Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Свободные радикалы 11
1.2. Активированные кислородом метаболиты биологических систем... 15
1.2.1. Супероксидный анион-радикал 17
1.2.2. Перекись водорода 19
1.2.3. Гидроксильный радикал 20
1.2.4. Синглетный кислород 22
1.3. Молекулярные механизмы защиты от активированного кислорода . 24
1.4. Антиоксидантное действие каротиноидов 29
1.4.1. Действие света на накопление каротиноидов 36
1.4.2. Влияние различных температур на образование желтых пигментов 38
1.5. Антиоксидантное действие антоциановых пигментов 41
1.5.1 .Влияние светового фактора на образование антоцианов 44
1.5.2. Накопление антоциановых пигментов при действии различных температур 47
1.6. Антиоксидантное действие рутина 49
1.6.1. Влияние света на содержание рутина 58
Глава 2. Объекты и методы исследования 60
2.1. Объекты исследования 60
2.2. Методы исследования 60
Глава 3. Экспериментальная часть 63
3.1. Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в процессе вегетации представителей семейства Juglandaceae Lindl. всвязи с экологическими факторами 63
3.1.1. Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах растений рода Juglans L 63
3.1.2. Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах растений рода Pterocarya L 66
3.1.3. Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах растений рода Сагу a L 69
3.2. Сезонная динамика накопления антоциановых пигментов растениями семейства Juglandaceae Lindl. в период их вегетации в связи с экологическими факторами 72
3.2.1. Сезонная динамика накопления антоцианов в листьях и плодах растений рода Juglans L 72
3.2.2. Сезонная динамика накопления антоцианов в листьях и плодах растений рода Pterocarya 75
3.2.3. Сезонная динамика накопления антоцианов в листьях и плодах растений рода Carya L 78
3.3. Сезонная динамика накопления рутина в процессе вегетации у представителей семейства Juglandaceae Lindl. в связи с экологическими факторами 82
3.3.1. Сезонная динамика накопления рутина в листьях и плодах растений рода Juglans L 82
3.3.2. Сезонная динамика накопления рутина в листьях и плодах растений рода Pterocarya L 85
3.3.3. Сезонная динамика накопления рутина в листьях и плодах растений рода CaryaL 88
3.4. Сезонная динамика накопления каротиноидов у представителей семейства Juglandaceae L. в связи с экологическими факторами 91
3.4.1. Содержание каротиноидов в листьях и плодах растений рода Juglans L 91
3.4.2. Содержание каротиноидов в листьях и плодах растений рода Pterocarya L 95
3.4.3. Содержание каротиноидов в листьях и плодах растений рода CaryaL 98
3.5. Влияние света на содержание водорастворимых антиоксидантов в проростках ярового ячменя различных сортов 101
3.6. Содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях растений рода Amaranthus L 105
3.6.1. Изменение антиоксидантной активности в онтогенезе амаранта (Amaranthus tricolor L.) 105
3.6.2. Содержание водорастворимых антиоксидантов в водных экстрактах из высушенных листьев амаранта (Amaranthus tricolor L.) 106
3.6.3. Амарантин в водных экстрактах из высушенных листьев амаранта (Amaranthus tricolor h.) 110
Глава 4. Обсуждение результатов 112
Глава 5. Выводы 130
Список использованной литературы 131
Приложения 165
- Свободные радикалы
- Методы исследования
- Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах растений рода Juglans L
Введение к работе
Впервые на пагубное воздействие свободных радикалов на живые организмы в нашей стране обратил внимание Н.М. Эмануэль [Эмануэль, 1967, 1979]. В настоящее время роль свободных радикалов интенсивно изучается [Владимиров, 1992, 2000; Дюмаев, 1995; Гине, 1999, 2002; Зозуля, 2000; Мерзляк, 1999; Чиркова, 2002; Яшин, 2005, 2006, 2007; Меньшикова, 2006, 2007; Acworth, 1995; Flohe 1985; Larson, 1997; Tringali 2001; Bidlack, 2000; Dadali, 2007; Dorman,2007]. Установлена прямая связь между ростом содержания свободных радикалов и возникновением опасных заболеваний. Наибольшую опасность представляет цепное окисление полиненасыщенных жирных кислот (перекисное окисление липидов — ПОЛ), при этом образуются гидроперекиси, обладающие высокой реакционной способностью и повреждающим действием [Владимиров, 1972, 1987, 1991, 2000; Калашников, 1999; Курганова, 1997; Merzlyak, 1994].
