Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Роль редоксактивных соединений во взаимоотношениях между партнерами в сообществах микроорганизмов (обзор литературы) 16
1.1. Межвидовая коммуникация с использованием химических сигналов и жизнедеятельность бактерий 16
1.1.1. Химическая сигнализация в формировании и развитии ассоциации «хозяин-бактерия» между Rhizobiaceae и бобовыми 22
1.1.2. Химическая коммуникация между микроорганизмами, образующими биопленки в полости рта человека 27
1.1.3. Химическая коммуникация в межвидовых взаимоотношениях с участием Pseudomonas aeruginosa 32
1.1.4. Развитие межвидовой коммуникации в сообществах почвенных бактерий 36
1.1.5. Перспективы исследований, направленных на установлении роли химических соединений, продуцируемых микроорганизмами, в межвидовой коммуникации 46
1.2. Про- и антиоксиданты в коммуникации и адаптации микробных сообществ 48
1.2.1. Редоксактивные соединения в колониальном развитии S.cerevisiae 51
1.2.1.1. Межклеточная коммуникации, дифференциация колоний и защита от стресса S.cerevisiae 51
1.2.1.2. Участие про- и антиоксидантов в механизмах защиты от стресса в колониях S.cerevisiae 55
1.2.1.3. Активные формы кислорода и запрограммированная смерть клетки у S.cerevisiae 60
1.2.2. Редоксактивные соединения и биопленки Candida sp 62
1.2.2.1. Фарнезол и активные формы кислорода в межклеточной сигнализации в популяциях Candida sp 64
1.3. Редоксактивные соединения и бактериальные биопленки. 67
1.3.1. Активные формы кислорода в межклеточной сигнализации в биопленках бактерий 72
1.3.2. Бактериальные биопленки и адаптация к оксидативному стрессу 76
Глава 2. Материалы и методы исследования 80
2.1. Общие данные 80
2.2. Характеристика штаммов микроорганизмов 80
2.3. Методы выделения микроорганизмов 81
2.4. Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов 81
2.5. Изучение биологических свойств бактерий
2.5.1. Метод определения продукции бактериями пероксида водорода 82
2.5.2. Метод определения продукции бактериями гидроксильных радикалов 83
2.5.3. Метод определения продукции бактериями супероксиданион радикала 84
2.5.4. Метод определения продукции бактериями ингибиторов каталазы 84
2.5.5. Метод определения каталазной активности бактерий 85
2.5.6. Метод определения железовосстанавливающей и железоокисляющей способности бактерий 86
2.5.7. Метод определения общей антиоксидантной активности бактерий и отдельных фракций их метаболитов 86
2.5.8. Метод определения способности бактерий снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов 87
2.5.9. Метод оценки влияния факторов среды на способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты..
2.5.10. Метод определения адгезивных свойств бактерий 87
2.5.11. Метод определения гидрофобных свойств бактерий 89
2.5.12. Метод определения способности бактерий образовывать биопленки 89
2.5.13. Метод определения способности бактерий сорбировать белки 90
2.5.14. Метод определения антилизоцимной активности бактерий 90
2.6. Метод определения активности лизоцима 92
2.7. Метод изучения потенцирующего действия метаболитов пероксидпродуцирующих микроорганизмов на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета 93
2.8. Метод изучения потенцирующего действия метаболитов коринебактерий на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл 93
2.9. Методика изучения изменения биологических свойств бактерий под влиянием метаболитов пероксидпролуцирующих лактобацилл 94
2.10 Методы статистической обработки полученных результатов 94
Глава 3. Характеристика способности представителей нормальной микрофлоры нижних отделов женского репродуктивного тракта продуцировать редоксактивные соединения 97
3.1. Характеристика исследуемых микроорганизмов 98
3.2. Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с прооксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта
3.2.1. Изучение способности микроорганизмов продуцировать пероксид водорода 100
3.2.2. Изучение способности микроорганизмов продуцировать супероксиданион и гидроксильные радикалы 106
3.2.3. Изучение способности микроорганизмов продуцировать ингибиторы бактериальной катал азы 108
3.2.4. Изучение влияния факторов среды на продукцию пероксида водорода лактобациллами 111
3.3. Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с антиоксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта 114
3.3.1. Оценка распространенности защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов 114
3.3.2. Изучение общей антиоксидантной активности (ОАА) внеклеточных метаболитов бактерий 116
