Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Изучение поступательной диффузии молекул в мембранах 12
2. Применение триплетних меток и зондов в биологических исследованиях 32
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. Основные реактивы 41
2. Регистрация кинетики затухания замедленной люминесценции 44
3. Липосомы и биологические мембраны 46
4. Встраивание зондов и меток в мембраны . . 48
5. Удаление кислорода из исследуемых растворов. 49
6. Обработка и интерпретация экспериментальных результатов по кинетике тушения триплетних зондов в мембранах 51
Глава III. ВЫБОР МЕМБРАННЫХ ТРИШШТБЫХ ЗОНДОВ
I. Фосфоресцентные зонды 58
2. Зонды испускающие аннигиляционную замедленную флуоресценцию 63
Глава ІV, ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН
I. Зонды - тушители триплетних молекул 74
2. Исследование локализации эритрозина в липо-
сомах из яичного лецитина 75
3. Изучение диффузионной подвижности молекул в
липосомах 77
4. Применение явления сенсибилизации замедленной флуоресценции для регистрации столкновений зондов в мембранах 85
Глава V. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ШЛБРАНВЫХ СИСТЕМ
I. Изучение локализации активного центра Са,Ма зависимой АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме . . . 92
2. Исследование структуры белков липидного матрикса мембраны саркоплазматического ретикулума 99
3. Изучение локализации хинонного кольца убихинона Q - 10 в липосомах из дипальмитоилфосфатидилхолшіа.
4. Изучение локализации гемовых групп цитохромов Р-450 и &5 в микросомальной мембране 117
5. Исследование межбелковых взаимодействий методом триплетных меток 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 135
ЛИТЕРАТУРА 137
- Изучение поступательной диффузии молекул в мембранах
- Регистрация кинетики затухания замедленной люминесценции
- Фосфоресцентные зонды
- Зонды - тушители триплетних молекул
- Изучение локализации активного центра Са,Ма зависимой АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме
Введение к работе
Важнейшая биологическая роль мембран в настоящее время общецризнана. С функционированием мембран связаны такие ключевые биологические процессы как фотосинтез, окислительное фосфорилирование, проведение нервного импульса и т.д.
Для изучения мембран разработано большое количество разнообразных физико-химических методов. Однако ввиду чрезвычайной сложности биомембран информация, получаемая традиционными методами, часто бывает недостаточной для понимания молекулярной природы биологических явлений. В связи с этим наряду с повышением точности и надежности известных экспериментальных подходов постоянно создаются принципиально новые биофизические методы, нередко основанные на результатах последних достижений фундаментальных физических исследований.
В последние годы широкое распространение в биологии получили методы физических меток и зондов, в первую очередь методы флуоресцентных и спиновых меток и зондов *'. й; По установившейся терминологии метками, в отличии от зондов, называют соединения, ковалентно присоединяемые к исследуемому объекту. При исследовании мембран разделение меток и зондов по этому признаку часто является условным. Поэтому в данной работе везде, кроме особо оговариваемых случаев, вместо "метки и зонды" использовали термин "зонды".
Методы зондов играют больщую роль в изучении структуры и свойств биологических мембран. Очень большое число работ посвящено изучению микровязкости мембран и подвижности отдельных молекул в мембранах путем исследования вращательной и поступательной диффузии спиновых и флуоресцентных зондов. Однако такие варианты метода зондов применимы, как правило, только к изучению сравнительно быстрых процессов, характерные времена которых соизмеримы с собственными характеристическими временами спиновых и флуоресцентных зондов. Время жизни возбужденного син-глетдого состояния флуоресцентных зондов обычно составляет 10~7*-10 сек /I/, время спин-спиновой релаксации яитроксильных радикалов, определяющее форму линии спектра ЭПР при стандартном о J[0 варианте метода ЭПР, в мембранах находится в пределах 10 -10 с. /2,3/. Таким образом исследование динамических процессов данны- ми методами ограничено диапазоном характерных времен 10 -10 с.
