Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1 Место PPAR в семействе ядерных рецепторов 9
2.1.1 Место PPAR в классификации семейства ядерных рецепторов 9
2.1.2. Сходство структуры PPAR с другими ядерными рецепторами 12
2.1.3. PPAR - рецепторы жирных кислот, регулирующие метаболизм липидов и действие инсулина 15
2.2. Механизмы PPAR-опосредованной регуляции транскрипции 18
2.2.1. Транскрипционные активности PPAR 20
2.3. Регуляция активности PPAR через уровень их экспрессии 26
2.4. Участие PPAR в регуляции воспалительных процессов в ЦНС
2.4.1. Терапевтические эффекты агонистов PPAR при лечении заболеваний ЦНС 30
2.4.2. Агонисты PPAR регулируют провоспалительные сигнальные пути, участвующие в заболеваниях ЦНС 34
2.5. Астроциты-один из ключевых типов клеток, участвующих в
воспалении 38
2.5.1. Фосфолипазы Аг 41
2.5.2. Циклооксигеназы и их продукты 2.6. Участие PPAR в регуляции функций астроцитов 46
2.7. Заключение 49
3. Материалы и методы 52
3.1. Приборы 52
3.2. Реактивы и препараты 52
3.3. Выделение и культивирование первичных астроцитов крысы 56
3.4. Выделение тотальной РНК 57
3.5. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени 58
3.6. Электрофорез и иммуноблотинг 59
3.7. Трансфекция плазмидой и миРНК 60
3.8. Измерение концентрации простагландина Е2 з
3.9. Измерение ДНК-связывающей активности 62
3.10. Статистический анализ 64
4. Результаты 65
4.1. Взаимосвязь PPAR 65
4.1.1. Взаимосвязь PPAR в нативных астроцитах 65
4.1.2. Влияние LPS на экспрессию PPAR а, (3, у 67
4.1.3. Влияние агонистов PPAR на экспрессию PPARa, Р, у в LPS-стимулированных астроцитах 69
4.1.4. Влияние комбинаций агонистов PPAR на экспрессию PPAR a,p\y 72
4.1.5. Розиглитазон индуцирует экспрессию PPAR(3 через PPARy-опосредованный путь 74
4.1.6. PPARa агонист GW7647 снижает экспрессию PPAR(3 76
4.1.7. L-165041 увеличивает экспрессию и активность PPARa в LPS-стимулированных астроцитах по PPAR3- опосредованному пути 78
4.1.8. Схема взаимосвязи изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах 80
4.2. Участие изоформ PPAR в регуляции экспрессии СОХ 82
4.2.1. Влияние специфических лигандов PPAR на экспрессию СОХ... 82
4.2.2. Изучение физиологической значимости росиглитазон-индуцированной экспрессии СОХ-2 89
4.2.3. Изменение экспрессии СОХ-2 при комбинированном применении PPAR агонистов 90
4.2.4. Центральная роль PPAR(3 в регуляции LPS-индуцированной экспрессии СОХ-2 92
4.3. Роль эндогенных лигандов PPAR, продуцируемых PLA2 и СОХ-2.100
4.3.1. Роль изоформ PPAR при регуляции экспрессии PLA2 100
4.3.2. Участие эндогенных лигандов PPAR в PPAR-опосредованной регуляции СОХ-2 114
5. Выводы 120
6. Список литературы
- Место PPAR в классификации семейства ядерных рецепторов
- Участие PPAR в регуляции воспалительных процессов в ЦНС
- Выделение и культивирование первичных астроцитов крысы
- Влияние комбинаций агонистов PPAR на экспрессию PPAR a,p\y
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рецепторы пролифераторов пероксисом (PPAR) относятся к классу
ядерных рецепторов, регулирующих транскрипцию. Существует три
изоформы этих рецепторов - а, р и у. Синтетические агонисты PPARa и PPARy
используют для лечения гиперлипидемии и диабета 2 типа, и в настоящее
время их предлагают как противовоспалительные средства. Агонисты PPARp
как лекарственные средства ещё не зарегистрированы, тем не менее, они
считаются перспективными для лечения дислипидемии, ожирения и
нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей.
