Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма 8
1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета 9
1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма 11
1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне 12
1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов 12
1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов 14
1.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов 16
1.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге 18
1.3. Ядерные рецепторы PPAR на перекрестке метаболических и регуляторных
сигнальных путей. 21
1.3.1. Структурные свойства PPAR и механизмы регуляции ими экспрессии генов 22
1.3.2. Экзогенные и эндогенные лиганды PPAR 24
1.3.3. Роль PPAR в регуляции генов липидного метаболизма 25
1.3.4. Регуляция PPAR на молекулярном уровне 30
1.4. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов PPAR, , при
стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии. 31
1.4.1. Клеточные модели гипергликемии 33
1.4.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе 33
1.4.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции. 36
1.4.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии 40
1.5. Постановка целей и задач исследования 41
2. Материалы и методы 43
2.1. Приборы 43
2.2. Реактивы и препараты 43
2.3. Выделение и культивирование клеточных линий 46
2.3.1. Первичные астроциты крысы 46
2.3.2. Клеточная культура HeLa 47
2.3.3. Клеточная культура С6 48
2.3.4. Оценка пролиферации клеток 48
2.4. Выделение тотальной РНК 49
2.5. Определение экспрессии генов 51
2.6. Иммуноблотинг и электрофорез 53
2.7. Измерение концентрации простагландина (PG) Е2 54
2.8. Измерение ДНК-связывающей активности PPAR 55
2.9. Статистический анализ 57
3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии HeLa. 58
3.1.1. Влияние LPS на экспрессию генов COX-1 и COX-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы 59
3.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-261
3.1.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPAR, PPAR и PPAR 63
3.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов PPAR, - и -. 64
3.2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях гипергликемии 69
3.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по GFAP для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы. 69
3.2.2. Влияние глюкозы на выброс PGE2 и TNF в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета. 71
3.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPAR, -, - при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии. 72
3.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета. 74
3.2.5. Модуляция LPS-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью MAPK ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования. 77
3.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах . 81
3.3.1. TLR-агонисты подавляют уровень экспрессии PPAR и PPAR, но увеличивают экспрессию PPAR 81
3.3.2.Характеристика LPS-стимулированной экспрессии мРНК и белка PPAR, -, -. 86
3.3.3. Скорость распада мРНК PPAR, -, -. замедляется при активации TLR4. 91
3.3.4. Активация р38 и скорость деградации мРНК 93
3.3.5. Модуляция экспрессии и активности PPAR, -, - различными ингибиторами MAPK 94
3.3.6. Роль р38 в регуляции экспрессии PPAR, -, -. 103
3.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPAR, -, -. 104
3.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции TLR 107
3.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах. 114
4. Выводы 118
5. Список литературы 119
- Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма
- Первичные астроциты крысы
- Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPAR, PPAR и PPAR
- Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах
Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма
Особый интерес представляет воспаление в центральной нервной системе (ЦНС). Ранее этому вопросу уделялось недостаточно внимания, поскольку ЦНС хорошо защищена от проникновения «чужеродных» стимулов. В исследованиях последних десятилетий показано, что воспалительные процессы характерны для различных заболеваний мозга, таких как рассеянный склероз, вирус-ассоциированная деменция иммунодефицита человека, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона (смотри обзоры [10,11]. Исследования показывает, что ингибирование воспалительных процессов является одним из наиболее важных механизмов в предотвращении повреждения мозга в ходе развития нейродегенеративных процессов [10,12].
Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма Из того факта, что система врожденного иммунитета отвечает на различные изменения в окружающей среде (как внешней, так и внутренней, как относительно организма, так и относительно отдельных клеток), логично вытекает предположение, что изменения в метаболизме, структурном или энергетическом, тоже должны быть связаны с системой врожденного иммунитета. Действительно, в настоящее время возникло ясное понимание, что болезни с нарушением метаболизма, такие как диабет 2 типа, ожирение, гипергликемия, вызывают нарушение воспалительного ответа [4,13]. Известно, что ожирение приводит к слабой активации систем воспалительного ответа, и развитию хронических воспалительных процессов в организме, и в первую очередь это связывают с нарушениями в регуляции системы TLR, как на уровне организма, так и на уровне клеток. [14–16].
