Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Влияние стрессовых воздействий на антиоксидантную систему растений (обзор литературы) 11-36
1.1. Аскорбиновая кислота 12-20
1.1.1. Кислоты и ферменты системы аскорбиновой кислоты 12-14
1.1.2. Физиологическая роль аскорбиновой кислоты в жизни растений 14-20
1.2. Каротиноиды 20-26
1.4. Влияние нефтяного загрязнения на физиологическое состояние растений 30-36
Глава 2. Климато-географическая характеристика района исследования 37-52
2.1. Климат 38-40
2.2. Почвы 40-45
2.3. Растительность 45-51
2.3.1. Флора лекарственных растений 51-52
Глава 3. Материалы и методы исследования 53-63
3.1. Методы полевых исследований 53-54
3.2. Методы лабораторных исследований 54-62
3.2.1. Определение содержания аскорбиновой кислоты в лекарственном растительном сырье 54-57
3.2.2. Определение содержания каротина в лекарственном растительном сырье 58-60
3.2.3. Определение суммы флавоноидов родственных рутину в лекарственном растительном сырье 60-61
3.2.4. Определение показателя потери при прокаливании почвы 61-62
Глава 4. Содержание биологически активных веществ в лекарственных растениях ХМАО 63-70
Глава 5. Влияние нефтяного загрязнения на накопление микроэлементов синтез низкомолекулярных а нти оксид а нто в в лекарственных растениях ХМАО 71-99
5.1. Оценка почв по степени загрязнения нефтепродуктами 71 -72
5.2. Содержание микроэлементов в листьях растений нефтезагрязнепных территорий 73-83
5.3. Влияние нефтяного загрязнения на накопление растениями низкомолекулярных антиоксидантов 83-99
Глава 6. Зависимость содержания микроэлементов и биологически активных веществ в листьях растений Chamaenerion angustifolium, произраставших на различных территориях г. Сургута и промзоны 100-106
Выводы 107-108
Практические рекомендации 108-108
Список литературы 109-129
Приложение 130-152
Введение к работе
Актуальность исследования. В последнее время загрязнение окружающей среды становится важным внешним фактором, к которому растения эво-люционно не приспособлены. Загрязняющие вещества, нарушая физиологические процессы растений, оказывают не только прямое отрицательное воздействие, но и сужают пределы толерантности к естественным факторам среды [88]. і Общим следствием любого стрессового воздействия на организм растения является продукция свободных радикалов, инактивирующих энзимы, повреждающих важные клеточные компоненты [140]. Антиоксидантная система растений обеспечивает работу механизмов противостояния окислительному стрессу и включает в себя как низкомолекулярные антиоксиданты (аскорбиновая кислота, флавоноиды, каротин), так и ферменты антиоксидантного действия [127, 140, 149].
Многие современные исследования направлены на изучение низкомолекулярных антиоксидантов как биохимических индикаторов загрязнения ок і ружающей среды [123, 126], а так же как биомаркеров физиологического состояния растений, произрастающих в стрессовых условиях среды [125, 151].
В последнее время при изучении влияния загрязняющих веществ или других стрессоров большее внимание уделялось древесным растениям, произрастающим в лесах, а также культурным растениям [ПО, 124]. В то же время лекарственные растения являются важным источником поступления низкомолекулярных антиоксидантов и микроэлементов в организм человека и животных, неспособных к их самостоятельному синтезу.
В течение длительного периода освоения Севера экологические условия резко ухудшились, вследствие загрязнения территории нефтью и попутными минерализованными водами [33]. Ситуация усугубляется увеличением объема добычи нефти за последние несколько лет [87]. Нефть токсична для всех живых организмов и является причиной накопления в животных и растительных объектах тяжелых металлов, индуцирующих стрессовые реакции [123, 148].
Установлено, что биологические материалы, в том числе и лекарственные растения, могут играть роль концентраторов токсичных неорганических веществ, поглощая их из загрязненной окружающей среды: почвы, воды, атмосферного воздуха [27, 38, 81, 110,146, 148].