При изучении мембран часто возникают задачи связанные с регистрацией более медленных процессов, таких как, например,диффузия в жестких мембранах, вращательная диффузия белков в мембранах, медленные конформационные перестройки, столкновения диффундирующих белков и других мембранносвязанных компонентов. Одним из путей изучения сравнительно медленных процессов является применение в качестве зондов молекул хромофоров, возбужденных в триплетное состояние - так называемых триплетних зондов /4,5/. Время жизни триплетного состояния многих молекул в жидких растворителях составляет десятки миллисекунд, а в твердых матрицах достигает нескольких секунд /6/. Поэтому триплет-ные зонды могут быть удобным инструментом при исследовании про-цессов с характерными временами 10 - 10 с. Однако большое значение 1Г делает триплетные состояния очень чувствительными к тушащим примесям и в первую очередь к молекулярному кислороду. Чувствительность спектроскопических методов регистрации триплетних молекул обычно значительно ниже, чем широко распространенного метода флуоресценции. Трудности, связанные с применением спектроскопии триплетних состояний в мембранологии, по-видимому, являются причиной того, что основные работы в этой области посвящены методически наиболее простой задаче исследования вращательной диффузии мембранных белков. Работы, связанные с изучением поступательной диффузии с помощью триплетних зондов, в настоящее время практически отсутствуют. В тоже время данный подход может стать полезным дополнением к существующим методам исследования мембран. В принципе его можно использовать при решении следующих основных задач:
I. Изучение микровязкости и структуры мембран путем регистрации кинетики диффузиояно-контролируемых взаимодействий триплетних зондов.
Изучение кинетики диффузионннх взаимодействий с помощью спиновых и флуоресцентних зондов часто используется при исследовании микровязкости мембран. Однако для того, чтобн зарегистрировать эту кинетику на фоне коротких характеристических времен данннх типов зондов, в мембрану приходится вводить боль** шие количества взаимодействующих соединений. При этом их локаль- ные концентрации в мембранах достигают 10 ХМ и выше, что может нарушить нативную структуру мембраны. Применение триплетних зондов позволяет на несколько порядков снизить концентрацию в водимых веществ и практически исключает возможность повреждения мембран.
Анализ кинетики диффузионно-контролируемых процессов является также распространенным способом изучения структуры белково-липидной матрицы /1,2/. Однако из-за быстрой дезактивации возбужденных состояний спиновых и флуоресцентных зондов перемещения зондов за время жизни возбужденного состояния сравнительно малы. Даже для наиболее долгоживущего флуоресцентного зонда пи- рена среднеквадратичное смещение возбужденной молекулы в мембра- о нах составляет 20-40 А /I/. Это существенно ограничивает пространственные масштабы изучения структуры мембран с помощью флуоресцентных и спиновых зондов. С другой стороны существующие методы изучения макроскопических перемещений (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, фотокорреляционная спектроскопия, импульсный ЯМР в градиенте поля) позволяют регистрировать перемещения протяженностью не менее нескольких микрон и требуют жесткой фиксации мембраны. Поэтому данные методы применимы для исследования диффузии только в клеточных и в крупных модельных мембранах.Структуру мембран большинства внутриклеточных органелл и многочисленных мембранных систем, получаемых в виде небольших везикул, таким способом исследовать нельзя.
Как легко подсчитать, среднеквадратичное смещение триплет- ной молекулы в латеральной плоскости мембраны за время жизни триплетного состояния КГ4 при коэффициенте диффузии 4 Ю см2 с х составит 400 А . Отсюда следует, что применение триплетних зондов, позволяющее изучать такие сравнительно большие перемещения в мембранах любого размера, дает возможность ликвидировать существующий разрыв между крупномасштабными методами изучения поступательной диффузии и методами спиновых и флуоресцентных зондов.
2. Определение локализации функциональных групп биологиче ских молекул в мембранах.
Многие биомолекулы имеют в своем составе химические соединения, являющиеся хорошими тушителями триплетних состояний различных хромофоров. В число таких групп тушителей входят гем, порфирин, флавия, хиноны, различные ионы переходных металлов и т.д. Как правило, диффузионное тушение триплетних состояний происходит по механизму обменно-резонансного переноса энергии или переноса заряда, то есть в результате обменных взаимодействий /7/. В отличии от диполь-дипольных взаимодействий, эффективно дезактивирующих возбужденные синглетные состояния, обменные взаимодействия быстро убывают с расстоянием. Поэтому тушение триплетних состояний происходит при непосредственном контакте триплетной молекулы с тушителем. Благодаря этому исследование кинетики тушениязраплетных зондов, локализованных в разных частях мембраны, можно использовать для определения локализации соответствующего биологического тушителя или хромофора. Необходимая для экспериментальной регистрации дезактивации триплетних зондов концентрация тушащих центров не превосходит обычную физиологическую концентрацию многих белков тушителей в мембранах.
