Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 6
2. Обзор литературы 10
2.1 .Общие понятия о везикулярном транспорте 10
2.2. Рецептор эпидермального фактора роста 12
2.2.1. Общие сведения о рецепторе ЭФР 12
2.2.2. Сигнальные молекулы, связанные с рецептором ЭФР 14
2.3. Общая схема РОЭ 14
2.4. Регуляция РОЭ 18
2.4.1. Белки, участвующие в интернализации ЭФР-рецепторных комплексов 18
2.4.2. Белки, опосредующие слияние мембран 21
2.4.3. Белки, участвующие в переходе из ранних в поздние эндосомы 23
2.5. Фосфатидилинозитол-киназы 26
2.6. Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ 30
2.6.1. Убиквитинирование 30
2.6.2. Протеасомы и их ингибиторы 34
2.6.3. Убиквитин-лигаза с-СЫ 35
3. Материалы и методы 45
3.1. Культивирование клеточных линий 45
3.2. Получение йодированного ЭФР 45
3.3. Обработка клеток ингибиторами 46
3.4. Стимуляция эндоцитоза 46
3.5. Субклеточное фракционирование в градиенте плотности 17%Перколла 47
3.6. Получение мембранных фракций 48
3.7. Получение тотально-клеточного лизата 48
3.8. Иммунопреципитация 48
3.9. Электрофоретическое разделение белков 49
3.10. Иммуноблотинг 49
3.11. Иммунофлуоресценция 49
3.12. Антитела 50
4. Результаты 52
4.1. Участие протеасом в эндоцитозном процессинге рецептора ЭФР 52
4.2. Влияние ингибитора протеасом MG132 на эндоцитоз рецептора ЭФР 56
4.3. Влияние MG132 на динамику компартментализации ЭФР-рецепторных комплексов 58
4.4. Исследование возможного влияния MG132 на функционирование лизосом 64
4.5. Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков 67
4.6. Влияние ингибитора протеасом MG132 на убиквитинирование рецептора ЭФР и его взаимоотношения с убиквитин-лигазой с-СЫ 69
4.7. Анализ поведения рецептора ЭФР, ассоциированного с убиквитин-лигазой с-СЫ, во фракциях ранних и поздних эндосом/лизосом 75
4.8. Участие РІЗ-киназ I и III классов в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР 80
4.9. Взаимоотношение убиквитин-лигазы с-СЫ и РІЗК в процессе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов 83
5. Обсуждение 85
Выводы 96
- Общая схема РОЭ
- Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ
- Получение мембранных фракций
- Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков
Введение к работе
Ащальностьпроблемы.
Сигналы, стимулируемые эпидермальным фактором роста (ЭФР), играют исключительно важную роль на ранних стадиях формирования клеток эпителиальной линии, в регуляции пролиферации и дифференцировки/дедифференцировки зрелых клеток различных тканей, в регуляции выживаемости и подвижности клеток, а нарушения в их функционировании зачастую приводит к злокачественной трансформации. Биологические эффекты ЭФР опосредуются в клетке его рецептором - трансмембранным белком, цитоплазматический домен которого обладает тирозинкиназной активностью. Рецепторы ЭФР чрезвычайно широко экспрессируются различными типами клеток.
Взаимодействие ЭФР с рецептором стимулирует два ряда событий: с одной стороны, инициируются каскадные сигнальные пути, с другой стороны, происходит поступление ЭФР-рецепторных комплексов внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние эндосомы (РЭ), где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану (ПМ), а остальные попадают в предлизосомальный компартмент, называемый поздними эндосомами (ПЭ), после чего деградируют в лизосомах (Никольский и др., 1987). В последние годы появляются данные, отводящие рецептору, находящемуся в эндосомах (как ранних, так и поздних), самостоятельную роль в реализации сигнала, стимулируемого ЭФР. В связи с этим изучение механизмов регуляции вступления рецептора на путь деградации и продвижения по нему приобретает большое значение.
Несмотря на длительную историю исследований, ответа на вопрос о том, как именно происходит сортировка ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации (т.е. переход из РЭ в ПЭ), до сих пор нет. Все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию так называемых мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schlessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Молекулярные основы этого
процесса неясны. В настоящее время можно считать установленным, что для перехода в ПЭ рецептор ЭФР должен обладать активированной тирозинкиназой (ТК) (Благовещенская и др., 1994). Известен также ряд белков и белковых комплексов, нарушения в функционировании которых в той или иной степени нарушают доставку рецепторов в лизосомы. Это фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), убиквитин-лигаза с-СЫ, адапторный белок SNX1, субстрат рецепторной тирозинкиназы HRS, комплексы ESCRT I, II, III и др. Сайты действия этих белков не всегда известны, а механизм координации их действия практически не изучен.
Давно показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию -пострансляционной модификации, заключающейся в ковалентном присоединении убиквитина к остаткам лизина, содержащимся в молекуле рецептора (Galcheva-Gargova et al,, 1995). Убиквитинирование, как известно, является маркером для деградации на протеасомах (Wilkinson, 2000; Myuang et al., 2001), однако в последнее время появились указания на то, что убиквитинирование может быть необходимо также для интернализации и включения лиганд-рецепторных комплексов во внутренние пузырьки МВЭ (Dupre et al., 2001). Показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию убиквитин-лигазой с-СЫ (Levkowitz et al., 1999). Данные о том, на каком этапе с-СЫ ассоциируется с рецептором, как долго сохраняется комплекс, каков статус убиквитинирования рецептора, т.е количество убиквитинов и убиквитиновых цепочек, присоединенных к одной молекуле рецептора, так же как и «молекулярный» смысл этой модификации, противоречивы и неполны. Не исключена вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой и подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, вовлекающим его на путь лизосомальной деградации. Существует ряд работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva et al., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Melman et al., 2002) и рецепторов гормона роста (Takagi et al., 2001). Подобное заключение делается ими на основании того, что ингибиторы активности протеасом, в частности, наиболее широко применяемый синтетический ингибитор MG132, подавляют процессинг рецепторов по лизосомальному пути. Этими авторами, однако, не анализируется и не учитывается неоднозначность действия MG132 на клетку. Таким образом, вопрос о том, насколько протеасомы вовлечены в регуляцию внутриклеточного процессинга рецепторов ЭФР на поздних стадиях эндоцитоза, и какова роль убиквитинирования рецептора, остается открытым.