Гипергликемия, т.е. повышение уровня глюкозы в крови, характерно для многих нарушений гомеостаза, в первую очередь, для диабета 2 типа [3]. Поэтому взаимосвязь гипергликемии и системы врожденного иммунитета изучается на разных тканях и клетках. Но особый интерес представляет нервная система. Клетки мозга чрезвычайно чувствительны к изменению содержания глюкозы в крови [17]. Длительное изменение уровня глюкозы при гипергликемии вызывает изменения в функциях клеток нервной системы (нейронов и клеток глии) [18]. Увеличивается риск появления когнитивных нарушений, деменции, депрессии и инсульта [19,20]. На клеточном уровне показано, что гипергликемия сопровождается увеличением гибели нейронов и активацией астроцитов, вызывая глиозис [21,22].
Таким образом, понимание на молекулярном уровне регуляции системы врожденного иммунитета и ее взаимосвязи с различными метаболическими нарушениями в организме является актуальной задачей современных исследований.
В общем случае клетки млекопитающих узнают о присутствии патогенов с помощью группы рецепторов, называемых паттерн узнающие рецепторы (PRRs, pattern recognition receptors). Эти рецепторы специализируются на распознавании консервативных молекулярных структур патогенов. Эти структуры называют патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) [23,24]. В этой группе выделяют семейства Толл-подобных, RIG-I подобных, Нод-подобных и цитозольных ДНК рецепторов [1]. Наиболее изученными на молекулярной уровне являются Толл-подобные рецепторы. Рассмотрим их подробнее.
В 1985 году биолог Кристиана Нюсляйн-Фольхард в ходе работы над дрозофилами идентифицировала ген названный Толл, ответственный за эмбриональное развитие дрозофилы (цит. по [23]). В 1997 году Руслан Меджитов с соавторами клонировали человеческий гомолог Толл-белка дрозофилы, который теперь известен как TLR4, и показали, что активация этого белка приводит к развитию врожденного иммунного ответа [25]. Было показано, что TLR4 участвует в воспалительном ответе при обработке мышей липополисахаридом (LPS) [26]. Эти открытия стимулировали исследования вызванной патогенами внутриклеточной передачи сигналов, которые имеют решающее значение для понимания механизмов, регулирующих врожденный иммунитет [27]. Толл-подобные рецепторы, характеризуются тремя основными доменами: 1) богатый лейцином внеклеточный домен, 2) трансмембранный домен, 3) цитоплазматический TIR домен, гомологичный подобному в IL-1 рецепторе, называемый Toll/IL-1 рецептор (TIR) домен [28]. Узнавание TLR лиганда обусловлено внеклеточным доменом, который содержит лейцин-богатые повторы (LRR) содержащие 19-25 копий [29] (Рис. 1.2). Внутриклеточный домен отвечает за образование гомо- и гетеромеров между TLR, т.е. с аналогичными белками или белками других TLR рецепторов. При образовании гетеродимеров их обозначают таким образом: TLR1/2 (гетеродимер TLR1 и TLR2). Также внутриклеточный домен отвечает за взаимодействие с адапторами,
Первичные астроциты крысы
Роль Толл-подобных рецепторов (TLR) в центральной нервной системе в последнее десятилетие вызывает пристальное внимание исследователей, и рассмотрена в многочисленных обзорах [35, 41, 143].
Известно, что нейровоспалительные процессы это важный фактор сопровождающий различные нейродегенеративные расстройства [11,30]. Показано, что TLR вовлечены в различные заболевания ЦНС, участвуют в процессе гибели нейронов, повреждении ГЭБ, отеке мозга и воспалительных реакциях вызванных ишемией (смотри обзоры [48,49]), участвуют в развитии и прогрессе ряда нейродегенеративных заболеваний [11,30].