Предполагают, что нарушение функций этих рецепторов приводит к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, возникновению рака, гипертонии, развитию нейродегенеративных заболеваний и хронического воспаления. По этой причине транскрипционные факторы PPAR активно изучаются. Эффективность применения синтетических агонистов PPAR для терапии таких дисфункций мозга как инсульт, травма, болезни Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона и др. была показана на животных. Считается что нейропротективные свойства агонистов PPAR связаны с их противовоспалительными эффектами, поэтому в настоящее время актуальны исследования механизмов действия синтетических агонистов PPAR при воспалении, которое моделируется как на уровне целого организма, так и на уровне клеток мозга.
В развитии воспалительных процессов в мозге ключевая роль принадлежит клеткам глии. Среди глиальных клеток следует выделить астроциты, являющиеся основным источником полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов - важных провоспалительных веществ и эндогенных лигандов PPAR. Ключевыми ферментами продукции полиненасыщенных жирных кислот и простагландинов являются фосфолипазы Аг и циклооксигеназы, соответственно. Эти ферменты относятся к так называемым PPAR лиганд-синтезирующим ферментам. Имеются сведения, что применение синтетических агонистов PPAR может приводить к изменениям уровней экспрессии фосфолипаз и циклооксигеназ, однако влияние лигандов PPAR на экспрессию этих ферментов в астроцитах не изучено. В последние годы было охарактеризовано влияние агонистов
PPARa и PPARy на различные клеточные ответы астроцитов (пролиферацию, выброс цитокинов, и др.), однако экспрессия самих PPAR при этом не изучалась, хотя известно, что изменение экспрессии PPAR является одним из важных механизмов регуляции этих транскрипционных факторов. Не смотря на то, что ряд данных позволяет предположить наличие взаимодействий между изотипами PPAR на уровне взаимной регуляции их экспрессии, в настоящий момент практически не существует работ, посвященных исследованию взаимодействий всех трёх изотипов PPAR.
Способность PPAR регулировать экспрессию своих лиганд-синтезирующих ферментов с одной стороны, и участие лигандов в регуляции экспрессии самих PPAR с другой стороны, указывают на наличие сложной системы взаимодействий между фосфолипазами А2, циклооксигеназами и PPAR. Тем не менее, до сих пор не было попыток изучить эти белки и взаимосвязи между ними как единую систему функционально взаимодействующих белков. Изучению этой системы и посвящена данная работа.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было исследовать взаимосвязь между изоформами PPAR a, р, у и их лиганд-синтезирующих ферментов циклооксигеназы и фосфолипазы А2; установить роль этой взаимосвязи при ответе астроцитов на провоспалительную стимуляцию.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить влияние синтетических агонистов PPAR на экспрессию PPAR a, Р и у; цитозольной и секреторной фосфолипаз А2 и циклооксигеназ.
Установить наличие и характер взаимодействия между изоформами PPAR в астроцитах, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), изучить влияние комбинаций синтетических агонистов PPAR на уровни экспрессии PPAR a, Р и у.
Изучить совместное влияние изоформ PPAR на экспрессию ключевого фермента синтеза простагландинов - циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Установить влияние различных изоформ PPAR на экспрессию цитозольнои и секреторной фосфолипаз Аг в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Установить PPAR-лигандсинтезирующую роль фосфолипаз А2 и циклооксигеназы в регуляции PPAR-опосредованной транскрипции циклооксигеназы в астроцитах, стимулированных ЛПС.
Научная новизна и практическая значимость работы
В работе было впервые показано, что изоформы ядерных рецепторов PPAR а, р и у способны регулировать экспрессию друг друга. В настоящее время многие фармацевтические компании ведут разработки двойных агонистов PPAR, активирующих сразу несколько изоформ PPAR. Данные о взаимодействии изоформ PPAR позволят лучше прогнозировать эффекты этих агонистов.
Впервые было охарактеризовано влияние комбинированного воздействия синтетических PPAR агонистов на уровень экспрессии СОХ-2. С использованием ингибиторного анализа и метода нокдауна получены данные, подтверждающие ключевую роль PPARp в регуляции экспрессии СОХ-2; показано, что эндогенные PPAR лиганды, продуцируемые СОХ-2 и фосфолипазой Аг, участвуют в активации ЛПС-индуцированной транскрипции СОХ-2 за счет связывания с PPARp. Обнаруженные эффекты по влиянию комбинированного применения PPAR агонистов на экспрессию СОХ-2 позволят разработать методы регулирования экспрессии гена этого фермента при терапии заболеваний с воспалительной компонентой.