Лекарственные растения используются не только для медицинских целей, в природной среде они являются источником питания для различных организмов. Накопление в растительной массе токсичных веществ может привести к их дальнейшему распространению в экосистеме по пищевым сетям. Вызывает беспокойство неконтролируемый сбор местным населением дикорастущих лекарственных растений, оказывающихся источником прямого посту і пления в организм человека, помимо действующих веществ, токсичных соединений [20].
Научные исследования по адаптации растений к нефтяному загрязнению и оценке роли низкомолекулярных антиоксидантов в их стрессовых реакциях проводятся в России сравнительно недавно. Многие исследования в этой области направлены на поиск биомаркеров для экологического мониторинга [86, 123, 125, 126, 127, 140, 151].
Применение биоиндикационных методов на уровне метаболических реакций автотрофных организмов необходимо для ранней диагностики экологи t ческого неблагополучия [10, 102]. Следовательно, изучение механизмов
адаптации растений к антропогенным стрессорам является актуальной задачей. Работ эколого-биохимической направленности по исследованию лекарственных растений на территории ХМАО не проводилось, что и определяет актуальность темы.
Диссертационная работа выполнена в рамках региональных программ «Изучение природных и урбанизированных экосистем Западной Сибири» (номер госрегистрации 0120.0 504249) и «Комплексный климатоэкологиче ский мониторинг северных территорий Тюменской области» (номер госреги і страции 0120.0 406836).
Цель исследования - выявить перспективные по содержанию биологически активных веществ (БАВ) виды лекарственных растений подзоны средней тайги (на территории ХМАО), изучить влияние техногенных загрязнений на синтез низкомолекулярных антиоксидантов и накопление особо опасных поллютантов (Pb, Cd, Hg, Sn, As, V) и Se.
Задачи исследования:
1. Провести первичный биохимический скрининг лекарственных растений по содержанию аскорбиновой кислоты, флавоноидов (группы рутина) и каротина, а также оценить влияние природных условий среднетаежной подзоны на синтез низкомолекулярных антиоксидантов.
2. Определить количественное содержание низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбиновой (АК), дегидроаскорбиновой (ДАК) кислот, их метаболита - дикетогулоновоЙ кислоты (ДКГК), каротина, флавоноидов) и микроэлементов (V, Se, As, Pb, Cd, Sn, Hg) в растениях контрольных и нефтезаг-рязненных территорий.
3. Изучить зависимость синтеза низкомолекулярных антиоксидантов лекарственными растениями от количества поступающих в них токсичных элементов и величины содержания нефтепродуктов в почве.
4. Провести сравнительный анализ разных видов растений нефтезагряз-ненных территорий по особенностям накопления микроэлементов и возможностям адаптации к загрязнению нефтепродуктами.
5. Оценить влияние техногенных загрязнений территории г. Сургута на синтез кислот системы аскорбата, флавоноидов, родственных рутину и каротина,
6. Изучить возможность использования показателей содержания АК, ДАК, ДКГК, каротина и флавоноидов в растениях для экологического мониторинга состояния среды.
Положения, выносимые на защиту:
1. Лекарственные растения подзоны средней тайги (на территории ХМАО) имеют высокий потенциал низкомолекулярных веществ антиокси дантного действия.
2. Лекарственные растения нефтезагрязненных почв в значительной степени загрязнены токсичными микроэлементами, имеют повышенный уровень кислот системы аскорбата, суммы флавоноидов группы рутина и низкий уровень (каротина.
3. Высокий уровень содержания аскорбиновой, дегидроаскорбиновой, ди-кетогулоновой, кислот и суммы флавоноидов, а также низкий уровень содержания каротина являются следствием стрессофизиологической реакции на нефтяное загрязнение среды.
4. Концентрации аскорбиновой, дегидроаскорбиновой, дикетогулоновой кислот, флавоноидов и каротина Chamaenerion angustifolium и Artemisia vulgaris могут использоваться как биохимические маркеры для ранней диагностики негативного влияния нефтезагрязнений.
5. Влияние городских условий оказывает меньшее воздействие на физиологические процессы растений, чем нефтезагрязнение, что проявляется в более низком содержании пулов кислот системы аскорбата и в меньшем угнетении синтеза АК.