Как и в периферических органах, различные Толл-подобные рецепторы активно экспрессированы в нервной системе. Считается, что TLR рецепторы есть в микроглии [50], астроцитах [51,52] и олигодендроцитах [53]. Хотя наличие TLR рецепторов у нейронов до сих пор является спорным вопросом, немало свидетельств указывает на важную роль этих TLR в физиологическом и патологическом состояниях [11]. Они включены в защиту организма от микробиологического проникновения в ЦНС. Так же показано, что TLR участвуют в некоторых не-иммунных процессах, таких как костный метаболизм [54], нейрогенез [55] и развитие мозга [56]. Они играют важную роль в развитии ткани, клеточной миграции и дифференциации и в ограничении воспаления, и в организации восстановительных процессов после травмы.
В модели нейродегенерации in vivo показано, что введение LPS способно стимулировать врожденный иммунитет, вызывая значительное снижение количества нейронов в коре головного мозга. В тоже время животные, имеющие мутацию в гене TLR4 устойчивы к повреждениям нейронов, что указывает на взаимосвязь между TLR, врожденным иммунитетом и нейродегенеративными заболеваниями [49].
Показано, что TLR4 опосредованная активация NF-B играет важную роль в развитии воспалительных процессов в мозгах при болезнях ЦНС [57] за счет активации транскрипции различных провоспалительных генов, включая цитокины, хемокины, и такие ферменты как циклооксигеназа 2 (СОХ-2) и матричная металлопротеиназа 9 (ММР-9) [10,58].
Недавние исследования так же показывают, что TLR4 является важным элементом в этанол-стимулированном воспалении в мозгу, так как нокдаун TLR4 снимает активацию MAPK и NF-B сигнальных путей, а так же синтез воспалительных медиаторов в астроцитах [59].
Показано, что дефицит TLR2 и TLR4 подавляет экспрессию воспалительных цитокинов в лейкоцитах через 1 день после ишемии головного мозга, тем самым демонстрируя, что и TLR2 и TLR4 сигнальные каскады важны для запуска пост-ишемического воспаления [48]. Была также предложена молекулярная модель LPS-стимулированной нейропротекции от ишемического поражения [43], согласно которой предобработка LPS животных перепрограммирует TLR4 сигнальный путь, направляя его при инсульте по нейропротекторному пути через TRIF к IRF3. Среди всех TLR, TLR2 наименее селективен, и способен распознавать большое количество различных патогенов. Комплекс из TLR2 и TLR1 или TLR6 вовлечен в распознавание бактериальных липопротеинов [23,35]. TLR2 так же может взаимодействовать с другими белками, такими как CD36 или CD14 и может вызывать мультимеризацию в ответ на различные микробные лиганды [23,60]. Интересно, что LPS вызывает усиление экспрессии TLR2 в мозгу, при этом сам TLR2 не является мишенью для LPS и не модулирует иммунный ответ на LPS [61].
В отличие от TLR2 в ЦНС TLR4 конститутивно экспрессируется в микроглии [49], и его лиганд LPS индуцирует продукцию воспалительных медиаторов, таких как TNF, IL-6, NO [35] через NF-B зависимый путь. Активация TLR4 приводит к образованию нейротоксичных веществ, таких как провоспалительные цитокины, NO, активные формы кислорода (ROS) и пероксинитрита [34,62]. Более того, микроглия активированная LPS синтезирует большое количество глутамата, важного нейромедиатора, который в некоторых случаях действует как мощный нейротоксин [63]. LPS так же может активировать TLR4 на поверхности микроглии, что приводит к травмам олигодендроцитов [64].