3.3.3. Изучение механизмов, обеспечивающих снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов 118
3.3.4. Изучение механизмов, регулирующих выживание бактерий в условиях окислительного стресса и дефицита ионов железа 121
3.3.5. Изучение влияния факторов среды на продукцию антиоксидантов лактобациллами 128
3.4. Изучение связи уровня про- и антиоксидантов,
продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа.. 130
Глава 4. Изучение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета 140
4.1. Изучение влияния метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета 140
4.2. Изучение влияния метаболитов бактерий с прооксидантным и антиоксидантным эффектом на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл 152
Глава 5. Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал 162
5.1. Влияние прооксидантов на адгезивные характеристики микроорганизмов и их способность к биопленкообразованию 163
5.2. Влияние антиоксидантов на адгезивные характеристики микроорганизмов и их способность к биопленкообразованию 171
5.3. Влияние прооксидантов на антилизоцимную и каталазную активности 176
Глава 6. Характеристика потенциальных возможностей использования активных форм кислорода для снижения численности микроорганизмов 185
6.1. Сравнительная характеристика биоцидных эффектов гидроксильных радикалов и пероксида водорода 185
6.2. Перспективы применения пероксидпродуцирующих микроорганизмов для создания биоцидных способов и композиций, использующих в качестве действующего начала активные формы кислорода і g Заключение 204
Литература
- Химическая коммуникация между микроорганизмами, образующими биопленки в полости рта человека
- Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов
- Изучение способности микроорганизмов продуцировать пероксид водорода
- Изучение влияния метаболитов бактерий с прооксидантным и антиоксидантным эффектом на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рассматривая симбиоз в качестве формы существования организмов в биосфере, его по праву считают основой современного разнообразия форм жизни, положившего начало появлению эукариот (Margulis, 2002). Появление эукариот связано с воздействием активных форм кислорода - побочных продуктов локального повышения концентрации кислорода в процессе фотосинтеза (Gross, Bhattacharya, 2010). Дополнением к этому служат материалы о том, что исходно эндосимбиотические предки митохондрий не могли ни импортировать белки, ни экспортировать АТФ, но, получая от клетки-хозяина пируват, обезвреживали токсичный для нуклеоцитоплазмы кислород (Kurland, Andersson, 2000). В последние годы получены новые доказательства роли кислорода в развитии современных симбиотических систем - это симбиоз между жёлтопятнистой амбистомой (Ambystoma maculatum) и микроскопической водорослью Oophila amblystomatis (Kerney и др., 2011), где водоросли, используя метаболиты животного, в процессе фотосинтеза вырабатывают кислород, необходимый для получения химической энергии митохондриями хозяина.
Появление около 3 миллиардов лет назад процессов оксигенного фотосинтеза (Buick, 2008) способствовало накоплению в биосфере кислорода (Farquhar, J. et al., 2000), что, в свою очередь, повлекло ряд как благоприятных, так и неблагоприятных моментов для живых организмов.
С одной стороны, кислород стал причиной мощного эволюционного скачка, проявившегося как в появлении новых механизмов добывания энергии, так и появлении принципиально новых организмов - эукариот (Anbar, Knoll, 2002), с другой - участие кислорода в метаболизме способствовало формированию оксидативного стресса, который отражает существующий в биологических системах дисбаланс между образованием и детоксикацией легко возникающих активных форм кислорода (Sies, 1997).
Негативное действие физиологически высоких концентраций АФК на структуры клетки, проявляющееся в повреждении ДНК, белков, липидов и других компонентов (Beckman, Ames, 1998) хорошо изучено, но известен и «по-
ложительный» биологический эффект АФК на клетку и ее системы. Так, например, была выявлена стимуляция активности фермента гуанилатциклазы и повышение концентрации вторичного мессенджера пГМФ под влиянием гид-роксильного радикала (Mittal, Murad, 1977) и пероксида водорода (White et al., 1976), образующихся из супероксиданиона. В настоящее время растет число работ, посвященных биорегуляторной роли про- и антиоксидантов в реакции организмов на различные медиаторы и факторы внешней среды (Torres, 2010, Mittleretal., 2011).