Концентрация свободных радикалов возрастает под действием радиации, УФ облучения, воздействия других экологических факторов и из-за снижения активности естественной антиоксидантной системы [Яшин, 2005, 2006]. Растения обладают достаточной устойчивостью к окислительным повреждениям, которые возникают при воздействии различных внешних факторов или при резком изменении физиологического состояния растения. Это обусловлено существованием в растительной клетке эффективных защитных систем, основу которых и составляют низкомолекулярные антиоксиданты. [Мерзляк, 1999]. Экологический аспект накопления антиоксидантов в растениях начинает привлекать внимание исследователей [Кения и др., 1993; Карташов и др., 2008; Радюкина и др., 2008; Яшин, 2007; Vladimirov, 2007; Zenkevich et al., 2007] и нуждается в дальнейшем изучении.
Цели и задачи исследования.
Целью данного исследования явилось изучение влияния экологических факторов на накопление антоцианов, рутина, каротиноидов и суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов в растениях.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить влияние экологических факторов (свет, температура) на
формирование пула водорастворимых антиоксидантов, антоцианов, рутина и
каротиноидов в листьях и плодах семи видов растений семейства
Juglandaceae Lindl. в процессе вегетационного развития.
2. Исследовать действие света на содержание водорастворимых
антиоксидантов в листьях ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) сортов Эльф
и Турингия.
3. Изучить зависимость адаптационных возможностей растений сем.
Juglandaceae Lindl. от содержания в них антиоксидантов.
Научная новизна.
Впервые исследовано суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах семи видов растений сем. Juglandaceae Lindl. (род Juglans L.: Juglans cordiformis Maxim., Juglans regia L., Juglans rupestris Engelm.; род Pterocarya L.: Pterocarya pterocarpa (Michx.) Kunth, Pterocarya stenoptera DC; род Carya L.: Carya tomentosa (L.) Mutt, {alba Koch C), Carya cordiformis (Wangh.) Koch С.) и некоторых травянистых и злаковых растениях. Впервые исследована динамика накопления антоциановых пигментов, рутина и каротиноидов в период вегетации представителей двух родов: Pterocarya L. и Carya L. семейства Juglandaceae Lindl. Для всех исследованных видов показана обратная корреляционная зависимость между температурой окружающей среды и уровнем антоцианов в листьях, а также между содержанием антоциановых пигментов в листьях и плодах. Отмечена положительная корреляция с высокой степенью
сопряженности между интенсивностью света и содержанием рутина в листьях, а также между накоплением рутина в листьях и плодах растений.
Обнаружено высокое суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в молодых листьях, важного в практическом отношении растения амаранта. Показана устойчивость антиоксидантного пигмента — амарантина при высушивании листьев и последующей водной экстракции.
Выявлено положительное влияние света на накопление водорастворимых антиоксидантов в листьях ярового ячменя двух сортов Эльф и Турингия.
Основные защищаемые положения.
Суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях растений семи видов сем. Juglandaceae Lindl. в период их вегетации положительно не коррелирует с интенсивностью света и температурой.-
Свет (1=61x10 Лк, экспозиция 24 часа) стимулирует накопление водорастворимых антиоксидантов в листьях ярового ячменя (Hordeum,vulgarе L.) сортов Эльф и Турингия.
Начальный период вегетации (1—3 недели) семи видов сем. Juglandaceae Lindl. характеризуется самыми высокими показателями содержания водорастворимых антиоксидантов, антоцианов и рутина.
Пул водорастворимых антиоксидантов растений сем. Juglandaceae Lindl. может быть показателем их адаптационных возможностей.
Практическая значимость.
Дана количественная оценка суммарного содержания водорастворимых антиоксидантов, антоцианов, рутина и каротиноидов в плодах семи видов семейства Juglandaceae Lindl. Полученные данные по содержанию водорастворимых антиоксидантов рекомендуется использовать при решении вопроса о перспективности интродукции растений этого семейства.
Определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в листьях важного в практическом отношении растения амаранта, показана
устойчивость его антиоксидантного пигмента — амарантина при высушивании листьев и последующей водной экстракции.
Данные исследований используются в учебном процессе в курсах «Экология растений», «Физиология растений», «Биохимия растений», «Рациональное питание», «Витаминология» на факультете биоэкологии РГУ им. И. Канта.
Апробация результатов работы.