3. Исследование кинетики диффузионных контактов мембранных белков.
Известно, что многие биохимические реакции протекают в ходе диффузионно возникающих контактов мембранных белков /8/. В настоящее время отсутствуют экспериментальные методы изучения кинетики таких контактов. Для решения этой задачи можно пометить одни из белков триплетной меткой, а другие - меткой тушителем. Столкновения белков можно изучать и регистрируя замедленную ; флуоресценцию, испускаем^ в процессе триплет-триплетной анниги- ляции связанных с белками меток. При исследовании белок -белковых контактов, в принципе, могут быть использованы собственные хромофоры и тушащие группы белков.
4. Изучение процесса переноса электронов.
Многие биологические молекулы, способные тушить триплетнне состояния, функционируют в мембранах в качестве переносчиков электронов. Процесс переноса электронов, также как и тушение триплетних состояний, связан с перекрыванием волновых функций взаимодействующих центров. Поэтому тушение триплетних зондов,в известной степени может моделировать перенос электронов /9/.
Целью настоящей работы является разработка метода исследования строения и динамических свойств мембран с помощью триплетних зондов.
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и заключения.
В первой главе представлен литературный обзор. Основой предлагаемого метода является изучение кинетики дезактивации трип-летных состояний зондов тушителями различной природы. Взаимодействия, приводящие к тушению, возникают в ходе диффузионных перемещений триплетних зондов и тушителей. Поэтому в обзоре рассмотрены существующие экспериментальные методы изучения поступательной диффузии молекул в мембранах и основные области применения триплетяых меток и зондов в биофизических исследованиях в настоящий момент.
Во второй главе описаны химические соединения, использованные в работе и методики основных измерений. Рассмотрены также применявшиеся способы получения липосом и биологических мембран » приводится описание ферментативного метода удаления кислорода из растворов, анализируются особенности предложенного метода обработки экспериментальных результатов по кинетике тушения возбужденных триплетних состояний зондов.
В третьей главе рассмотрены свойства предложенных в работе фосфоресцентних и испускающих АЗФ триплетних зондов.
В четвертой главе на примере изучения фосфатидилхолиновых липосом продемонстрированы возможности метода при изучении локализации и диффузионной подвижности мембранносвязанных объектов. Полученные в главе результаты сравниваются с литературными данными.
В пятой главе приведены результаты исследования биологических мембранных систем. В этой части работы рассмотрены некоторые задачи, решение которых традиционными методами представляет значительные трудности или вообще невозможно. Исследовано рас-
2.+ 2+ положение активного центра С а, Меи АТфазы саркоплазматическо-го ретикулума относительно поверхности мембраны, локализация ге-мов цитохромов Р-450 и в в микросомальной мембране и хинояно-го кольца Убихинояа О -10 в липосомах из ДПШХ. Получены новые данные о структурной организации белкозсьлипидного матрикса мембраны саркоплазматического ретикулума. С помощью триплетной метки пиренмалеимида исследована кинетика динамических взаимодействий молекул АТфазы в мембранах СР.
В заключении подводятся основные итоги проделанной работы и обсуждаются перспективы дальнейшего применения триплетних зондов и меток в исследованиях мембран.