Астроциты являются основными клетками системы врожденного иммунитета центральной нервной системы, которые вовлечены в патологический процессы многих неврологических заболеваний [65]. Эти клетки обладают рядом Толл-подобных рецепторов (TLR), которые позволяют им распознавать и реагировать на широкий спектр патогенов [65].
Выдвинуто предположение, что более полное понимание функций и механизмов работы TLR и сопровождающих их активацию сигнальных путях приведет к разработке эффективных методов терапии различных заболеваний ЦНС, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера, множественный склероз и различные инфекционные заболевания [34,66]. Понимание функции и изучение способов регулирования системы активации TLR, как с помощью эндогенных лигандов, так и синтетических соединений на разных стадиях сигнального пути поможет разработать эффективные методы борьбы с болезнями нервной системы.
Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPAR, PPAR и PPAR
Целью первого этапа работы было показать, что 1) условия клеточной гипергликемии меняют чувствительность клеток к действию TLR агонистов; 2) ядерные рецепторы PPAR меняются в условиях гипергликемии; 3) синтетический PPAR агонист росиглитазон позволяет модулировать TLR-стимулированные ответы, как в нормальных, так и гипергликемических условиях.
В качестве модели исследования мы выбрали клетки линии человека HeLa, поскольку это легко культивируемая линия и в ней экспрессируются все три изотипа PPAR [151–154], они отвечают на стимуляцию агонистами TLR4 LPS выбросом провоспалительных агентов IL-1, IL-6, COX-2, и др. [155,156].
Как характеристику воспалительного ответа мы выбрали индукцию классического маркера воспаления – циклооксигеназу (СОХ-1 и СОХ-2). Циклооксигеназа существует в виде изоформы СОХ-1, которая конститутивно экспрессируется в клетках и СОХ-2, экспрессия которой повышается при действии провоспалительных стимулов [157]. Однако в ряде клеток (миоциты сердца, астроциты, линия HeLa) наблюдается исходный, базовый уровень СОХ-2, хотя он также увеличивается при стимуляции провоспалительными стимулами, как и в остальных типах клеток [156,158].
Условия клеточной гипергликемии создавали инкубацией клеток 48 часов в условиях концентрации глюкозы 25 мМ. Контрольные клетки инкубировали в среде, содержащей 5 мМ глюкозы. Ранее было показано, что 48 часов инкубации достаточно для адаптации клеток к новым условиям [18,159–161]. Для характеристики влияния LPS на изменения экспрессии генов изоформ COX-1 и COX-2 при клеточной модели гипергликемии клетки линии человека HeLa инкубировали в присутствии 25 мМ глюкозы (условия гипергликемии) или в присутствии 5 мМ глюкозы (нормальные условия). Через 48 ч. добавляли LPS (100 нг/мл) на 24 ч, затем измеряли уровень мРНК в клетках (Рис. 4.1). На Рис. 4.1 хорошо видно, что стимуляция LPS при нормальной концентрации глюкозы (черные столбцы) не меняет экспрессию гена COX-1, тогда как уровень экспрессии гена COX-2 возрастает практически в 2 раза. Эти данные хорошо согласуются со сведениями из литературы об индукции гена СОХ-2 при активации Толл-подобных рецепторов (TLR) системы врожденного иммунитета [162].