Результаты исследований и материалы диссертационной работы представлялись на: VII Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (г. Пущино, 2007 г.); Всероссийской internet-конференции (с международным участием) «Проблемы экологии в современном мире» (г. Тамбов, 2007 г.); 5-ой национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (г. Смоленск, 2007 г.), 11-th International Congress Phytopharm - 2007 (Leiden, 2007), VIII международная научно-методическая конференция «Интродукция нетрадиционных и редких растений» (г. Мичуринск, 2008 г.), SFRR - Europe Meeting 2008 «Free Radicals and Nutrition: Basic Mechanisms and Clinical Application» (Berlin, 2008), 1-ая Международная научно - практическая конференция «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Тенденции и перспективы» (г. Одинцово, 2008 г.), 8-th International Conference VITAMINS «Nutrition and Diagnostics» (Zlin, 2008).
Основные результаты докладывались и обсуждались на заседаниях кафедры ботаники и экологии растений и кафедры медицинской экологии РГУ им. И. Канта (2005, 2006, 2007, 2008 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, 1 работа находится в печати.
Структура и объём диссертации.
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка использованной литературы, приложения. Общий объем работы составляет 173 страницы, из которых основной текст занимает 130 страниц. Список литературы содержит наименований 319, из них 157 на иностранных языках. Иллюстративный материал представлен 3 таблицами и 46 рисунками.
Благодарность.
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору Галине Николаевне Чупахиной за помощь, поддержку, ценные советы и рекомендации, внимательное отношение к работе, мудрость и терпение. Благодарность также выражена всем сотрудникам кафедры медицинской экологии факультета биоэкологии РГУ им. И. Канта и особенно к.б.н. Татьяне Сергеевне Ивановой, к.б.н., доц. Павлу Владимировичу Масленникову; сотрудникам кафедры ботаники и экологии растений факультета биоэкологии РГУ им. И. Канта и особенно к.б.н., доц. Наталье Григорьевне Петровой, к.б.н. Марине Викторовне Куркиной, к.б.н., доц. Елене Юрьевне Головиной, к.б.н. Дмитрию Ефимовичу Петренко, Ирине Ивановне Рудьковой; директору Ботанического сада РГУ им. И. Канта Яковлевой Татьяне Александровне за помощь в работе, ценные советы и рекомендации, заведующей лабораторией неорганической и аналитической химии Тамаре Геннадьевне Бондаренко.
Автор признателен и благодарен начальнику Госсемоинспекции Корнеевой Марии Гавриловне и заместителю Летучих Лидие Владимировне за предоставление сертифицированного материала для проведения исследований.
Особую благодарность и искреннюю признательность автор выражает членам своей семьи за поддержку, понимание и большое терпение на всех этапах исследовательской работы и особенно Дмитрию Викторовичу, Ирине Александровне, Екатерине, Виктору и Юрию Викторовичу.
Свободные радикалы
Впервые на пагубное воздействие свободных радикалов (СР) в биосистемах в нашей стране обратил внимание Н.М. Эмануэль [Эмануэль, 1967, 1979]. В настоящее время роль свободных радикалов в организме человека интенсивно изучается во многих странах мира [Владимиров, 2000; Дюмаев, 1995; Зозуля, 2000; Мерзляк, 1999; Acworth, 1995; Flohe 1985; Larson, 1997; Tringali 2001; Bidlack, 2000; Dadali, 2007; Dorman,2007]. В последнее десятилетие проявляется большой интерес к определению антиоксидантной активности биологически активных веществ, пищевых продуктов и напитков. Научно установлена прямая связь между ростом содержания свободных радикалов и возникновением наиболее опасных заболеваний. Концентрация СР возрастает из-за снижения активности естественной антиоксидантной системы человека, связанной с воздействием радиации, УФ облучения, курения, алкоголизма, постоянных стрессов, инфекционных болезней, некачественного питания. Это состояние называется окислительным стрессом. За счет вредных воздействий СР повреждаются стенки сосудов, мембраны, окисляются липиды. Наибольшую опасность представляет цепное окисление полиненасыщенных жирных кислот (перекисное окисление липидов - ПОЛ), при этом образуются гидроперекиси, обладающие высокой реакционной способностью и повреждающим действием. [Яшин Я.И. 2005, 2006].
В органических молекулах (включая те, из которых состоит организм человека) электроны на внешней электронной оболочке располагаются парами — одна пара на каждой орбитали. Свободные радикалы отличаются от обычных молекул тем, что у них на внешней электронной оболочке имеется неспаренный (одиночный) электрон. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо отдать лишний электрон. Итак, свободные радикалы - это молекулярные частицы, на внешней орбитали которых имеются неспаренные электроны. Радикалы обладают высокой реакционной способностью, и их стационарная концентрация в клетках всегда очень мала [Владимиров, 2000].