Возможность образования прооксидантов и антиоксидантов в биологических объектах известна (Commoner et al., 1954), и было показано, что проокси-данты, в частности, активные формы кислорода, будучи побочными продуктами аэробного метаболизма, являются важнейшей причиной повреждений в клетке (Harman, 1981), а открытие фермента-антиоксиданта - супероксиддисму-тазы (McCord, Fridovich, 1969) подтвердило их важную регуляторную роль в биологии.
Оксидативный стресс, его причины и последствия чаще всего рассматриваются применительно к отдельным клеткам, тканям и органам многоклеточных (Владимиров, 2009). Понятие оксидативного стресса, по всей вероятности, применимо и для сообществ: например, продукция активных форм кислорода -распространенное явление в водных экосистемах, а окислительный стресс является важным компонентом реакции организмов на изменения условий окружающей среды (Lesser, 2006).
В то же время остается открытым вопрос о биологической роли про- и антиоксидантов в межклеточных и межвидовых взаимоотношениях, в частности их участии в процессах формирования симбиотических отношений между прокариотами и другими организмами.
А между тем, именно эти симбиотические взаимоотношения прокариот с многоклеточным организмом (хозяином) имеют существенное значение, получив в последнее время поддержку с появлением новой концепции в симбиоло-гии - ассоциативного симбиоза (Бухарин и др., 2007).
Рассмотрение инфекции в качестве модельной системы ассоциативного симбиоза определило «инфектологическое поле» как пригодное для изучения регуляторной функции про- и антиоксидантов в симбиотической системе «паразит - хозяин», обозначив новые перспективы в управлении инфекционным процессом (Бухарин и др., 2011).
Именно эти моменты и определили цель и задачи нашей работы.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является характеристика роли про- и антиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции симбиозов с участием прокариот.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучение спектра метаболитов с про- и антиоксидантным действием, продуцируемых микрофлорой, установление распространенности и выраженности продукции этих веществ бактериями, определение факторов среды, регулирующих их синтез (на примере вагинального биотопа).
-
Исследование связи уровней про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием биотопа хозяина.
-
Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал (адгезивные характеристики, способность к биопленкообразованию, гидрофоб-ность клеточной поверхности, каталазную, лизоцимную и антилизоцимную активности).
-
Определение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета макроорганизма.
-
Изучение возможности усиления антагонистической активности пероксидпродуцирующих доминантов путем подавления антиоксидантной защиты бактерий-ассоциантов и/или стимуляции образования из пероксида водо-
рода активных форм кислорода с высокой реакционной способностью.
Научная новизна
Установлена роль про- и антиоксидантов в обеспечении стабильного существования и функционирования симбиотических систем, включающих гено-типически разнородные элементы. Показано, что изменение баланса продукции про- и антиоксидантов возникает как реакция микросимбионтов на внешние воздействия, через модификацию биологических свойств симбионтов, определяя стабильность сообщества в целом.
Изучен спектр метаболитов с про- и антиоксидантным действием (на примере вагинальной микрофлоры), установлены распространенность и выраженность продукции про- и антиоксидантов бактериями, определены факторы среды, регулирующие их синтез.
Синхронные высокие уровни продукции про- и антиоксидантов являются характерным признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождаются смещением баланса про- и антиоксидантов.
Обнаружена способность бактерий защищать другие микросимбионты от бактерицидного действия гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона (Патент РФ № 2279079). Механизмом, определяющим этот эффект яв-
94- "34-
ляются способность бактерий окислять Fe в Fe , что препятствует образованию гидроксильных радикалов в реакции Фентона, и продукция веществ, обладающих антиоксидантными свойствами - внеклеточных полисахаридов, пигментов и липидсодержащих соединений.
Выявлено наличие у микроорганизмов механизмов, запускающих при не-
достатке Fe работу клеточных систем, синтезирующих метаболиты, инакти-вирующие гидроксильные радикалы или препятствующие их образованию в реакции Фентона.
Установлен механизм поддержания стабильности микробных биоценозов, основанный на синергидном эффекте факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормальной микрофлорой.
Показано, что антагонистический эффект лактобацилл, обусловленный продукцией пероксида водорода, усиливается метаболитами бактерий с прооксидант-ным действием, направленным на ингибирование ферментов антиокислительной системы и восстановление железа.