Инкубация клеток при повышенной концентрации глюкозы (белые столбцы, Рис. 4.1), не влияет на уровень экспрессии гена COX-1, а уровень экспрессии гена COX-2 уменьшается, хоть и незначительно, но статистически значимо в этих условиях. Отсутствие изменения уровня экспрессии гена COX-1 согласуется с литературными данными, поскольку ранее было показано на линии моноцитов THP-1, что повышенный уровень глюкозы не приводит к изменению экспрессии гена COX-1 [161]. В литературе описано, что экспрессия гена COX-2 увеличивается при добавлении избытка глюкозы [161,163–165]. Эти данные отличаются от полученных нами результатов. Возможно, расхождения связаны с тем, что используются различные линии клеток. Линия HeLa отличается относительно высоким уровнем экспрессии гена СОХ-2 в не стимулированных клетках [156,158], в то время как на большинстве клеточных линий COX-2 экспрессируется только при стимуляции. Рис. 3.1. Влияние LPS на уровень экспрессии генов изоформ циклооксигеназы COX-1 и СОХ-2 в клетках HeLa в условиях адаптации к повышенной концентрации глюкозы. Клетки инкубировали при нормальной (черные столбцы, 5 мМ) или повышенной (белые столбыцы, 25 мМ) концентрациях глюкозы в среде 48 ч, затем добавляли LPS (концентрация 100 нг/мл) на 24 ч. После этого выделяли тотальную РНК клеток. Экспрессия COX-1 и СОХ-2 определялась методом ОТ-ПЦР. Все значения нормированы на уровень мРНК актина. Контрольные клетки инкубировали в среде с нормальной концентрацией глюкозы 72 часа и уровень экспрессии в них СОХ-1 и СОХ-2 генов принимали за 1. Результаты представлены как изменения по сравнению с контрольными клетками. - p 0.05.
Интересно, что эффект совместного применения LPS и глюкозы (серые столбцы) заключается в уменьшении экспрессии гена СОХ-1 (Рис. 3.1). COX-1 считается конститутивно экспрессирующимся геном. Однако, имеются сведения, что его экспрессия в некоторых клетках может снижаться при воздействии LPS в условиях культивирования при нормальной концентрации глюкозы [166]. Почему этот эффект мы наблюдаем только в условиях высокой глюкозы остается неясным. На адаптированных к глюкозе клетках вообще не происходит роста экспрессии СОХ-2, т.е. характеристики LPS-стимулированного клеточного ответа меняются.
Таким образом, изменения экспрессии COX-1 и COX-2 в условиях гипергликемии показывают, что LPS оказывает свое влияние на клетки, и мы видим отражение изменившегося в условиях гипергликемии клеточного ответа на воспалительные стимулы.
Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-2 Росиглитазон относится к классу тиазолидиндионов и используется в терапии для снижения концентрации глюкозы в крови (увеличивает запас в клетках и снижает синтез). Кардиотоксичность является побочным действием этого лекарственного средства. Росиглитазон является специфическим агонистом PPAR [167], однако на уровне клеточных ответов может модулировать другие типы PPAR [93]. В ряде исследований было показано, что росиглитазон, агонист ядерного рецептора PPAR, обладает противовоспалительной активностью [168–170]. Все эти исследования были проведены на клетках, адаптированных к нормальной концентрации глюкозы. Поэтому, мы проверили, сохраняет ли он свою способность модулировать ответ клеток на LPS в условиях клеточной гипергликемии.
В серии экспериментов проведено сравнение эффекта росиглитазона в условиях гипергликемии и нормальной концентрации глюкозы в среде. Инкубацию клеток проводили аналогично описанному в разделе 3.1.1. Росиглитазон добавляли вместе с LPS и оценивали через 24 ч изменение уровня мРНК COX-1 (Рис. 3.2.а) и COX-2 (Рис. 3.2.б). Влияние LPS на экспрессию генов СОХ-1 и СОХ-2 было аналогичным серии экспериментов, представленных на Рис. 4.1. Из Рис. 4.2.а видно, что обработка росиглитазоном приводит к падению уровня экспрессии COX-1 как при нормальных условиях, так и при культивировании клеток c повышенной концентрацией глюкозы. При этом на клетках, культивируемых в условиях гипергликемии, эффект росиглитазона выражен сильнее, что указывает на возможность изменения в системе ядерных рецепторов PPAR, для которых росиглитазон является агонистом.