Цепи и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы проанализировать возможное участие протеасом в регуляции разных стадий эндоцитоза рецептора ЭФР, а также исследовать поведение убиквитинирующего рецептор белка с-СЫ в процессе эндоцитоза. В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:
-
Проанализировать влияние ингибитора протеасом MG132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, определить, на каком этапе он действует;
-
Изучить поведение убиквитин-лигазы с-СЫ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;
-
Сравнить спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в различных эндосомапьных компартментах;
-
Идентифицировать фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в" регуляции сортировки рецептора ЭФР в поздние эндосомы;
-
Определить последовательность действия с-СЫ и РІЗК в ходе эндоцитоза. Основныеположения,выносимыеназащиту,
-
Рецептор ЭФР в эндосомах не является непосредственной мишенью действия протеасом.
-
Убиквитинирование рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различно; высокоубиквитинированные формы составляют относительно небольшую долю общего пула интернализованного рецептора, и именно эти формы преимущественно сортируются в поздниеэндосомы.
-
Синтетический ингибитор протеасом MG132 может замедлять как переход ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, так и взаимодействие поздних эндосом с лизосомами, основной сайт его действия зависит от скорости процесса эндоцитоза в конфетных клетках, а механизм связан в основном с истощением пула свободного убиквитина
-
Убиквитин-лигаза с-СЫ после стимуляции эндоцитоза ассоциируется с рецептором ЭФР как Б ранних, так и в поздних эндосомах, при этом сайт ее первоначального действия находится выше по эндоцитозному пути, чем сайт действия фосфатидилинозитол-3-киназы.
-
В регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы вовлечена не РІЗК I класса р85\р110, а РІЗК III класса hVPS34.
Научная новизна.
Впервые показано, что спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различается.
Впервые подробно изучен механизм действия синтетического ингибитора протеасом MG132 на эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов. Впервые показано, что MG132 может действовать на разных этапах эндоцитоза, в зависимости от скорости прохождения рецептора поэндоцитозномупути.
Впервые экспериментально обосновано предположение о том, что ингибиторы протеасом оказывают влияние на эндоцитоз рецепторов ЭФР не непосредственно, а в основном за счет истощения пула свободного убиквитина.
Идентифицирована вортманнин-чувствительная Р13-киназа hVps34, участвующая в регуляции сортировки рецепторов ЭФР на путь лизосомальной деградации Впервые продемонстрировано, что активируемая рецептором ЭФР Р13-киназа р85\р110 не имеет отношения к регуляции эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов
Теоретическоеипрактическоезначениеработы.
Появившиеся в последнее время данные о возможной самостоятельной роли интернализованных рецепторов ЭФР в проведении и\или инициации сигналов, стимулируемых ЭФР, повышают важность исследований, связанных с регуляцией эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, особенно пути, ведущего к лизосомальной деградации. Понимание молекулярной организации и регуляции внутриклеточного процессинга рецепторов позволит создать обобщенную картину функционирования ЭФР-зависимой системы сигнализации. Учитывая широкий спектр клеточных процессов, регулируемых ЭФР, эти данные могут оказаться весьма важными для выработки практических стратегий при лечении ряда заболеваний и повреждений (от заживления послеожоговых ран до антираковой терапии). Результаты проведенного нами исследования по влиянию MG132 на эндоцитоз показывают, что выводы о вовлечении протеасом в регуляцию того или иного процесса на основании применения только одних ингибиторов протеасом делать неправомочно
Апробация работы.
По теме диссертации опубликованы 7 печатных работ (4 статьи). Основные положения были доложены и обсуждались на 41-ой конференции Американского общества клеточной биологии (Вашингтон, 2001), на 14-ой Европейской студенческой конференции (Берлин, 2003), на первом съезде Российского общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003) и на научных семинарах Лаборатории физиологии клеточного цикла Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
Общая схема РОЭ
Через сайты автофосфорилирования происходит взаимодействие рецептора с белками, обладающими SH2 (Src homology 2) или РТВ (phosphotyrosine binding) доменами (Pawson, Schlessinger, 1993; Margolis, 1999). SH2 домен представлен консервативной последовательностью, состоящей примерно из 100 АО и способной узнавать специфические тирозин-фосфорилированные мотивы из 1-6 АО, располагающиеся рядом с фосфорилированным тирозиновым АО (pY) с С-терминальной стороны (Songyang et al., 1993). РТВ домены связываются с pY в контексте последовательности из 3-5 АО, расположенной с N-терминальной стороны по отношению к тирозину. РТВ домены способны узнавать также и нефосфорилированные тирозины (Margolis, 1999). Как правило, 5Н2-содержащие белки подразделяют на два класса. Так, к первому классу относят белки (Grb2, Nek, She и др.), имеющие исключительно структурные, например, SH2- и SH3- (последовательность, специфически узнающая пролин-богатые участки) домены, и функционируют как адаптеры для присоединения белков, обладающих ферментативной активностью (McCormick, 1993). Представители второго типа 8Н2-содержащих белков, помимо SH2 доменов имеют собственную активность, например Src-киназы, PI3 (фосфоинозитол 3) -киназы, фосфолипаза Су, (Carpenter, 1992; Ullrich and Schlessinger, 1990), а также убиквитин-лигаза c-Cbl и др. (Lewkovitz et al., 1998). 2.3. Общая схема РОЭ. Современные представления об организации РОЭ представлены на схеме 1. Одновременно с запуском сигнальных каскадов ЭФР-рецепторные комплексы начинают латерально перемещаться по мембране, и, в конце концов попадают в клатрин-окаймленные ямки, где они собираются в виде агрегатов. Клатрин-окаймленные ямки специализированные небольшие (100-150нм) районы мембраны, которые с цитоплазматической стороны покрыты белком клатрином. Через некоторое время клатрин-окаймленные ямки отпочковываются от ПМ, формируя пузырьки. В течение короткого времени клатрин отделяется от окаймленного пузырька, возвращаясь при этом обратно к внутренней поверхности ПМ. Процесс освобождения клатрина осуществляется с помощью АТРазы Hsc70 и белка ауксилина (Ungewiekell et al., 1995). Такой неокаймленный пузырек доставляет ЭФР-рецепторные комплексы в электронно-прозрачные везикулы, так называемые ранние эндосомы (РЭ), обладающие тубулярными выростами и локализованные в основном в периферической части клетки. (Никольский и др., 1987, Железнова и др. 2001).