Выявлены дозозависимые эффекты изменения поверхностных свойств бактериальных клеток под влиянием продуцируемых нормальной микрофлорой активных форм кислорода, заключающиеся в снижении гидрофобности и адге-зивности бактерий, уменьшении их способности сорбировать белки, модификации уровня биопленкообразования. Пероксидпродуцирующие микроорганизмы оказывают регулирующее влияние на характер взаимодействия бактерий с колонизируемыми ими поверхностями за счет продукции активных форм кислорода, определяя структурно-функциональное состояние микробных биоценозов.
На примере антилизоцимной и каталазной активностей бактерий обнаружено изменение гетерогенности бактериальных популяций по указанным признакам в результате воздействия про- и антиоксидантов бактериального происхождения.
Разработан новый подход к усилению бактерицидной эффективности пе-роксидпродуцирующих микроорганизмов, заключающийся в подавлении анти-оксидантной защиты клетки и стимуляции образования из пероксида водорода гидроксильных радикалов и гипойодида - мощных антибактериальных агентов, не вызывающих к ним резистентность у микроорганизмов.
Теоретическая и практическая значимость
Получены новые данные, расширяющие представления о механизмах симбиотических взаимоотношений, обеспечивающих стабильное состояние симбиоза за счет изменения в нем баланса продукции про- и антиоксидантов.
Практическая ценность работы характеризуется возможностью создания препаратов и технологий для терапии и профилактики инфекций человека и животных, а также контроля за санитарным состоянием среды обитания. Опре-
делены принципы создания оптимальных условий для генерации гидроксиль-ных радикалов путем подбора соответствующих концентраций ионов железа.
На основании полученных данных о чувствительности микроорганизмов к гидроксильным радикалам предложены «Способ дезинфекции объектов окружающей среды» (Патент РФ № 23221426) и инновационная разработка «Технология контроля численности нежелательных микроорганизмов», удостоенная серебряной медали VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).
Результаты работы по усилению бактерицидного эффекта пероксида водорода пероксидазой хрена и йодидом калия позволяют повысить эффективность применения пробиотиков, содержащих пероксидпродуцирующие микроорганизмы.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Баланс про- и антиоксидантов в симбиотических системах с участием прокариот - инфектологический феномен, обеспечивающий регуляцию и поддержание стабильности биоценоза за счет модификации биологических свойств симбионтов и создающий препятствия колонизации биотопа аллохтон-ными микроорганизмами.
-
Потенцирование метаболитами пероксидпродуцирующих микроорганизмов бактерицидного эффекта факторов врожденного иммунитета хозяина является одним из механизмов формирования стабильного микробного биоценоза человека, связанным со способностью нормальной микрофлоры регулировать функции биологически активных молекул макроорганизма.
-
Пероксидпродуцирующие микроорганизмы определяют механизм защиты биотопа, связанный с дифференцированным влиянием пероксида водорода на факторы колонизации автохтонных и аллохтонных микроорганизмов (адгезия и гидрофобность) и изменением их адаптивного потенциала (антили-зоцимной и каталазной активностей и способности к биопленкообразованию).
-
Изменения в балансе продукции про- и антиоксидантов - биологическая основа регуляции гомеостаза симбиотической системы, где выявленные
закономерности реакций симбионтов на эти изменения открывают возможности управления исходом микробиоценоза.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на: IV - VII Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2003, 2006, 2009, 2012; Российской научной конференции «Репродуктивное здоровье населения» г. Оренбург, 2005; Международной конференции «Пробиотики, пребио-тики, синбиотики и функциональные продукты питания», г. Москва, 2004; Конференции «Фундаментальные науки - медицине» по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, г. Москва, 2004; «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», г.Москва, 2006, 2009, IV Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», г. С-Петербург, 2008.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получено 3 патента РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации
Химическая коммуникация между микроорганизмами, образующими биопленки в полости рта человека
Бактериальные сообщества являются неотъемлемым, функционально значимым компонентом большинства известных природных сред и биологических систем. Так, к настоящему времени описаны многочисленные примеры видового разнообразия бактерий, являющихся обитателями фотосинтезирующих мат, корневых систем растений, органов животных и человека (Eckburg et al. 2005; Gill et al. 2006; Hungate, 1975; Kent & Triplett, 2002; Ward et al, 1998; Черкасов, 2008). Фактически, нормальная физиологическая функция и защита от потенциальных патогенов вышеуказанных симбиотических систем обеспечиваются их бактериальными компонентами.