Научная новизна.
Впервые определено содержание каротина, биофлавоноидов группы рутина и кислот системы аскорбата, а также особо токсичных элементов: РЬ, Cd, Hg, Sn, As, V и Se в ряде видов лекарственных растений, произрастающих в Сургутском, Нефтеюганском и Нижневартовском районах ХМАО.
Изучено стрессовое воздействие нефтяного загрязнения почв на синтез низкомолекулярных антиоксидантов и накопление особо опасных поллютан-тов на примере лекарственных растений. Выявлены виды растений, наиболее подходящие для биологического контроля состояния среды.
Определено влияние загрязнения растений токсичными микроэлементами на синтез низкомолекулярных антиоксидантов и проведена оценка территории г. Сургута по степени загрязнения.
Практическая значимость. Результаты исследований могут быть использованы в качестве источника информации о витаминном составе и содержании токсичных элементов в лекарственных растениях ХМАО, пригодных к заготовке службами аптекоуправления и лесного хозяйства. Данные по содержанию БАВ у растений и накоплении в них токсичных элементов в зависимости от уровня нефтяного загрязнения среды могут быть применены для разработки методики биоиндикации и фиторемедиации нефтезагрязнен-ных земель. Они используются в курсах лекций "Экология и рациональное природопользование", "Растительный мир ХМАО", спецкурсах "Растительное сырьё" и "Фитоиндикация", читаемых на кафедре ботаники биологиче i ского факультета СурГУ.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях и симпозиумах: Международная научно-практическая конференция «Экология и безопасность жизнедеятельности» (Пенза, 2002); Окружная конференция молодых ученых ХМАО (Сургут, 2003); Всероссийская научная конференция: Северный регион: стратегия и перспективы развития (Сургут, 2003); Открытая окружная конференция молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2003); Международная научно-практическая конференция "Эколо-гические проблемы и здоровье населения на Севере" (Сургут, 2004); VI Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2005); VI Окружная конференция молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2005).
Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 печатных работ в материалах международных конференций, сборниках научных трудов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав (1 глава - обзор литературы, 2 глава - климато-географические условия, 3 глава - методы исследования 4, 5, 6 главы - собственные исследования), выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, из которых основной текст представлен на 108 страницах. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 9 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 162 источника, из них 136 отечественных и 26 зарубежных.
Автор выражает благодарность научному руководителю Шепелевой Л. Ф. за руководство написанием диссертации, научному консультанту Баранову Н. П. за руководство отработкой методик, Шепелеву А. И. за консультации по проведению анализов почвенных образцов, Ботирову Э. X. за ценные замечания по тексту диссертации, а так же студентам биологического и медицинского факультетов Макаровой А. В., Ганюшкину Л. В., Андреевских М, А., Повзуну А, А, за помощь в сборе и обработке материала.
Кислоты и ферменты системы аскорбиновой кислоты
Подробное описание состава кислот и ферментов аскорбиновой кислоты дано в монографии Г. Н. Чупахиной [127].
В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-Ь-гулоновой кислоты с эмпирической формулой С6Н806. Она обладает сильно выраженными восстанавливающими свойствами благодаря наличию в молекуле ди-энолыюй группы.
Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу (дегидроаскорбиновую кислоту - ДАК), этот процесс обратимый, и ДАК может вновь восстановиться до АК.
Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и двух электронов. При окислении АК в особых условиях за счет отдачи только одного протона возникает свободный радикал - монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная, реакционноспособная форма АК.
Переход АК в ДАК двухэтапный. На первом этапе две молекулы АК дают начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они дис-мутируют: одна молекула превращается в ДАК, другая - в АК.
Лактоновое кольцо в молекуле АК стабильно, а в ДАК легко гидролизу-ется с образованием кислоты с открытой цепью - 2,3-дикетогулоновой кислоты (ДКГК). Последняя может подвергаться окислительному распаду с образованием щавелевой и треоновой кислот.
Обмен АК в растениях связан с органическими кислотами и углеводами, которые в одних условиях являются субстратом в биосинтезе АК, а в других - для их образования используются фрагменты молекулы АК, полученные после ее деградации.