Росиглитазон приводит к снижению LPS-индуцированной экспрессии гена COX-2 (Рис. 3.2.б), что соответствует данным о противовоспалительных свойствах этого вещества [168–170]. Однако, совместное добавление LPS и росиглитазона не изменяет эффект LPS на клетки, культивируемые в условиях гипергликемии (Рис. 3.2.б). Таким образом, при нормальной концентрации глюкозы росиглитазон оказывает противовоспалительное действие, однако в условиях гипергликемии он не влияет на эффекты LPS [162]. Мы предположили, что при адаптации клеток к повышенному содержанию глюкозы происходит изменение экспрессии ядерных рецепторов PPAR.
Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах
Полученные нами данные, что PPAR меняются в процессе развития ответа на LPS, позволило выдвинуть предположение, что экспрессия этих генов может регулироваться на пост-транскрипционном уровне. В последнее время посттранскрипционная регуляция генов на уровне времени жизни мРНК вызывает большой интерес, поскольку показано, что многие гены, активно вовлеченные в про-воспалительные процессы меняют скорость деградации мРНК при действии на клетки про-воспалительных агентов [145]. Поэтому, мы провели серию экспериментов по определению изменения уровня экспрессии мРНК PPAR, PPAR PPAR в присутствии ингибитора транскрипции актиномицина Д. Известно, что после добавления актиномицина изменяется только уровень уже существующей мРНК, что позволяет определять время полужизни мРНК [197]. Мы сравнили стабильность мРНК в нативных и LPS-стимулированных клетках (Рис. 3.15). Для определения стабильности мРНК в LPS-стимулированных клетках мы добавляли к клеткам LPS на 1 ч, затем синтез новой мРНК блокировался с помощью актиномицина Д (5 мг/мл). Уровень мРНК PPAR, -, - до добавления актиномицина Д был взят за 100%.
Время полужизни мРНК PPAR и PPAR в не стимулированных клетках меньше одного часа: примерно 30 мин для PPAR (Рис. 3.15.а), 75 мин для PPAR (Рис. 3.15.в) и 90 минут для PPAR (Рис. 3.15.б). Для удобства отображения в астроцитах обработанных LPS уровень мРНК PPAR, -, - был взят за 100% после 1ч инкубирования клеток с этим агонистом TLR4. Мы определили, что время полужизни мРНК PPAR и PPAR в LPS-стимулированных клетках стало примерно 80 мин для PPAR, 90 мин для PPAR и 130 минут для PPAR (Рис. 3.15). Таким образом мы видим, что LPS замедляет деградацию мРНК для всех трех типов PPAR. Полученные результаты указывают, что снижение уровня мРНК PPAR и PPAR и увеличение уровня мРНК PPAR при обработке клеток LPS не может быть объяснено увеличением скорости деградации мРНК. Время (ч)
Влияние ингибирования p38 МАРК и добавления LPS на скорость деградации мРНК PPARa, PPARP и PPARy. (аДв) Астроциты культивировали без дополнительных обработок (черная сплошная линия), с добавлением LPS (100 нг/мл) на 1 час (пунктирная линия) или совместно инкубировались с ингибитором р38 MAPK SB203580 (SB, 20 мкM) и липополисахаридом (LPS, 100 нг/мл) (серая линия). Затем клетки обрабатывали актиномицином Д (5 мкг/мл). Через указанные промежутки времени образцы собирали и уровень экспрессии мРНК PPAR, - - анализировали методом ПЦР в реальном времени. За 100% на графике принят уровень экспрессии мРНК PPAR, - - для необработанных астроцитов, и уровень экспрессии после 1ч обработки LPS соответственно (г) приведена электрофореграмма определения количества фосфо-р38 белка после 30 минут обработки LPS-стимулированных астроцитов ингибитором р38 МАРК. р 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #р 0,05 по сравнению с LPS-стимулированными клетками. Хотя о механизмах регуляции распада мРНК известно не так много (см. обзоры [146,194,198], нет сомнений, что p38 MAPK может играть важную роль в регуляции деградации мРНК для многих генов [199]. Ранее было показано, что LPS вызывает активацию p38 MAPK в астроцитах [200]. Мы так же показали, что ингибитор p38 MAPK снижает выброс воспалительных маркеров PGE2 и TNF в астроцитах (рис.3.9) и влияет на экспрессию PPAR (Рис.3.10), т.е. p38 может быть активным участником регуляции PPAR и на стадии деградации мРНК. Для проверки этого предположения мы измерили скорость деградации мРНК PPAR, -, - в присутствии специфического ингибитора p38 MAPK SB203580 (Рис. 3.15). Получили, что в LPS-стимулированных клетках инкубирование астроцитов с SB 203580 снижает скорость деградации мРНК до скорости деградации в не обработанных клетках для PPAR (Рис. 3.15.а), PPAR (Рис. 3.15.б) и PPAR (Рис. 3.15.в).