Изучение поступательной диффузии молекул в мембранах
Поступательное движение молекул в мембранах имеет большое значение для протекания многих биохимических реакций. Диффузионные перемещения являются необходимой стадией таких процессов, как перенос электронов в дыхательной цепи /11,12/, рецептор -медиаторные взаимодействия /13/, перекисное окисление липидов /14/, мембранный транспорт /15/. Изучение поступательной диффузии вводимых в мембрану зондов дает информацию о структуре, динамике и вязкости мембран. Характер диффузионного движения зондов зависит от состояния мембраны. Это позволяет использовать данные о поступательном движении зонда. для контроля за состоянием мембраны при различных внешних воздействиях (изменение температуры, рН и т.д.) или при патологических процессах. Обычно выделяют два типа поступательных движений в мембранах: латеральную диффузию и трансмембранные перемещения от одной поверхности мембраны к другой (флип-флоп-лереходы). Небольшие гидрофобные молекулы свободно перемещаются как в латеральной плоскости, так и вдоль всей толщины неполярной части мембраны. Трансмембранные перемещения амфипатических молекул, таких как фосфолипидн и жирные кислоты, происходят гораздо медленней, чем латеральные. Например, среднее время- флип-флопа перескока спин-меченого фос-фатидилхолина в липосомах из яичного лецитина составляет 6,5 часов /16/. За это время среднеквадратичное смещение фосфати-дилхолина в латеральной плоскости составило бы несколько микрон. Предполагается, что для некоторых белков и соединений небелковой природа трансмембранные перемещения непосредственно связаны с их функциональной активностью /11,14/, однако экспериментально этот вопрос исследован недостаточно.
Регистрация кинетики затухания замедленной люминесценции
Блок-схема установки для регистрации кинетики затухания замедленной люминесценции показана на рис.3. В качестве возбуждающего источника света использовался импульсный азотный лазер "ЛГЙг-501" ( А =337 нм) с энергией импульса 5 10" дж и временем импульса Ю"с. Для возбуждения эритрозина применялся также импульсный ксеноновий лазер ЛГИ-40 ( А =526 нм, U —4 7 = 3 10" дж, t = 2 10 с). Запуск лазера в однократном или периодическом режиме осуществлялся с помощью генераторов импульсов Г5-59 или Г5-56. Облучаемый раствор помещался в квадратную I см оптическую кювету фирмы " Atninco -Bowman " (США). Диаметр лазерного светового пучка, попадающего на кювету был равен примерно I см. При регистрации АЗФ для повышения интенсивности замедленной флуоресценции возбуждающий свет фокусировался линзой так, что диаметр светового пучка в центре заполненной прозрачной жидкостью кюветы был равен 0,2-0,3 см. Для отсечения раосеяного возбуждающего света между образцом и фотоумножителем помещался светофильтр БС8. При регистрации кинетики затухания фосфоресценции эозина и эритрозина также использовался светофильтр KC-I8, не пропускающий быструю и замедленную флуоресценцию этих соединений. При регистрации кинетики затухания АЗФ светофильтры, выделяющие нужную часть спектра, подбирались для каждого зонда отдельно. Для измерения спектров замедленного свечения с временным разрешением в установку вместо светофильтров вводился монохроматор ВДР-2.
Фосфоресцентные зонды
В литературе описаны четыре основных типа соединений, испускающих в жидких растворах достаточно интенсивную и долгожи-вущую фосфоресценцию
1. Ароматические соединения, содержащие тяжелые атомы
2. Соединения с дикетонной группировкой - диацетил, дибен-зил, анизоил.
3. Комплексы порфиринов с некоторыми металлами.
4. Ионы Тб3+, Eu3+ , а также комплексные соединения этих и некоторых других переходных металлов.
В качестве фосфоресцентного мембранного зонда в данной работе широко использовался интенсивно фосфоресцирующий краситель эритрозин. Близкая к эритрозину по строению молекула эозина хорошо связывается с различными белками и мембранами за счет
электростатических и гидрофобных взаимодействий /96/. Можно было ожидать, что эритрозин также будет связываться с мембранами и, в частности, с лецитиновыми липосомами, имеющими как полярные, так и гидрофобные участки. Это предположение подтверждается тем, что при добавлении эритрозина к раствору лецитиновых липосом максимум спектра поглощения красителя смещается с 522 до 540 нм (рис.5) . При связывании эритрозина с липосомами значительное длинноволновое смещение претерпевает и спектр фосфоресценции красителя (рис.6). Путем регистрации сдвига спектра поглощения при различных концентрациях фосфатидилхолина и эритрозина было показано, что при концентрации фосфатидилхолина 5 мг/мл липосомы практически полностью связывают эритрозин в концентрации до ЮМ. Время жизни фосфоресценции эритрозина в липосомах из яичного лецитина, ДМФХ, ДПФХ составляло 2+ 4 10 с. Фосфоресценцию в мембранах и водных растворах с %г 1 5 10 с испускали и другие галогенсодержащие ксантеновые красители -эозин В, эозин G , бенгальская роза. При возбуждении ксеноновим лазером ( Л = 526 нм) отношение интенсивностей фосфоресценции эритрозина, эозина В, бенгальской розы и эозина G в 0,1 М трис НСІ буфере рН7,2 составляло 1:0,08:0,15:0,003. Ввиду того, что все эти красители близки по химическому строению, в работе применялся только эритрозин, т.к. его фосфоресценция наиболее интенсивна.