Показано участие всех трёх изоформ PPAR в регуляции уровня экспрессии цитозольнои и секреторной изоформ фосфолипазы Аг в астроцитах, стимулированных ЛПС. Результаты, демонстрирующие различие в динамике экспрессии фосфолипаз Аг при обработке астроцитов агонистами различных изоформ PPAR, не имеют аналогов в мировой литературе.
В результате проделанной работы была предложена схема системы взаимодействий трёх изоформ PPAR, фосфолипаз Аг и СОХ-2. В данной схеме учитывается влияние как синтетических, так и эндогенных лигандов, продуцируемых при активации фосфолипаз и циклооксигеназы в процессе воспалительного ответа.
Важность полученных результатов для фундаментальной науки и практической медицины заключена в том, что активация этих ферментов является одним из основных компонентов ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний. Результаты этой работы могут найти применение в теоретической и экспериментальной физиологии, патофизиологии и фармакологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIV, XV и XVI международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, Россия, 2007, 2008, 2009), Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация (Пущино, 5-7 июня 2007 г.; 2-4 июня 2009 г.)", 48ой встрече американского общества клеточных биологов в Сан-Франциско «The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting 2008».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Из них статей - 2, статей в сборниках -2, материалов конференций - 6.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на страницах,
содержит рисунков и таблиц, и включает следующие разделы:
«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их
обсуждение», «Выводы» и «Список литературы» ( цитированных работ).
Список сокращений. PPAR- рецепторы активаторов пролиферации пероксисом; СОХ- циклооксигеназа; ФЛА2- фосфолипаза А2; ЛПС-липополисахарид клеточной стенки бактерий; ГАФД- глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; ПНЖК- полиненасыщенные жирные кислоты; ПГ-п роста гланди ны.
Место PPAR в классификации семейства ядерных рецепторов
Семейство ядерных рецепторов человека насчитывает 48 членов, которые можно разделить на три группы [1]. Первый класс состоит из эндокринных рецепторов, имеющих высокое сродство к лигандам (К \ находится в наномолярной области). К этому классу относятся рецепторы жирорастворимых гормонов и витаминов, такие как: рецепторы тироидного гормона, стероидных гормонов и витаминов А, Д и др. (Рис. 2.1). Эти рецепторы играют важную роль в гомеостазе эндокринной системы. Эндокринные рецепторы являются мишенями большого количества лекарственных средств и их лиганды широко используются в клинике.
Вторым классом ядерных рецепторов являются так называемые «усыновленные сироты». Эти рецепторы были обнаружены при поиске генов, гомологичных эндокринным рецепторам, и названы «сиротами», поскольку не были охарактеризованы их эндогенные лиганды. Позже эти лиганды были найдены и рецепторы были «усыновлены». Первым примером такого «усыновления» является идентификация 9-цис ретиноевой кислоты (производная витамина А), в качестве высокоаффинного эндогенного лиганда RXR [2]. Позже, с использованием такого же подхода (его иногда называют «обратной эндокринологией») были найдены многие эндогенные лиганды других типов ядерных рецепторов. Все рецепторы этого класса имеют низкое сродство к лигандам (Kd находится в микромолярном диапазоне).
Второй класс ядерных рецепторов разбивают на два подкласса. Первый покласс - так называемые «липидные сенсоры», к этой группе относят PPAR, а также рецепторы ретиноевой кислоты (RXR), оксистерина (LXR), желчных кислот (FXR), различных ксенобиотиков (Рис. 2.1.). Все эти рецепторы активны в виде гетеродимеров с RXR, при этом некоторые из этих гетеродимеров могут быть активированы лигандами RXR (пермиссивные), а другие нет (непермиссивные), то есть непермессивные RXR гетеродимеры активируются только лигандом второго рецептора [3].