Термин "эндосомы" используется для определения всех внутриклеточных нелизосомальных компартментов, опосредующих поступление экзогенных веществ в клетку. ЭФР-рецепторные комплексы распределены как в тубулярной, так и в везикулярной частях ранних эндосом. Из везикулярной части впоследствии образуются поздние эндосомы (ПЭ), тогда как из тубулярной части ЭФР-рецепторные комплексы рециклируют обратно на ПМ. До сих пор остается открытым вопрос как происходит переход лиганд-рецепторных комплексов из ранних в поздние эндосомы. В настоящее время нет единого мнения по этой проблеме, однако в последнее время все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schlessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Ha тонких криосрезах мультивезикулярные тела видны как крупные органеллы диаметром 1-2 мкм, содержащие мелкие внутренние везикулы. Отличительной особенностью является преимущественная локализация ЭФР-рецепторного комплекса во внутренних везикулах МВЭ (Miller et al., 1986). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ или МВЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Созревание сопровождается последовательными биохимическими изменениями мембран, маркеры ранних эндосом удаляются за счёт рециклирования на ПМ, а маркеры поздних эндосом доставляются из TGN (Trans Golgi Network), а также формированием внутренних везикул. Показано, что поздние эндосомы локализуются в околоядерной области, часто окружая центриоли (Smythe, Warren, 1991). Поздние эндосомы рассматривают как предлизосомальный компартмент, в котором содержатся активные протеолитические ферменты, некоторые маркеры рециклирования и белки секреторного пути. Предлизосомальный компартмент отличается от зрелых лизосом наличием маннозо-б-фосфатного рецептора, морфологией на криосрезах (цистернообразные выпячивания и выросты, неправильная форма) и отсутствием некоторых гидролаз (Griffiths, 1992). Через определенное время ЭФР-рецепторные комплексы обнаруживаются в органеллах, имеющих классические биохимические и морфологические признаки "зрелых" лизосом (Haigler et al., 1979). В наиболее общем виде лизосомы определяются по наивысшему содержанию кислых гидролаз и наиболее низкому значению рН (Kornfleld and Mellman, 1989). Однако справедливость этого положения в значительной степени является вопросом терминологии, поскольку границы между поздними эндосомами и лизосомами, также как и в случае ранних и поздних эндосом, достаточно неопределенны и в значительной степени зависят от точки зрения исследователя на биогенез лизосом. Согласно представлениям Поля Люцио (Luzio et al., 2000), последней стадией эндоцитозного пути является образование «гибридной» везикулы, получающейся в результате слияния полностью созревшей мультивезикулярной поздней эндосомы и «первичной» лизосомы, содержащей полный набор гидролаз. Это объединение носит временный характер, и после гидролиза белков, содержащихся в люмене и в мембранах внутренних пузырьков МВЭ, происходит сегрегация мембран и машинерии МВЭ и лизосомы, и последняя отделяется от МВЭ. Однако есть и другие точки зрения на данный вопрос. 2.4. Регуляция РОЭ. 2.4.1. Белки, участвующие в интернализации ЭФР-рецепторных комплексов. Упаковка лиганд-рецепторных комплексов в окаймленные ямки, инвагинация и превращение окаймленных ямок в окаймленную везикулу требуют, по крайней мере, несколько десятков белков. Один из них белок клатрин. Единицей клатринового комплекса является трискелион, основу которого составляют три тяжелые и три легкие цепи клатрина.