В настоящее время современные методы исследований позволяют выявлять наличие в биологических системах от 300 до 800 разных органических радикалов. Это могут быть радикалы липидов, белков и низкомолекулярных пептидов, нуклеиновых кислот, фенолов, неорганических молекул [Меньщикова, 2006]. В присутствии кислорода основная часть органических радикалов переходит в перекисные радикалы. Большое разнообразие кислородных радикалов и продуктов неполного восстановления кислорода создаёт определённые трудности их классификации. Первоначально все радикалы, образующиеся в живом организме, было принято делить на свободные, которые легко мигрируют в водных или липидных средах, и связанные, структурно закреплённые и участвующие в цепях переноса электронов. Такое деление было достаточно условным, поскольку непонятно к свободным или связанным относятся в таком случае убисемихинонные радикалы, которые достаточно легко перемещаются в липидных мембранах.
В последующем ввели такие понятия как «активные формы кислорода и азота», «активные формы хлора», «активные формы липидов». На сегодняшний день, на взгляд большинства исследователей, наиболее удачная классификация таких соединений предложена Ю. А. Владимировым, согласно которой все образующиеся в организме свободные радикалы в зависимости от происхождения могут быть разделены на природные и чужеродные [Владимиров, 2000]. В свою очередь, природные формы можно разделить на первичные, вторичные и третичные; среди причин появления чужеродных форм свободных радикалов также можно выделить три основных фактора: радиация, оптические излучения и ксенобиотики (таблица 1).
Методы исследования
В качестве объектов исследования использовались древесные растения семейства Juglandaceae Lindl. трех родов: рода Juglans L.: Juglans cordiformis Maxim, (орех сердцевидный) — интродуцент с Дальнего Востока; Juglans regia L. (орех грецкий) — интродуцент с Кавказа; Juglans rupestris Engelm. (орех скальный) - интродуцент из Северной Америки; рода Pterocarya L.: Pterocarya pterocarpa (Michx.) Kunth (лапина крылоплодная) — интродуцент из Китая, Pterocarya stenoptera DC. (лапина узкокрылая) - интродуцент из Китая; рода Сагуа L.: Сагуа tomentosa (L.) Mutt, {alba Koch С.) - кария войлочная (белая) - интродуцент из Германии, Сагуа cordiformis (Wangh.) Koch С. (кария сердцевидная) - интродуцент из Германии, произрастающие на территории Ботанического сада Российского государственного университета имени Иммануила Канта. Растения этого семейства широко интродуцируются на территории Калининградской области.
Анализировались листья побегов, сформированные из верхушечной почки, у которой использовали срединную часть средних листочков листьев, а также ядра зрелых плодов растений. Сбор растительного материала для анализов проводился в периферической части кроны на высоте 3 — 4 м в утренние часы (9- 10 ч) [Методические ..., 1980].
Изучались листья растений ярового ячменя {Hordeum vulgare L.) сортов Эльф и Турингия, озимой ржи {Secale cereale L.) сорта Пуховчанка. Для исследования использовали первые и вторые развернутые листья.
Исследовались листья амаранта {Amarantus tricolor L.) сорт Валентина в период онтогенеза из коллекции ВНИИССОК.
Фенологические наблюдения представителей семейства Juglandaceae Lindl. проводились по методике ГБС РАН в модификации Г.Н. Зайцева [Зайцев, 1981]. Фиксировались следующие стадии развития растений:
1 - начало вегетации (фаза появления зеленого конуса листа);
2 - начало цветения (распускание первых сережек);
3 - конец цветения (менее половины цветков с околоцветниками или менее чем у половины цветков тычинки производят пыльцу, а столбики более половины цветков завяли или засохли);
4 - стадия плодоношения (растение со зрелыми плодами);
5 - конец вегетационного периода (фаза массового раскрашивания
листьев, когда более 50% листьев приобретают осеннюю окраску).
Степень одревеснения побегов определили на 1 октября в процентах от общей длины побега [Опыт интродукции ..., 1973].