Таким образом, АК в растительных тканях может присутствовать в восстановленной форме, окисленной форме и в виде нестабильной монодегидроаскорбиновой кислоты. Восстановленная и окисленная АК находятся в свободном состоянии. Известны три связанные формы АК: аскорбиген - соединение АК с полипептидом; комплекс АК с витамином Р и, вероятно, еще с каким-то неизвестным веществом; третья связанная форма АК - это соединение АК с нуклеиновой кислотой через посредство минерального железа.
Обычно в растениях преобладает восстановленная форма АК. Накоплению ДАК препятствует ее нестабильность (особенно при рН выше 5), поэтому при измельчении тканей наблюдается быстрая потеря ДАК. Тем не менее, измеримые количества ДАК присутствуют во многих тканях.
Соотношение двух форм АК может служить показателем физиологического состояния растений: высокая интенсивность процессов жизнедеятельности - больше восстановленной АК, низкая интенсивность — растет содержание дегидроформы [127].
АК в чистых растворах с сильно кислой реакцией среды и в растительных соках с нормальной кислотностью (при рН ниже 7) не способна к самоокислению. Однако в других растворах на воздухе АК быстро окисляется. Катализирующее действие на процесс не ферментативного окисления АК оказывают гидроксильные ионы, двух - и трехвалентные металлы, особенно медь.
Известны четыре ферментные системы, принимающие участие в окислении АК. Это специфическая оксидаза АК - аскорбатоксидаза (1.10.3.3), цито-хром с-оксидаза (1.9.3.1.) [70], монофенол-монооксигеназа (1.14.18.1) [137] в присутствии полифенолов и пероксидаза (1.11.1.7) в присутствии перекиси водорода.
Аскорбатоксидаза - медьсодержащий фермент, окисляет АК кислородом воздуха, но имеет ограниченное сродство к кислороду. Механизм окисления АК пероксидазой и монофенол-монооксигеназой осуществляется с помощью хинонов. Коферментами пероксидаз являются различные фенольные соединения, они окисляются до хинонов, последние окисляют АК до ДАК.
Окислительно-восстановительные превращения АК - ДАК тесно связаны с системой глутатиона, в которой восстановление окисленного глутатиона катализируется ферментом глутатионредуктазой (1.6.4.2), а окисление идет при участии глутатиондегидрогеназы (аскорбата) (1.8.5.1).
Таким образом, система аскорбиновой кислоты растений включает АК, монодегидро-АК, ДАК, которые обладают витаминной активностью. ДКГК, образующаяся из ДАК, уже лишена биологической активности. Количественный анализ ДКГК может служить показателем направленности процессов в системе АК - ДАК, которая зависит от активности ферментов, окисляющих АК: аскорбатоксидазы, монофенол-монооксигеназы, цитохром с- окси-дазы и пероксидазы, а также фермента, восстанавливающего кислоты системы АК - монодегидроаскорбатредуктазы (1.6.5.4.)- В качестве восстановителя выступает система глутатиона. Высокий уровень АК стимулирует биосинтез аскорбатоксидазы и подавляет аскорбатредуктазу.
ДКГК растений практически не исследована, хотя следует подчеркнуть, что ее уровень дает информацию для понимания функционирования системы АК - ДАК.
Климат
Климат Западно-Сибирской равнины континентальный. Основными кли-матообразующими факторами этого района являются: солнечная радиация, циркуляция воздуха и подстилающая поверхность. Под влиянием этих кли-матообразующих факторов создается физико-географическая среда, общими чертами которой являются: отрицательный радиационный баланс, интенсивная циклоническая деятельность, общая неустойчивость и изменчивость погоды, резкие колебания метеорологических факторов [119].
ХМАО относится к гипокомфортным территориям с умеренно суровым климатом, с интенсивным природным и нарастающим антропогенным прессингом на здоровье людей [37, 119]. Основным неблагоприятным фактором зимой является холод, а летом - интенсивная ветровая деятельность. Для этого региона характерна очень суровая, сильно изменчивая погода зимой и холодная, умеренно холодная и сухая изменчивая погода летом.