Учитывая разнообразие взаимодействий видов в многочисленных симбиотических системах, вероятность того, что участники микробных сообществ игнорируют действия друг друга и сосредоточены в лучшем случае только на потреблении питательных веществ и размножении, крайне мала. В самом деле, в природе существует много примеров, утверждающих обратное (Бухарин и др., 2007), тем не менее, наши знания о межвидовой сигнализации между микроорганизмами и другими формами жизни неполны.
Существует и успешно развивается точка зрения заключающаяся в том, что развитие и жизнедеятельность микробных сообществ обеспечиваются характерным для каждого компонента симбиоза производством химических сигналов и реакцией на них. Необходимость передачи информации между участниками симбиозов для координации их поведения, основанного на кооперативном или конкурентном взаимодействиях, является, по-видимому, функционально важной для любого сообщества (Diggle et al., 2007).
Микроорганизмы выживают в окружающей среде путем обмена с ней химической информацией, питательными веществами и отходами метаболизма. Вероятно, разнообразные химические сигналы, генерируемые и воспринимаемые микроорганизмами являются средством коммуникации, согласно которому и определяется тип взаимодействия в сообществах.
Тем не менее возникает вопрос о возможности интерпретации действий различных химических сигналов в межклеточной сигнализации и понимании принципов регуляции взаимоотношений в микробных сообществах.
Концепция межклеточной сигнализации была создана на основании достаточно глубокого изучения закономерностей развития многоклеточных организмов и чаще в контексте исследований болезней человека. Исходя из этой концепции, основой для межклеточной сигнализации служит лиганд-рецепторное взаимодействие, которое приводит к активации или подавлению одного или нескольких биохимических путей и влечет за собой изменения в развитии тканей и органов, а также к специфичному ответу клеток.
Концепция межклеточной сигнализации, по-видимому, справедлива и в отношении микроорганизмов, так как сигнальные цепи и каскады бактерий имеют очень много общего с таковыми у многоклеточных микроорганизмов (Cashin et al., 2006), и в то же время сенсорные системы бактерий и макроорганизмов существенно различаются в связи с прямым влиянием на микроорганизмы факторов внешней среды в условиях отсутствия гомеостатических механизмов создаваемых органами и тканями. Несмотря на отличия в физиологии, бактерии и другие микроорганизмы способны образовывать сообщества, зачастую функционирующие подобно органам многоклеточных. Ярким примером этому служат биопленки, в которых в отношении всех микроорганизмов координируются архитектура расположения клеток, продукция внеклеточного матрикса и поведение отдельных популяций бактерий.
Так, Myxococcus xanthus и Bacillus subtilis формируют структурированные биопленки, в которых существует четкое разделение функций между бактериями (Aguilar et al, 2007; Berleman & Kirby, 2007; Kaiser, 2004; Vlamakis et al., 2008).
В-связи с этим, возникает вопрос о причинах и механизмах дифференциации клеток внутри биопленки.
Современные исследования показывают, что такая дифференциация бактериальных клеток зачастую управляется стохастическими процессами, происходящих в биопленках (Dubnau & Losick, 2006), на основании чего разработана гипотеза «бистабильности» бактерий, согласно которой «удел» индивидуальной бактерии определяется механизмами, переключающими поведение клетки. Развитие упорядоченных структур, состоящих из дифференцированных клеток, и их репродукция требуют координацию и контроль межклеточных коммуникаций. Доказательства существования сигналов, определяющих регуляцию межклеточных коммуникаций существуют для ряда развивающихся систем, представленных одним видом бактерий (Bassler & Losick, 2006). Однако экологическая роль этих сигналов в естественных многовидовых сообществах и даже в относительно простых искусственно созданных остается в значительной мере неясной.
Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов
Для оценки влияния метаболитов микроорганизмов на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета (лизоцима, лактоферрина, антимикробного белка тромбоцитов) смешивали их с равным объемом раствора лизоцима разных концентраций в 0,1 М ФСБ (рН=6,2), в контроле использовали метаболиты, предварительно обработанные каталазой (8 U/мл) (Е.С. 1.11.1.6, Sigma-Aldrich) для удаления из них НгСЬ.
Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) нативных и модифицированных метаболитами микроорганизмов факторов врожденного иммунитета к взвеси бактерий в 0,1 М ФСБ (рН=6,2), содержащей 105 КОЕ/мл, добавляли равный объем раствора лизоцима в различных концентрациях, инкубировали в течение часа при 37 С и высевали E.coli на среду Эндо, L. acidophylus - на среду MRS. Результаты высева учитывали через сутки культивирования в термостате в микроаэрофильных условиях. Значения МБК лизоцима выражали в мкг/мл.
Метод изучения потенцирующего действия метаболитов коринебактерий на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл Для оценки влияния метаболитов коринебактерий на проявление антагонистической активности ЙЬОг-продуцирующих лактобацилл был осуществлен эксперимент по совместному действию внеклеточных метаболитов этих бактерий на выживаемость тест-штаммов S. aureus, Е. coli и L. acidophylus. Для этого из бульонных культур тест-штаммов, отмытых трижды центрифугированием (3000g в течение 15 минут) 0,1 М
ФСБ готовили взвесь, содержащую приблизительно 106 КОЕ/мл. К 0,2 мл взвеси бактерий добавляли 0,4 мл простерилизованных фильтрованием (0.22 им, Millipore) внеклеточных метаболитов С. minutissimum (в контрольных пробах использовали МПБ). Смеси инкубировали при 37С 30 минут, затем к ним добавляли по 0,4 мл метаболитов лактобацилл с заранее определенным содержанием Н2О2, снова инкубировали 1 час при 37С и высевали на твердые питательные среды: S. aureus - МПА (НПО "Питательные среды", Махачкала), Е. coli - Эндо и L. acidophylus на агар MRS (Sifin, Германия), учитывали результаты высева через сутки.
Для изучения влияния лактобацилл на активность каталазы и антилизоцимную активность бактерий использовали внеклеточные метаболиты лактобацилл. Для этого взвесь бактерий обрабатывали в течение 15 минут внеклеточными метаболитами лактобацилл, с последующей отмывкой центрифугированием (g=3000, 20 мин). В контроле использовался фосфатный буфер (50 мМ, рН=6,8). Обработанные взвеси бактерий подращивались в жидкой питательной среде (2 % МПБ, НПО «Питательные среды», г. Махачкала) в течение 6 часов с последующим рассевом на твердые питательные среды и выделением клонов. Выделение клонов осуществляли согласно ранее описанным рекомендациям (Миллер, 1976).
При статистической обработке полученных результатов проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни, исследование взаимосвязи между признаками осуществляли при помощи парного коэффициента линейной корреляции Спирмена (г) (Гланц, 2004). Таблицы содержат данные в виде средних арифметических (М) и стандартных ошибок средних (т). Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости р принимался равным 0,05.
Информативность присутствия про- и антиоксидантов для оценки микроэкологического состояния биотопа определялась с использованием методики неоднородной последовательной процедуры включающей в себя: подготовку перечня признаков; накопление наблюдений с достоверной верификацией диагноза осложнения; распределение частот признаков для дифференцируемых групп; определение отношения вычисленных из частот вероятностей, с которыми признак наблюдался у разделяемых групп; вычисление диагностических коэффициентов; вычисление информативности признаков; распределение признаков в порядке убывания их информативности; выбор пороговых значений суммы диагностических коэффициентов; проверку слепым методом полученной диагностической таблицы на случайной выборке и вынесение решения о принадлежности или непринадлежности пациента к той или иной группе.
Распределив обследуемых по частотам в соответствии с результатами изучения отдельных признаков и определив суммы наблюдений в каждой из групп (ХІ И ХЦ), разделив на них значения частот, получили вероятности (pi и ріі).
Изучение способности микроорганизмов продуцировать пероксид водорода
К настоящему времени известна способность микроорганизмов выделять метаболиты, предохраняющие бактерии от токсического действия гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона (Сгибнев и др., 2006), хотя механизм этого явления не достаточно изучен. Вероятно, он связан со способностью бактерий синтезировать метаболиты, предохраняющие микроорганизмы от токсического действия гидроксильных радикалов за счет их инактивации или предупреждения образования в реакции Фентона. В связи с этим целью данного этапа исследования явилось изучение механизмов протективного действия бактериальных метаболитов по отношению к микроорганизмам в реакции Фентона.