Зимостойкость определялась путём визуального обследования с оценкой по 25-бальной шкале (7 групп), предложенной отделом дендрологии ГБС АН [Опыт интродукции..., 1973]:
1 - обмерзаний нет (25 баллов)
2- единичное обмерзание верхушечных почек и концов однолетнего
прироста (20 баллов)
3 - массовое обмерзание однолетнего прироста (15 баллов)
4- единичное обмерзание 2-3 - летних побегов (10 балов)
5. - обмерзание 1/3-1/2 части кроны (5 баллов)
6. - обмерзание надземной части кроны (3 балла)
7. - полная гибель дерева.
Анализы проводились еженедельно в течение вегетационного периода с мая по октябрь 2007 г. В ходе сбора растительного материала фиксировалась температура и интенсивность света, которая определялась люксметром-яркомером Аргус—12. В течение всего исследования рассчитывалась сумма эффективных температур ( 5С).
Размеры делянок и схемы посева амаранта осуществлялся по ГОСТ 4671-78 (делянки и схемы посева в селекции, сортоиспытании и первичном семеноводстве овощных культур). Фенологические наблюдения растений и промеры проводились в соответствии с методическими указаниями по изучению зеленных культур, разработанных в ВИРе.
Растения ярового ячменя и озимой ржи выращивались до 10-ти дневного возраста в установке «Флора» ТКШ - 1 с люминисцентными лампами SLU 30/26 - 735 (интенсивность света 61 х 10 Лк). Интенсивность света определяли люксметром-яркомером Аргус-12.
Содержание водорастворимых антиоксидантов определялось по методике Яшина Я.И. на приборе «ЯУЗА ААА-01» [Яшин Я.И., 2005], которая позволяет определить активные природные антиоксиданты, имеющие фенольную природу (природные полифенолы, фенольные гидрооксикислоты, разные типы флавоноидов, витамины и др.). Каротиноиды [Полевой, Максимова, 1978], антоциановые пигменты [Муравьева и др., 1987], амарантин исследовали спектрофотометрически [Piattelli et al., 1969]. Количественный уровень рутина определялся по методике Кушмановой [Кушманова, Ивченко, 1974]. Содержание исследуемых веществ представлено в мг или мкг на грамм сырой массы или сухой массы (содержание амарантина и водорастворимых антиоксидантов в водных экстрактах).
Сезонная динамика накопления водорастворимых антиоксидантов в листьях и плодах растений рода Juglans L
Таким образом, изучение сезонной динамики накопления рутина в листьях семи видов растений семейства Juglandaceae Lindl. в период их вегетации показало, что у всех исследованных видов максимальные значения содержания рутина в листьях были отмечены в начальный период (1-ая - 3-яя недели). Начиная с начала июня, произошло снижение уровня рутина, которое продолжалось до конца вегетации. При этом в отдельные недели наблюдались незначительные отклонения от средних значений. Итак, среди семи исследованных видов растений семейства Juglandaceae Lindl. максимальный уровень рутина в листьях был отмечен у J. cordiformis.
Выявлена положительная корреляционная зависимость со средней степенью сопряженности (г= 0,703; г= 0,62; г= 0,63 для J. cordiformis, J. regia и J. rupestris соответственно; i= 0,51 для P. pterocarpa и r= 0,52 для P. stenoptera , r= 0,67 для С. tomentosa и і- 0,65 для С. cordiformis) между интенсивностью света, фиксировавшейся в дни анализов, и содержанием рутина в листьях.
Все плоды семи исследованных видов растений сем. Juglandaceae Lindl. содержали рутин. В период созревания плодов было отмечено снижение содержания рутина в ядрах. Пул рутина в плодах растений в конце вегетации было несколько ниже, чем в листьях в данный период. Сравнение содержания рутина в листьях и плодах семи исследуемых видов показало, что те виды, в листьях которых было больше рутина, отличались и более высокой Р-витаминной ценностью плодов. Между накоплением рутина в листьях и плодах растений была отмечена положительная корреляция с высокой степенью сопряженности (г= 0,92; г= 0,81; для видов J cordiformis и J. regia соответственно; r= 0,93 для P. pterocarpa; r= 0,69 для P. stenoptera; r= 0,62 для С. tomentosa; r= 0,86 для С. cordiformis).
Уровень рутина у изученных видов растений зависел от интенсивности света. Для них была выявлена прямая корреляционная зависимость между интенсивностью света и уровнем рутина в плодах (г= 0,82; г= 0,73; для видов J. cordiformis и J. regia соответственно; г= 0,85 для P. pterocarpa; г= 0,62 для P. stenoptera; г= 0,61 для С. tomentosa; г= 0,79 для С. cordiformis).