Тяжелые цепи клатрина по всей вероятности обеспечивают структуру трискелиона, роль легких цепей в формировании окаймления остается до сих пор невыясненной (Hirst et al., 1998). Первоначально предполагали, что определенный домен рецептора ЭФР непосредственно связывается с клатрином, но при дальнейшем изучении прямого взаимодействия между этими двумя белками не обнаружили. Тем не менее, были идентифицированы комплексы, осуществляющие связь между рецептором и клатрином, так называемые адапторные комплексы или АР (assembly protein). На данный момент описали несколько адапторных комплексов, из них АР-2 функционирует на плазматической мембране и входит в состав клатрин-окаймлепных ямок. Некоторые исследователи склоняются к тому, что АР2 способен напрямую связываться с мембраной через белок синаптотагмин (Zhang et al., 1994), кроме того для данного связывания предполагается наличие активной PLD и ее кофактора Р1(4,5)Р2 (фосфоинизитид 4,5, -бифосфат) (West et al., 1997). АР-2 комплексы взаимодействуют также с другими белками, входящими в состав клатрин-окаймленных ямок, например динамином, амфифизином, Epsl5 и др. тем не менее, каким образом и в какой последовательности эти белки реализуют свои функции, до сих пор неизвестно. Динами н содержит пролин-богатый участок, который способен контактировать с SH3-доменом молекулы амфифизина и/или АР-2 комплекса, РН - домен, обеспечивающий взаимодействие динамина с Р1(4,5)Р2 и ответственный за нацеливание на мембрану (Achiriloaie et al., 1999). Также, показано наличие ГТФ-связывающего домена и ГТФаза-эффекторного домена (GED), последний при сборке клатрина активируется и взаимодействует с каталитическим доменом, тем самым многократно увеличивая ГТФазную активность. Кроме того, GED-домен способен контактировать с GED соседней молекулы, при этом способствуя сборке динамина в димеры и тетрамеры, а те, в свою очередь, полимеризуясь, формируют кольца и спирали, образуя так называемый «воротничок» (Muhlberg et aL, 1997; Sever et al., 2000).
Роль убиквитинирования белков в регуляции РОЭ
Убиквитинирование — одна из белковых постгрансляционнных модификаций, широко распространенная в клетках всех эукариотических организмов. Она заключается в ковалентном присоединениии убиквитина, небольшого 76-членного пептида, с помощью изопептиднои связи к одному или нескольким остаткам лизина. Моноубиквитинированные белки могут затем далее модифицироваться за счет дополнительного присоединения молекул убиквитина к лизинам 48 и 63 самого пептида, что образует некое подобие «грозди» (т. наз. полиубиквитинирование). Убиквитинирование рассматривалось долгое время как сигнал быстрой цитоплазматической деградации с помощью протеасом (Ciechanover, 1998). Тем не менее, бурное развитие работ в этой области привело к пониманию того, что убиквитинирование играет весьма существенную роль и в везикулярном транспорте, не вовлекая в этот процесс протеасомы. С использованием дрожжевых систем было показано, что добавление к белку одного (а в некоторых случаях нескольких) убиквитинов, сконъюгированных по Lys 63, является сигналом интернализации многих белков плазматической мембраны, таких как ионные каналы, транспортеры и др. (Shih et al., 2000). В дополнение к этому, убиквитирование играет, по-видимому, существенную роль и как сигнал лизосомальной деградации (Dupre et al., 2001). До сих пор нет ясности относительно того, какой именно тип модификации работает в данном случае. Так, некоторые исследователи полагают, что полиубиквитинированные белки направляются к протеасоме, тогда как моноубиквитинированные интернализуются и затем попадают в лизосомы (Hicke, 2001; Rao et al., 2002a). С другой стороны, существуют данные, позволяющие предполагать, что моноубиквитинирование необходимо для интернализации, тогда как деградация в лизосомах требует полиубиквитинирования (Lee et ah, 1999; Rotin et al., 2000; Shih et al., 2000; Stang et al., 2000; Thien, Langdon, 2001), хотя в некоторых случаях и для попадания в лизосомы было достаточно присоединения к белку одного убиквитина (Urbanowski, Piper, 2001). В последнем случае, однако, моноубиквитирование являлось результатом экспериментальных генетических манипуляций, и даже если оно оказывается достаточным, неизвестно, является ли это оптимальным для нормально протекающего процесса. Следует, однако, иметь в виду, что обсуждаемая модификация, по-видимому, не является единственно возможной для нацеливания белков в лизосомы, Так, по крайней мере два дрожжевых мембранных белка из ныне известных , Sna3p и Cos4p, не нуждаются в убиквитинировании для попадания во внутренние пузырьки МВЭ, что означает существование альтернативного механизма (Reggiori, Pelham, 2001). Надо отметить, что на данный момент в литературе пытаются классифицировать типы убиквитинирования. Так, если к молекуле пришивается одна молекула убиквитина, то белок называют моноубиквитированным и такая модификация вызывает конформационные изменения в белке. Моноубиквитинирование, как предлагают, также участвует в гистоновой активности и репарации ДНК (Pickart, 2000).
