протеазы не уменьшали фракцию белков с молекулярным весом около 20 000. Предварительная обработка теней фосфолипазой Ар не изменяла соотношение обеих фракций белков.