Климат региона Среднего Приобья характеризуется суровой и продолжительной зимой с длительными морозами и устойчивым снежным покровом, сравнительно коротким летом с относительно высокими по сравнению с приполярным регионом температурами воздуха, поздними весенними и ранними осенними заморозками, короткими переходными сезонами.
Для региона характерна выраженная изменчивость метеоэлементов погоды. Межсуточная изменчивость давления воздуха составляет 10-15 гПА, межсуточные колебания температуры воздуха достигают 10-12С и зимой, и летом. В пределах таежной зоны сумма эффективных температур (выше 10"С) изменяется от 900 до 1600С, осадки за год - от 500 до 790 мм, а максимально возможное испарение — от 520 до 630 мм [119]. Средняя годовая длительность солнечного сияния составляет 1632 часа. [71].
Зима отличается большой продолжительностью и суровостью. Активная циклоничность определяет в это время большую изменчивость погоды с резкими перепадами атмосферного давления и колебаниями температуры воздуха, достигающими 15-20 градусов за сутки, сильными ветрами и метелями. Зимой наблюдается убывание количества часов солнечного сияния и в декабре оно достигает минимума - 14 часов [71]. Период ультрафиолетового голодания длится около 150 дней [119]. В зимний период особенности циркуляции атмосферы над Западно-Сибирской равниной обусловливают преобладание южных и юго-западных ветров [71].
Зима наступает рано - в последней декаде октября средняя суточная тем-пература устойчиво переходит через -5 С, устанавливается снежный покров, на реках отмечается ледостав. Самый суровый период зимы - с декабря по
а
февраль. Средние суточные температуры января составляют - 30-35 С [119], средняя скорость ветра в этом месяце доставляет 4,9 м/с [71]. По данным «Обзора состояния окружающей среды города Сургута» за 1993-2002 г.г. [71], средняя температура воздуха в январе составляет - 22 С, среднее минимальное значение достигает -38 С, тогда, как абсолютный максимум составляет +3 С.
Редкие потепления зимой обычно наблюдаются при порывах к северу южных циклонов и часто сопровождаются усилением ветра до 25-30 м/с, с буранами и метелями. В период с декабря по март наиболее часты метели. Годовое число дней с метелью в среднем - 60. Продолжительность залегания устойчивого снежного покрова (установление 23 октября, разрушение 4 мая) составляет 190 дней и больше. Устойчивые морозы заканчиваются только в первой декаде апреля, когда осуществляется переход средней суточной температуры воздуха через -5С. В это время день заметно увеличивается.
Весной большое количество моховых болот, которые в этот период начинают оттаивать, задерживает повышение температуры. Наибольшее повышение температуры наблюдается от марта к апрелю - до 10 С. В марте высота снежного покрова в отдельные годы составляет 70 см. Средняя температура мая положительная - от 3 до 6 С. Заморозки заканчиваются в первой половине июня. Для весны характерна солнечная неустойчивая погода. Теплая погода может сменяться резким похолоданием (абсолютный минимум -20,-30С).
Летний режим устанавливается к концу июня. Особенностью летнего периода являются большие запасы солнечного тепла и света. Лето сравнитель но короткое, теплые солнечные дни могут сменяться прохладными и пасмурными. Абсолютный максимум температуры воздуха (+34 С) приходится на июнь - июль. Средняя температура самого теплого месяца (июль) составляет + 17С. Безморозный период длится 90-100 дней. По данным «Обзора состояния окружающей среды города Сургута» за 1993-2002 г.г., продолжительность безморозного периода - 98 дней [71]. Заморозки появляются в конце августа или в начале сентября.
Осень наступает рано - в начале сентября. В октябре устанавливается отрицательный радиационный баланс. Отрицательная температура устанавли-вается в конце октября и образуется снежный покров. С переходом темпера-туры через 0 С быстро понижается средняя суточная температура, образование устойчивого снежного покрова происходит на границе второй и третьей декады октября [119].
Методы лабораторных исследований
Свежесобранные растения, очищенные и отмытые от остатков почвы, разбирались в лаборатории от посторонних примесей и взвешивались на электронных весах. Далее материал высушивался в затененной комнате с хорошей вентиляцией при комнатной температуре и периодически перемешивался. Листья и трава раскладывались тонким слоем.