Зонды - тушители триплетних молекул
Для изучения локализации и диффузионной подвижности молекул в липосомах исследовалась кинетика тушения триплетных зондов тушителями различной полярности, одни из которых находились в водной фазе, а другие встраивались в липосомы. В качестве тушителей фосфоресценции эритрозина удобно использовать нитроксильные радикалы, эффективно дезактивирующие триплетные состояния многих красителей /III/. Применение нитроксильных радикалов позволяет, параллельно с проведением экспериментов по тушению, контролировать подвижность тушителей методом ЭПР. Существенно также, что в настоящее время химия нитроксильных радикалов хорошо развита. Благодаря этому можно использовать в качестве тушителей радикалы различного строения с нужными свойствами. Химические формулы и обозначения применявшихся в данной работе нитроксильных радикалов приведены на рис.2.
Для тушения ароматических триплетных зондов, испускающих АЗФ, можно применять различные органические соединения и комплексы переходных металлов. Тушение триплетных состояний подробно исследовалось различными авторами /47,8/, поэтому поиск подходя 75 щих зондов-тушителей, обычно не представляет трудностей. В данной работе в качестве гидрофобного тушителя широко использовался ферроцен, являющийся одним из наиболее эффективным тушителей триплетных состояний большинства органических молекул /112/. Перед использованием триплетных зондов и зондов тушителей в исследованиях мембран, для всех пар зонд-тушитель проводились предварительные измерения констант скоростей тушения в растворах.
Изучение локализации активного центра Са,Ма зависимой АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме
Саркоплазматический ретинулум регулирует сокращение и расслабление мышц путем изменения концентрации ионов Са в саркоплазме. Связанная с мембраной СР Са , ГЛа- + АТФаза за счет энергии гидролиза одной молекулы АТФ переносит через мембрану два иона Са . Способные накапливать ионы Са + везикулы СР диаметром 100-300 нм сравнительно легко выделяют из мышц многих .животных. В полученных препаратах на Са , Ma + АТФазу приходится почти 70$ всей белковой массы. Изучению механизма функционирования Са, Ма + АТФазы СР посвящена обширная литература /84,85/, однако пока этот вопрос далек от окончательного решения.
В данном разделе изучается расположение каталитического АТФазного центра Са , Ma + АТФазы относительно водного растворителя и липидного бислоя. Для выяснения этого вопроса можно ввести в активный центр триплетную метку и, изучая локализацию метки, получить соответствующую информацию об активном центре. Как будет показано ниже, в качестве такой метки могут быть использованы фосфоресцирующие красители эритрозин и эозин.
Введение эозина или эритрозина в раствор СР приводит к ин-гибированию АТФазной активности фермента. Константа ингибирова-ния равна 1,4 10" М для эозина и 1,1 10 М для эритрозина (рис. 17). Предварительная инкубация СР с избытками АТФ существенноснижает ингибирующий эффект. Активность заторможенного фермента обращается также 1000-кратным избытком АТФ. Все эти эффекты указывают на конкурентный характер взаимодействия эозина и эритрозина с АТФазным активным центром СР /117/.
Специфическое взаимодействие хромофоров с такой высокой константой связывания с АТФазным центром фермента может объясняться, с одной стороны, близкими параметрами хромофоров и аде-нозина с точки зрения гидрофобности, а с другой стороны, наличием у хромофоров отрицательных зарядов, способных связываться с положительными зарядами центра, координирующего полифосфатный участок АТФ.