Используя химерные конструкции Хаглунд и соавторы продемонстрировали что, пришивание одного убиквитина к рецептору ЭФР стимулирует его конститутивную интернализацию и увеличивает деградацию (Haglund et al., 2003). Мультиубиквитинирование -пришивание нескольких одиночных убиквитинов или коротких цепочек, где убиквитины сконъюгированы по Lys 63, к нескольким остаткам лизина, в молекуле белка, и такие белки направляются на путь лизосомальной деградации (Hicke L., 2001). Полиубиквитинирование -пришивание нескольких длинных цепочек к субстрату, где убиквитины сконъюгированы по Lys 48, по всей вероятности, является маркером для протеасомной деградации (Dikic, 2003). Необходимо отметить также, что практически различить полиубиквитинированный белок (т.е. такой, в котором присутствуют длинные убиквитиновые "гроздья") и содержащий одиночные убиквити новые остатки или короткие цепочки, присоединенные к нескольким лизинам белка, т.е. мультиубиквитинированый, достаточно сложно, поскольку о характере убиквитинирования судят по картине изменения подвижности белка при электрофорезе в ПААГ (размазанный шлейф или дискретные зоны). Убиквитинирование осуществляется по каскадному принципу тремя ферментами: убиквитин-активирующим ферментом (Е1), убиквитин-конъюгирующим ферментом (Е2) и убиквитин-лигазой (ЕЗ). Активация убиквитина ферментом Е1 (105кДа) требует энергии АТФ. Е1 узнает С-концевой остаток глицина в молекуле убиквитина и с помощью гидролиза АТФ между Е1 и глициновым АО убиквитина образуется высоко-энергетическая тиол-эфирная связь. Е2 энзимы (примерно ЗбкДа) содержат каталитически активный UBC домен (Ubiquitm-conjugating enzyme) с активным цистеином и «перетягивают» на себя убиквитин от Е1, затем ЕЗ убиквитин-лигаза способствует сближению Е2 энзима и белка, после чего убиквитин пришивается к субстрату (Myung et al., 2001). Однако, недавние исследования, предполагают, что по-крайней мере некоторые Е2 способны напрямую присоединять убиквитин к субстрату без участия ЕЗ белков. Е2 белки разнообразны по структуре и функционально. Такое разнообразие способствует специфичности убиквитин-конъюгирующей системы- Гетерогенность Е2 также отображается в их субклеточной локализации, некоторые из них присутствуют в цитозоле, другие локализованы в аппарате Гольджи или эндоплазматическом ретикулюме (Hedge, 2004). Класс ЕЗ ферментов обладает еще большим разнообразием, по сравнению с Е2 белками. Комбинации Е2 и ЕЗ ферментов, по всей вероятности, обеспечивают специфичность системы. ЕЗ белок узнает свой субстрат и способствуют сближению Е2 фермента и субстрата, после чего Е2 белок переносит убиквитин на субстрат (Hedge, 2004). Выделяют два основных класса ЕЗ лигаз: лигазы, содержащие НЕСТ домен и RING finger домен содержащие ЕЗ белки. Первый класс лигаз, помимо каталитического НЕСТ домена, содержат WW домен (важен для белок-белковых взаимодействий), также С2 домен, который присоединяет внутриклеточный кальций и способствует транслокации к ПМ. Типичный представитель этого класса убиквитин лигаза Nedd4. Предполагают, что она участвует в интернализации, непосредственно убиквитинируя белки клатриновых ямок, например Epsl5, эпсин (Marmor and Yarden, 2004).. Второй из вышеперечисленных класс лигаз, содержат RING finger домен, который состоит из 7 АО цистеина и одного гистидинового остатка.
Этот домен присоединяет два иона цинка и является критическим для присоединения убиквитина к субстрату. К этому классу лигаз относится SCF комплекс, убиквитинирующий ІкВа. Mdm2 фермент, который убиквитинирует р53 белок. Другой представитель этого класса - убиквитин лигаза с-СЫ. Надо отметить, что в клетке помимо убиквитин-лигаз есть пептидазы, обеспечивающие деубиквитинирование белков. Вполне возможно, что такой пептидазой у млекопитающих является UBPY. Деубиквитинирующий фермент Fat Facets регулирует сигнальные каскады и эндоцитоз необходимый для нормального развития глаза у D.melanogaster (Cadavid et al., 2000). У дрожжей, как уже упоминалось, эту функцию осуществляет изопептидаза DOA4 (Dupre and Haguenauersapis, 2001). Надо отметить, что в ряде работ, при добавлении ингибиторов протеасом, наблюдали подавление деградации, из чего авторы делали вывод о том, что убиквитинированный рецептор деградирует в протеасомах (Longva et al., 2002, Takagi et al, 2001). Протеасомы - высококонсервативные, примерно 2.5 МДа комплексы которые расщепляют белки АТФ-зависимым способом на мелкие пептиды. Протеасомы участвуют в таких процессах, как клеточный цикл, дифференцировка, долговременная память, репарация ДНК, презентация антигена, канцерогенез. Протеасому (26S) можно разделить на 2 мажорных субкомплекса: 2 OS частица, которая содержит протеазную субъедшшцу и 19S регуляторную частицу, которая регулирует 20S комплекс. 20S комплекс состоит из четырех стопок гептамерных колец, при этом сс-субъединицы составляют 2 внешних кольца, а р-субъединицы -внутренние кольца. Терминальный треонин Р-субъединицы служит как каталитический нуклеофил. Выделяют химотрипсин-подобную активность, позволяющую разрезать связи после гидрофобных аминокислотных остатков, трипсин-подобную активность - разрезает связи после основных АО. Также различают пост-глютаминовый пепдидный гидролиз. 19S регуляторный комплекс состоит из основания и крышечки, крышечка с высокой точностью узнает убиквитинированные белки, а основание содержит 6 АТФаз, разворачивает белки, доставляя их в 20S субъединицу протеасомы АТФ-зависимым способом. Без регуляторной субъединицы коровая 20 S частица полностью не активна.