Для выяснения природы веществ, ответственных за антиоксидантную активность культуральные жидкости делили на фракции - внеклеточные полисахариды, липиды и пигменты и определяли способность этих фракций снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременно с этим определяли у исследуемых бактерий способность окислять ионы железа (II) в ионы железа (III) и каталазную активность.
Результаты данного исследования суммированы в таблице 3.2, из которой видно, что для большинства исследуемых микроорганизмов характерно одновременное присутствие нескольких механизмов снижения бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов (Таб.3.2).
Фракции культуральных жидкостей бактерий в различной степени предохраняли клетки Е. coli от гидроксильных радикалов (Таб. 3.2). Так, например, полисахаридная фракция внеклеточных метаболитов Lactobacillus spp. в 75% случаев защищала Е. coli от бактерицидного действия гидроксильных радикалов, полисахариды Corynebacterium spp. в 52,4% случаев, Micrococcus spp. - 12,5%, КОС - 11,8%. Среди изученных штаммов Lactobacillus spp. протективным действием обладала липидсодержащая фракция только одного штамма (6,25%) и не отмечено ни одного случая защитного действия фракции, экстрагированной ацетоном, тогда как у Micrococcus spp. этот эффект наблюдался в 87,5 и 100%, у КОС - 58,8 и 88,2%, у Corynebacterium spp. - 66,7 и 14,3% случаев, соответственно. Следует отметить, что, как и в случае культуральных жидкостей, обработка клеток Е. coli фракциями внеклеточных метаболитов бактерий после предварительного контакта бактерий тест-штамма с гидроксильными радикалами не снижало бактерицидного эффекта. железо метаболиты только 2 штамма (12,5%), Micrococcus spp. - 3 (37,5%), КОС - 9 (52,9%). Наибольшей частотой встречаемости способности окислять Fe2+ в Fe3+ обладали метаболиты Corynebacterium spp. - 12 штаммов (57,2%).
В случае коагулазоотрицательных стафилококков в среде культивирования обнаруживались незначительные уровни каталазной активности - 0,2 - 0,7 мМ/мин мг белка. Мы полагаем, что даже такое небольшое количество этих антиоксидантных ферментов, эффективно разлагающих пероксид водорода, достаточно для уменьшения бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов.
Из вышеописанных результатов следует, что в микробиоценозах человека в присутствии доминирующих видов бактерий, определяющих состояние среды за счет продукции активных форм кислорода, существуют микроорганизмы, способные не только успешно противостоять наиболее токсичным для них производным кислорода, но и оказывать защитное действие по отношению к другим бактериям.
Протективное действие бактериальных метаболитов от гидроксильных радикалов по отношению к микроорганизмам сопровождалось, в ряде случаев, способностью бактерий окислять ионы железа (II) в ионы железа (III), тем самым предотвращая их участие в реакции Фентона (Прайер, 1970).
С другой стороны, бактерии выделяли в окружающую среду большое количество метаболитов (полисахариды, липиды и пигменты), выделенные индивидуальные фракции которых реагировали с уже образовавшимися гидроксильными радикалами. Снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов определялось концентрацией этих веществ - ловушек радикалов.
В настоящее время известно антиоксидантное действие полисахаридов различной природы (Athukorala, Kim, Jeon, 2006), веществ, экстрагируемых ацетоном из биологических материалов, в том числе каротиноидов и фенольных соединений (Alasalvar et al., 2006). Наличием подобных соединений можно объяснить полученные нами результаты по способности внеклеточных метаболитов бактерий предохранять другие микроорганизмы от токсического действия гидроксильных радикалов. Вероятно, подобные механизмы могут защищать микроорганизмы и при взаимодействии с активными формами кислорода, продуцируемыми организмом хозяина, например, в случае известной устойчивости капсулообразующих и синтезирующих пигмент бактерий к кислородзависимому киллингу (Бухарин, 1999). Следует также отметить, что у большинства изученных бактерий способность снижать бактерицидность гидроксильных радикалов осуществляется при помощи двух и более механизмов. Таким образом, защитное действие бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов обеспечивается продукцией микроорганизмами веществ инактивирующих их или препятствующих их образованию.