Ко второй группе класса «усыновленных рецепторов сирот» относят рецепторы, для которых известен лиганд, но функция рецептора не ясна. К этой группе относят рецепторы холестерина (RORa), ретиноидов (ROR[3), андростана (конститутивный рецептор андростана; CAR) и фосфолипидов (стероидогенный фактор-1; SF-1 и гомолог человеческого рецептора печени -1; LRH-1) (см. обзор [1]). К этой группе также относят белок HNF4a (ядерный фактор гепатоцитов 4а), который конститутивно связан с молекулой жирной кислоты, а также рецепторы, активность которых может модулироваться синтетическими эстрогенами в нефизиологических условиях (эстроген-связанные рецепторы; ERR(3 и у).
Классификация ядерных рецепторов человека. Адаптировано по [I]. Третий класс ядерных рецепторов состоит из «сирот», чьи лиганды до сих пор не идентифицировании. В этот класс также включают рецепторы, гомологичные другим классам ядерных рецепторов, но активность которых не регулируется лигандами [4, 5]. По всей видимости, эти рецепторы регулируются через доступность коактиваторов, изменение уровня экспрессии самих рецепторов и ковалентную модификацию. Существуют различные свидетельства того, что некоторые из рецепторов этого класса вовлечены в регуляцию метаболизма, что делает их важным объектом исследований [1].
Способность ядерных рецепторов регулировать транскрипцию при связывании с лигандом, модулируя важные функции организма, делает их перспективными мишенями при разработке новых лекарственных средств. Ко многим из них уже созданы лекарственные средства (например, такой глюкокортикоиды как гидрокортизон входит в состав лекарства «Акридерм»). Интенсивно изучают разные аспекты свойств ядерных рецепторов: их эндогенные и синтетические агонисты, локализацию в клетках, механизмы взаимодействия с другими факторами транскрипции и их участие в регуляции различных функций отдельных клеток и всего организма.
Сходство структуры PPAR с другими ядерными рецепторами Все ядерные рецепторы имеют схожую структуру и доменную организацию (Рис. 2.2.). Высоковариабельный ТМНз-концевой участок содержит лиганд-независимьтй активаторный домен (AF-1, Activation function 1). У трех известных изоформ PPAR (ос, р, у) этот участок значительно варьирует. Показано, что активность а и у изоформ может регулироваться за счет фосфорилирования этого домена МАРК [6].
Далее выделяют центральный ДНК-связывающий домен (DBD, DNA-binding domain), который состоит из двух высококосервативньгх мотивов, называемых «цинковые пальцы» (Zf) (Рис. 2.2.). Эти мотивы уникальны для каждого представителя семейства ядерных рецепторов. ДНК-связывающий домен позволяет рецептору связываться со специфическим участком ДНК, который называют гормон-чувствительным элементом HRE (hormon responsive element). Типичный HRE состоит из двух гексануклеотидных последовательностей, разделенных несколькими нуклеотидами (HRE PPAR: TGACCTnTGACCT). Специфичность связывания различных ядерных рецепторов с ДНК определяется, во-первых, разделяющими нуклеотидами и положением гексануклеотидных мотивов и, во-вторых, партнером по димеризации (допустима как гетеро- так и гомо- димеризация). Для PPAR характерно образование гетеродимера с RXR и связывание с прямыми повторами (Рис. 2.2.).
После ДНК-связывающего домена находится петля, которая обеспечивет дополнительную подвижность структуры белка. Это позволяет одному рецептору взаимодействовать с различными последовательностями HRE.