Получение мембранных фракций
Анализ структуры белков Cbl-семейства позволяет выделить несколько различных доменов, схема 2. Структурно выделяют два больших региона - это cbl-N и cbl-C, несущих в своем составе несколько функциональных доменов (Yokouchi et al., 1999; Lill et al., 2000). Высококонсервативный N-терминальныЙ домен белков с-СЫ включает последовательность с 1 по 357 АО. Он имеет высокую степень гомологии с белком ретровируса CasNS-І и практически соответствует ему по длине (Lupher et al., 1996). Этот участок именуют фосфотирозин-связывающей платформой, или тирозинкиназа-связывающим доменом (tyrosine kinase binding domain, TKB), поскольку он отвечает за взаимодействие с целым рядом активированных рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ. В свою очередь, в ТКВ различают три участка: "пучок" из 4 спиральных доменов, называемый 4Н (four-helikal domain), кальций-связывающий EF-домен (EF-hand) и 5Н2-подобный домен (Meng et al., 1999). Как известно, именно БГО-домены обеспечивают взаимодействие белков, их содержащих, с фосфорилированными остатками тирозинов активированных тирозинкиназ. Однако участок СЫ, структурно схожий с другими SH2 доменами (275-355 АО), неспособен взаимодействовать с фосфотирозинами своих мишеней, поскольку в нем отсутствует целый ряд характерных для этой структуры последовательностей. Для образования полноценного фосфотирозин-связывающего "кармана" необходимо наличие 4Н-домена, правильную ориентацию которого по отношению к SH2-подобному участку обеспечивает EF-домен (Lupher et al., 1999). Таким образом, ТКВ представляет собой интегрированную фосфотирозин-связывающую платформу. Интересно, что СЫ является пока единственным белком, обладающим подобной аранжировкой доменов. Небольшой линкерный домен (L) связывает Cbl-N и СЫ-С. СЫ-С охватывает участок с 380 по 906 АО. в с-СЫ млекопитающих. Выделяют три функциональные группы в этой области. Так называемый RING-fmger домен, характерный для ряда убиквитин-лигаз, располагается с 380 по 472 аминокислоту (Waterman et ah, 1999). Это наиболее консервативный домен в СЫ-С области. Интересно, что функционально линкерный и RING домены также интегрированы, поскольку мутации в линкерном участке приводят к потере убиквитин-лигаз ной активности и, более того, к получению белка, обладающего высоким трансформирующим потенциалом (Andoniou etal., 1994). Далее следует участок с повышенным содержанием пролина (proline rich domain, PRD), обеспечивающий взаимодействие с SH3-содержащими белками.
Завершает этот ряд так называемая лейциновая молния (leucine zipper, 857-892), обладающая способностью связывать убиквитин, в результате чего этот участок часто называют UBA/LZ (ubiquitin-associated/leicine zipper domain). Лейциновая молния, как полагают, существенна для димеризации молекул СЫ, a UBA - для функционирования СЫ в качестве убиквитин-лигазы (Levkowitz et al., 1999). Между PRD и UBA располагаются мотивы, включающие остатки серина и тирозина, способных в фосфорилированном состоянии создавать сайты связывания для белков, содержащих SH3- и SH2-домены. Хотя молекула СЫ содержит 22 тирозиновых остатка, основными сайтами, участвующими во взаимодействии СЫ с его партнерами, являются Y700, Y731 и Y774 (Andoniou et al., 1996; Feshchenko et al., 1998). Остальные сайты обеспечивают не более 5 % тирозинового фосфорилирования с-СЫ (Feshchenko et al., 1998). Интересно, что делеция UBA домена уменьшает фосфорилирование с-СЫ и его ассоциацию с рецептором ЭФР (Bartkiewicz et al., 1999). Фосфорилирование с-СЫ по тирозину происходит в ответ на активацию ряда рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ и других поверхностных рецепторов в ответ на соответствующие стимулы. Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют говорить о том, что с-СЫ может функционировать в разных качествах. Он выступает как адапторный белок, способствующий сборке разнообразных сигнальных комплексов. Наличие множества партнеров с-СЫ в клетках предполагается из-за самой структуры белка. Так, с ТКВ доменом, как следует из его названия, после стимуляции соответствующим лигандом связываются рецепторные тирозинкиназы Syk и Zap, участвующие в иммунном ответе, и рецепторы PDGF и ЭФР (Bowtell, Langdon, 1995; Lupher et al., 1997, 1998; Miyake et al., 1998). Как было продемонстрировано на культуре эпителиальных клеток линии 293, с ТКВ-доменом при активации интегрина avp3 взаимодействует также фосфорилированная по тирозину 416 Src-киназа (Sanjay et al., 2001). Следующий далее RING-домен имеет двух партнеров. Один из них -убиквитин-конъюгирующий фермент Е2, UbcH7, - подтверждает, что СЫ функционирует как убиквитин-лигаза ЕЗ (Yokouchi et al., 1999); тогда как второй, hSpry2, аналог белка дрозофилы Sprouty, способен конкурировать за связывание с UbcH7 и тем самым выступает в качестве антагониста убиквитин-лигазной активности СЫ (Wong et al., 2001). С пролин-обогащенным участком PRD взаимодействует целый ряд белков, имеющих SH3-домены. К ним относятся адапторные молекулы Nek, CrkL, GRB2, CIN85/SETA, CAP, CD2АР/CMS, киназы Src-семейства Src, Fyn, Hck, Lck, Lyn, тирозинкиназа Syk, фосфолипаза Су и p85-субъединица РІЗ-К І класса (Donovan et al., 1994; Fukazawa et al., 1995; Graham et al., 1998; Borinstein et al., 2000; Tvorogov, Carpenter, 2002). Сайты серинового фосфорилирования служат местом докинга белков семейства 14-3-3, тогда как фосфорилированные остатки тирозинов на С-конце СЫ связывают целый ряд белков, в том числе уже упоминавшихся, а именно Crk, CrkL, Crkll, Vav, Abl, Src, Lck, Lyn, p85 и др. (Tsygankov et al., 2001). Как уже упоминалось, несмотря на многочисленность остатков тирозина в молекуле с-СЫ, основными сайтами фосфорилирования являются три: Y700, Y731 и Y774. Src-киназы и р85 субъединица также могут присоединяться к сайтам тирозинового фосфорилирования на С-конце с-СЫ. Для некоторых партнеров с-СЫ точные сайты связывания еще не определены: это протеин киназа С, некоторые адаптеры., а также белки, так или иначе связанные с цитоскелетом. Следует отметить две характерные особенности этих взаимодействий. Во-первых, многие белки (это относится в первую очередь к киназам Src-семейства и р85-субъединице PI-3-киназы) способны связываться с более чем одним доменом СЫ, что позволяет предполагать их участие в регуляции нескольких различных процессов. Во-вторых, хотя в этих данных и имеется ряд противоречий, общее правило говорит о том, что взаимодействия, опосредуемые ТКВ-доменом и сайтами тирозинового фосфорилирования, являются стимулируемыми, тогда как ассоциация через RING- и PRD-домены конститутивна (Tsygankovetal., 2001).