Чтобы подтвердить влияние именно активации p38 на время жизни мРНК исследуемых генов, мы оценили скорость деградации мРНК трех изоформ PPAR в присутствии активатора p38 MAPK анизомицина (Рис. 3.16). Мы использовали концентрацию анизомицина, для которой в литературе было показано отсутствие ингибирования белка [121,128]. Было получено, что добавление анизомицина стабилизирует мРНК всех трех изоформ PPAR. Если через 4ч после добавления актиномицина Д уровень мРНК PPAR снижался до 15%, PPAR до 34%, а PPAR до 17%, то прединкубирование клеток с анизомицином перед добавлением Актиномицина Д на 4 часа повышало уровень мРНК до 75%, 52% и 71% для PPAR, PPAR и PPAR соответственно. Кроме того эффект анизомицина на стабилизацию мРНК снимался добавлением селективного ингибитора p38 MAPK SB 203580. Рис. 3.16. Стабилизация мРНК PPARa, -р, -у анизомицином. Астроциты культивировались с добавление анизомицина (1 мкг/мл) в течении 1 часа, после чего инкубировались с ингибитором р38 MAPK SB (SB 203580, 20 мкM. Затем клетки обрабатывались актиномицином Д (5 мкг/мл). Уровень экспрессии мРНК PPAR, - - анализировался методом ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов в контрольных клетках принята за 1. Все эксперименты проводили не менее трех раз. р 0,05 по сравнению с не стимулированными клетками, #р 0,05 по сравнению с анизомицин-стимулированными клетками, р 0,05.
Таким образом, наши данные показывают вовлеченность р38 MAPK в регуляцию экспрессии мРНК PPAR, -, - в TLR-опосредованном ответе астроцитов на пост-транскрипционном уровне.
Было известно, что инкубирование астроцитов с LPS вызывает активацию MAPK и увеличение выброса воспалительных маркеров, прежде всего PGE2 и TNF [6,201]. Специфические ингибиторы МАРК снижают концентрацию маркеров [6]. В последнее время ингибиторы МАРК предлагаются как возможные модуляторы воспаления и глиоза в мозгу [202,203]. Поэтому мы использовали ингибиторы, которые находятся на стадии клинического исследования, и характеризовали их эффект на воспалительный ответ в LPS стимулированных астроцитах. Были выбраны вещества SB203580, U0126, PD98059, SP600125, которые известны как селективные ингибиторы киназной активности p38, MEK1,2, ERK1/2, и JNK соответственно [204–207].
В наших экспериментальных условиях мы показали, что ингибиторы МАРК в используемых нами концентрациях снижают LPS-стимулируемый выброс PGE2 и TNF в условиях гипергликемии и при нормальных концентрациях глюкозы (Рис. 3.9). Эти данные показали, что протестированные MAPK ингибиторы оказывают противовоспалительное действие в тестируемых нами концентрациях. В этих концентрациях ингибиторы использовали и для установления влияния на LPS-стимулируемую модуляцию экспрессии PPAR. Дизайн нашего эксперимента с используемыми агонистами, ингибиторами MAPK и измеряемыми параметрами представлен на схеме (Рис. 3.17).