Высушенный растительный материал был подготовлен к анализам: взвешен на электронных весах, измельчен на кофемолке и хранился в банках, снабженных этикетками с указанием названия растения, времени и места сбора, а так же сырого и сухого веса.
Проведено 1900 анализов на содержание БАВ в лекарственных растениях ХМАО. Исследование выполнено на базе лаборатории «Витаминов, микроэлементов и обмена веществ» Научно-исследовательского института Природопользовании и экологии Севера Сургутского государственного университета ХМАОЮгры (зав. лаборатории к.м.н., доцент Н. П. Баранов).
Исследование микроэлементного состава растений проводилось методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на базе лаборатории Центра Биотической медицины А. В. Скального (г. Москва).
Статистическая обработка полученных результатов анализов проведена с помощью программы Excel. Рассчитаны следующие показатели: среднее (М), дисперсия выборки (D), стандартное отклонение (8), доверительный интервал с Р=0,95, стандартная ошибка (т). Для определения достоверности различий использовался t-тест. Корреляционная зависимость между показателями определялась с помощью коэффициента корреляции Пирсона (г).
Для анализа растительных образцов использовалась методика Г. Н. Чупа-хиной [130] по определению аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикето-гулоновой кислот.
Метод количественного определения данных кислот основан на взаимодействии 2,4-динитро фенил гидразина с дегидроаскорбиновой (ДАК) и дике-тогулоновой (ДКГК) кислотами с образованием в присутствии серной кислоты соответствующих озазонов. Озазоны ДАК и ДКГК дают красное окрашивание, используемое для фотометрического определения.
Для нахождения суммы всех кислот АК окисляют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до ДАК, содержание восстановленной формы АК определяют по разности. При раздельном определении ДАК и ДКГК смесь подвергают действию восстановителей, при этом восстанавливаться в АК может только ДАК. В качестве восстановителя используется унитиол (димеркаптопропансульфонат натрия). При рН=7 унитиол в течение 10 минут восстанавливает ДАК в АК.
Ход анализа:
Навеску листьев (около 0,3 г) заливали в фарфоровой ступке 10 мл 5%-ной метафосфорной кислотой, и растирали. Гомогенат количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, объем доводили до метки метафосфорной кислотой; после встряхивания центрифугированием отделяли осадок (20 минут при 3000 об./мин).
В две градуированные пробирки с притертыми пробками наливали по 1,5 мл полученной вытяжки и в одну из них прибавляли по каплям 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд.
В третью пробирку наливали 1,5 мл вытяжки, приготовленной на растворе унитиола. Данная вытяжка готовится следующим образом: навеска листьев (около 0,3 г) растирается с раствором унитиола, переносится в мерную колбу на 25 мл, объем доводится до метки раствором унитиола, приготовленным на фосфатном буфере. Содержимое колбы необходимо встряхнуть, колбу поместить в холодильник на 10 минут - это время необходимо для восстановления ДАК в АК. Центрифугированием следует отделить осадок.
Белки, находящиеся в вытяжке, осаждали метафосфорной кислотой: к 16 мл центрифугата прибавляли 4 мл 5%-ной метафосфорной кислоты, выпавшие в осадок белки удаляли центрифугированием (15 минут, 3000 об./мин).
После этого во все три пробирки прибавляли по 0,5 мл 2,4-динитро фенил гидразина и доводили объем до 2,5 мл дистиллированной водой. Пробирки помещали в термостат на 20 минут при температуре 100С. По истечении указанного времени, пробирки переносили в ледяную баню и в каждую из них, было добавлено по 2,5 мл (тремя порциями) серной кислоты.
Через 1 час окрашенные растворы фотометрировались при длине волны 520 нм в кювете на 10 мм по сравнению с контрольным раствором, который готовился и обрабатывался как опытные, только вместо вытяжки использовался раствор 5%-ноЙ метафосфорной кислоты. По калибровочной кривой определяли, какой концентрации кислоты соответствует данная оптическая плотность.