Исходя из вышеперечисленного, особенно интерсным представляется взаимодействие убиквитин-лигазы с-СЫ и PI3-K. Так, зависящее от фосфорилирования по тирозину связывание с-СЫ с р85 является существенным для пролиферации и выживания В-клеток в ответ на их стимуляцию IL-4. Было обнаружено, что оверэкспрессия с-СЫ увеличивает активность Р13-киназы, так же как и пролиферацию клеток. Эти эффекты подавлялись в присутствии вортманнина, ингибитора PI3-киназ, или точечной мутацией с-СЫ по Y731, основному сайту связывания р85 (Ueno et al., 1998). Аналогичный эффект был продемонстрирован на В-клетках линии DT-40 при стимуляции их ростовым фактором G-CSF: вортманнин и точечная мутация Y731F уменьшали стимулируемый G-CSF синтез ДНК (Grishin et al., 2000). В другом исследовании было обнаружено, что связывание с-СЫ с Р13-киназой через тот же сайт играет критическую роль в базальной активации ЕКК2-киназы (Finkelstein, Shimizu, 2000), Активация c-Met, рецептора фактора роста гепатоцитов HGF, в клетках HeLa также вызывает фосфорилирование с-СЫ и связывание его с адаптером c-Crk , что приводит, в свою очередь, к активациии JNK-киназы. Интересно, что в этих клетках с-СЫ также опосредует c-Met-стимулируемую активацию ERK-киназы, но этот эффект с-СЫ не зависит от Crk (Garcia-Guzman et al., 2000). Другая функция белка с-СЫ связана с его способностью убиквитинировать белки, тем самым направляя их на путь деградации. Существуют расхождения относительно той точки эндоцитозного пути, на которой включается СЫ. Так, было показано, что рецепторы ЭФР и CSF1 взаимодействуют с СЫ на плазматической мембране и полиубиквитинируются там, причем рецептор ЭФР затем (в течение 5 мин) деубиквитинируется (Lee et al., 1999; Longva et al., 2002). С другой стороны, некоторые авторы утверждают, что СЫ ассоциируется с рецептором ЭФР только в эндосомах (Levkowitz et al., 1998; Burke et al., 2001).
Влияние ингибиторов протеасом и ингибитора вакуолярной протонной помпы Баф А1 на убиквитинирование клеточных белков
Одно из возможных объяснений влияния ингибитора протеасом на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов может быть связано со спецификой действия ингибиторов. Как известно, подавление этими ингибиторами протеазной активности протеасом приводит к накоплению высокоубиквитинированых белков-субстратов протеасом. В результате истощение внутриклеточного пула свободного убиквитииа, необходимого для новых циклов убиквитинирования. Давно известно, что как рецептор ЭФР, так и некоторые белки, участвующие в регуляции его эндоцитоза (Epsl5, epsin) подвергаются убиквитинированию. Кроме того, исследования последних лет свидетельствует о том, что работа белков, участвующих в сортировке интернализованных мембранных белков в лиз о сомы, связана со способностью некоторых из них узнавать убиквитинированные белки и включать их в состав внутренних пузырьков МВЭШЭ. Таким образом, предположение о том, что истощение пула свободного убиквитина может приводить к нарушению процесса сортировки на путь лизосомальной деградации, не лишено оснований. Следующая серия экспериментов была направлена на выяснение того, что происходит с убиквитинированием как общего пула внутриклеточных белков, так и рецептора ЭФР в присутствии MG132 и лактацистина. Для этого клетки А431 предобрабатывали двумя вышеупомянутыми ингибиторами в течение 30 мин. Часть чашек инкубировали также с БафАІ, чтобы определить, в каком виде - убиквитинированном или деубиквитинированном, - попадают белки в лизосомы. Затем стимулировали эндоцитоз, добавляя к клеткам ЭФР на разные сроки, и получали тотальные лизаты клеток. После электрофореза в 7.5% геле и иммуноблотинга мембрану окрашивали одновременно антителами на убиквитин, рецептор ЭФР и убиквитин-лигазу с-СЫ, субстратом которой является рецептор (рис.9 А), Так, мы видим, что количество рецептора и с-СЫ не изменяется в течение всего эксперимента. Это свидетельствует о том, что ингибиторы не оказывают влияния на общий пул этих белков в клетке. Такой результат неудивителен, поскольку, во-первых, эти клетки демонстрировали медленный эндоцитоз, а во-вторых, как уже упоминалось, в клетках А431 трудно добиться ярко выраженной даун-регуляции рецептора, потому что путь лизосомальной деградации имеет относительно невысокую пропускную способность. Однако оказалось, что если в контроле общая окраска на убиквитин выражена слабо в течение всего эксперимента, то MG132 и лактацистин (ЛЦ) вызывают сильное накопление убиквитинированных форм клеточных белков.