Изучение влияния метаболитов бактерий с прооксидантным и антиоксидантным эффектом на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл
На основании вышеописанных результатов, можно сделать вывод о том, что в результате воздействия на микроорганизмы пероксида водорода и гидроксильного радикала, происходит изменения поверхностных свойств бактериальных клеток. Эти изменения проявляются, во-первых, в уменьшении гидрофобности клеток, во-вторых, в уменьшении способности бактерий сорбировать на своей поверхности такие белки как лизоцим и гемоглобин.
Можно предположить, что уменьшение уровня гидрофобности клеток под влиянием активных форм кислорода приведет к уменьшению адгезивных свойств бактерий, затрудняя тем самым их прикрепление к поверхности клеток макроорганизма. Вероятно, модификация поверхности бактерий не связана с окислительной трансформацией белков, так как при взаимодействии белков с активными формами кислорода происходит увеличение их гидрофобности (Davies, Delsignore, 1987), тогда как в данном исследовании показано уменьшение гидрофобности микроорганизмов. Уменьшение способности бактерий сорбировать на своей поверхности белки после контакта клеток с активными формами кислорода может препятствовать формированию на поверхности микроорганизма своеобразного защитного экрана, образующегося за счет неспецифического связывания белков хозяина (Бухарин, 1999) и тем самым облегчить доступ каких-либо эффекторов специфической и неспецифической резистентности к патогену.
С другой стороны, получены данные о снижении активными формами кислорода способности бактерий сорбировать на своей поверхности как катионный белок лизоцим, так и электронейтральный гемоглобин. Следовательно, механизм, объясняющий повышение чувствительности бактерий к факторам врожденного иммунитета после контакта клеток с активными формами кислорода является не изменение поверхностных свойств, а, по-видимому, сочетанное действие факторов.
Таким образом, выявленное влияние метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на функциональную активность факторов врожденного иммунитета можно рассматривать в качестве механизма поддержания стабильности микробных биоценозов, основанного на синергизме эффектов факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормофлорой.
Бактерии рода Lactobacillus производят широкий спектр веществ с антагонистическим эффектом, что дает им возможность регулировать численность других микроорганизмов в биотопах тела человека (Бухарин и др., 2007). Одним из таких антибактериальных веществ является пероксид водорода, важная роль которого показана в предотвращении дисбиотических состояний женского репродуктивного тракта (Klebanoff et al.,1991). Тем не менее, существует точка зрения, заключающаяся в том, что антагонистическая активность лактобацилл является совокупностью эффектов всего комплекса продуцируемых ими антимикробных веществ, а роль пероксида водорода в ней не решающая (Strus et al., 2006).
Действительно, лактобациллы не всегда принимают участие в обеспечении колонизационной резистентности вагинального биотопа, доказательством этому служат многочисленные факты выделения этих микроорганизмов при дисбиотических состояниях (Черкасов, 2008). Вероятно, реализация антагонистического потенциала лактобацилл, доминирующих в вагинальном биотопе, возможна только при их взаимодействии с другими представителями нормальной микрофлоры, ассоциированными с состоянием эубиоза. Для доказательства или опровержения этой гипотезы мы провели ряд исследований по совместному влиянию метаболитов лактобацилл с одной стороны и метаболитов коринебактерий, коагулазоотрицательных стафилококков, кишечных палочек и золотистых стафилококков с другой на прирост биомассы S. aureus и Е. соїі. В результате выяснено, что метаболиты коринебактерий и коагулазоотрицательных стафилококков усиливали антагонистическую активность лактобацилл, а метаболиты золотистого стафилококка и кишечной палочки - уменьшали. (Рис. 4.5).
Так, оптическая плотность бульонной культуры S. aureus в контроле антагонистической активности лактобацилл составила 0,65±0,04 у.е., при дополнительном введении метаболитов коринебактерий - 0,51±0,03 у.е. (р 0,05), то есть антагонистистическая активность лактобацилл по отношению к золотистому стафилококку под влиянием коринебактерий возросла на 42% (Рис. 4.5).
![Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс]](/i/i/4438/203060.png "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс] Омельченко Наталья Дмитриевна")