При этом следует заметить, что действие MG132 сказывается еще до запуска эндоцитоза, тогда как сравнимый эффект лактацистина развивается только к 90 мин. Возможно, такая картина является следствием различной кинетики действия ингибиторов на протеазную активность протеасом. Надо отметить, что даже в случае, когда в соответствии с применяемой нами схемой, позволяющей избежать влияния на интернализацию, MG132 добавляли к клеткам через 15 мин после стимуляции эндоцитоза (рис.9 Б - последние 3 дорожки), то эффект ингибитора к 60 мин был таким же, как и в предобработанныхМС}132 клетках. Надо отметить, что в этом случае мембрана окрашивалась только антителами на убиквитин (рис.9 Б). В этом случае мы не видим четкой полосы, соответствующей рецептору или с-СЫ (как на рис.9 А, где выявляли помимо убиквитина еще и непосредственно эти два белка). Это говорит о том, что среди убиквитинированных белков модифицированный рецептор и с-СЫ составляют минорную часть. В предыдущем эксперименте мы продемонстрировали, что Баф А1 подавляет только функциональную активность лизосом, не препятствуя доставке ЭФР-рецепторных комплексов в лизосомы. На рис.9 А мы видим, что Баф А1 не вызывал накопление убиквитинированных белков. В соответствии с этим можно предположить, что рецепторы перед попаданием в лизосомы деубиквитинируются. Таким образом, все гипотетически возможные регуляториые события, в которые могут быть вовлечены процессы убиквитинирования\деубиквитинирования и взаимодействия с убиквитинированными белками, реализуются на стадиях, предшествующих лизосомальной. Кроме того, влияние MG132 на накопление высокоубиквитинированных форм белков весьма значительно и сказывается достаточно быстро после добавления ингибитора к клеткам, что может приводить к истощению внутриклеточного пула свободного убиквитина. 4,6. Влияние ингибитора протеасом MG132 на убиквитинирование рецептора ЭФР и его взаимоотношения с убиквитин-лигазой с-СЫ. Как следует из Обзора литературы, убиквитинирование рецептора лигазой с-СЫ можно считать установленным фактом. Однако неизвестно, на каком этапе происходит взаимодействие с-СЫ с рецептором, приводящее к убиквитинированию последнего - на ПМ или в эндосомах, и как долго эта ассоциация длится. Иммунофлуоресцентный анализ распределения рецептора ЭФР и с-СЫ в клетках РАЕ АН, экспрессирующих химеру рецептора с зеленым флуоресцирующим белком GFP, показал, что если до стимуляции эндоцитоза с-СЫ распределен дисперсно по клетке и практически не выявляется, то после стимуляции значительная его часть перераспределяется к ПМ, а в дальнейшем ассоциируется с эндосомальными рецептор-содержащими структурами (Рис. 10). Поскольку клетки РАЕ А II в норме демонстрируют очень медленный эндоцитоз, то анализ поведения с-СЫ на более поздних сроках проводили на клетках А431 (рис.11).Видно, что через 60 мин, как и в предыдущем случае, рецептор и с-СЫ локализовались на одних и тех же структурах в основном в околоядерной области клеток. Через 180 мин в клетках А431 флуоресценция рецептора в значительной мере уменьшалась (по-видимому, в результате его деградации), тогда как с-СЫ практически полностью отсутствовал на рецептор-содержащих структурах. Можно предполагать, что к этому сроку за флуоресценцию рецептора «отвечают» те молекулы, которые уже попали в лизосомы, но еще узнаются антителами. Данные по влиянию БафАІ на эндоцитоз позволяют предполагать, что по-крайней мере часть рецепторов какое-то время после доставки в лизосомы остаются интактными.
Поскольку в этом случае свечения, соответствующего с-СЫ, не обнаруживается, это означает, что убиквитин-лигаза уходит из комплекса с рецептором и с эндосом до перехода ЭФР-рецепторных комплексов в лизосомы. Интересно, что обработка клеток MG132 приводит к сохранению совместной локализации рецептора ЭФР и с-Cbl и на поздних сроках (рис. 11). В соответствии с существующими представлениями, фосфорилирование рецептора по тирозину в результате связывания с ЭФР необходимо для ассоциации его с с-Cbl и дальнейшего убиквитинирования. Для исследования динамики этих процессов в ходе эндоцитоза в клетках А431 мы проанализировали фосфорилирование рецептора по тирозину, его ассоциацию с с-СЫ, и убиквитинирование рецептора через 60 и 90 мин после стимуляции эндоцитоза в норме и после 30- минутной предобработки MG132. По окончании инкубации тотальный лизат клеток подвергали иммунопреципитации антителами на рецептор и после иммуноблотинга мембраны окрашивали антителами на рецептор, фосфотирозин, убиквитин и с-СЫ (рис 12). Поскольку в этом опыте мы также имели дело с клетками с медленным эндоцитозом, то отсутствие видимых изменений в общем количестве рецептора в течение выбранного нами времени эксперимента не являлось неожиданным, также как и отсутствие влияния MG132 на весь пул рецептора. Тем не менее, за 90 мин значительная часть интернализованных ЭФР-рецепторных комплексов (как следует из данных, приведенных нами в предыдущих разделах) успевает пройти путь от ранних эндосом до ПЭ и лизосом, и эта часть представлена пулом активированных, т.е. фосфорилированных по тирозину рецепторов. Оказалось, что в контроле до добавления ЭФР рецептор практически не фосфорилирован, после стимуляции ЭФР уровень фосфорилирования проходит через максимум и затем снижается к 90 мин (возможно, за счет диссоциации части ЭФР-рецепторных комплексов в ПЭ+Лиз). Динамика фосфорилирования рецептора в клетках, обработанных ингибитором, до 60 мин такая же, однако через 90 мин уровень его фосфорилирования значительно выше, чем в контрольных клетках. Практически аналогична динамика ассоциации рецептора ЭФР и с-СЫ, за исключением того, что MG132 уже в нулевой точке, т. е. еще до стимуляции эндоцитоза, вызывает незначительную ассоциацию рецептора и с-СЫ, причем убиквитин-лигаза в данном случае способна убиквитинировать рецептор, что видно на соответствующем иммуноблоте и его денситограмме (рис.12 А и Б). Причины этого явления нам на данный