Лиганды ядерных рецепторов связываются с С-концевым лиганд-связывающим доменом (LBD, ligand-binding domain). Этот домен уникален для каждого представителя семейства ядерных рецепторов и отвечает за: (1) димеризацию рецептора; (2) узнавание и связывание лиганда и (3) взаимодействие с кофакторами. А Структура ядерного рецептора
Структура ядерных рецепторов и механизм их связывания с промотером. (А) Схема доменной структуры ядерных рецепторов, (Б) Схема участков димеризации и ДНК-связывания. Обозначения: AF-1 - лиганд-независимый активаторный домен, DBD -ДНК-связывающий домен, ZF - мотивы «цинковые пальцы», LBD — лиганд-связывающий домен, AF-2 - С-концевая спираль, HRE - (hormone responsible element) участок ДНК, связывающийся с димером ядерных рецепторов, GR - гомодимерный эндокринный рецептор (палиндром HRE), RXR/XR - гетеродимеры с рецептором ретиноевои кислоты (прямой повтор HRE) и ERR - мономерный рецептор эстрогена (один HRE мотив). Стрелки: консенсус мотива связывания ядерного рецептора- AGGTCA или вариант. Адаптировано из [1]. LBD состоит примерно из 12 спиралей, последняя из которых называется AF-2 и имеет довольно подвижную структуру. Связывание с лигандом приводит к конформационным перестройкам в AF-2, которые облегчают высвобождение корепрессоров и комплексов гистондеацителазы (HDAC), а также приводят к связыванию ряда коактиваторов и комлекса гистонацетилтрансферазы (HAT) (Рис. 2.2.) [4, 5]. В ряде случаев в активном состоянии участок AF-2 жестко фиксирован, что приводит к конститутивной активации рецептора [1]. В этих случаях активность ядерного рецептора регулируется его собственной доступностью и количеством коактиваторов, или за счет сигнал-индуцируемых посттрансляционных модификаций рецептора, таких как фосфорилирование или ацетилирование [1].
Итак, ядерные рецепторы являются большой группой лиганд-зависимых транскрипционных факторов, имеющих схожее строение. Эти белки способны регулировать транскрипцию различных генов, образуя различные гомо- и гетеро- димеры, связывающиеся со специфическими сайтами ДНК.
Участие PPAR в регуляции воспалительных процессов в ЦНС
Показано, что агонисты PPARy ингибируют LPS-индуцированную секрецию IL-12 [105]. Индукция экспрессии IL-12/IL-23 в антиген-презентирующих клетках регулируется через NF-KB [145]. NF-кВ представляет собой гетеродимерный транскрипционный фактор, состоящий из р50 и р65 субъединиц. Он содержится в цитоплазме в виде неактивного комплекса со своим ингибитором 1/сВ. После стимуляции специфическими индукторами 1кВ фосфорилируется и деградирует по протеасом-опосредованному пути. Активированный NF-кВ затем транслоцируется в ядро и связывается со специфическими сайтами ДНК, находящимися, в частности, в промотерах IL-12, IL-23, IL-27, iNOS и СОХ-2 [145, 146]. Белки семейства NF-кВ (RelA/p65, RelB, c-Rel, p50, p52) широко экспрессированы в ЦНС [147] и активируются при множестве заболеваний ЦНС. Так, при болезни Альцгеймера активация NF-кВ значительно увеличивается по сравнению с контролем. В образцах мозга, полученных от пациентов с болезнью Паркинсона, увеличено количество ядерного р65 (RelA) [148]. Также активность NF-A;B И c-jun значительно повышена у пациентов, страдающих рассеянным склерозом.
Из Табл. 2.5. видно, что трансрепрессия NF-кВ-зависимых компонентов воспалительного ответа осуществляется через PPAR. Эта трансрепрессия играет важную роль при ингибировании воспалительного ответа, а, следовательно, при терапии ряда нейровоспалительных заболеваний. Ингибирование NF-кВ пути агонистами PPAR позволяет предположить механизм регуляции заболеваний ЦНС агонистами PPAR. JAK-STAT сигнальный путь
Взаимодействие антигенпрезентирующих и Т клеток в ЦНС приводит к активации JAK-STAT сигнального пути, секреции провоспалительных цитокинов, и развитию нейровоспалительных заболеваний. Коэкспрессия белков IL-12R/?1 и /?2 приводит к образованию рецептора IL-12 [140]. Связываясь с рецептором, IL-12 активирует Jak2, Tyk2, Stat3, и Stat4 в Т и NK клетках [149]. Активация JAK-STAT пути приводит к увеличению экспрессии IL-12-зависимых генов, ассоциированных с пролиферацией, ТЫ дифференцировкой, и продукцией IFNy. IL-23 рецепторы состоят из общей IL-12R/J1 субъединицы и специфической IL-23 субъединицы [150]. Данный рецептор активирует Jak2, Tyk2, Statl, Stat3, Stat4, и Stat5 в T клетках [149]. Активация JAK-STAT пути приводит к индукции транскрипции IL-23 38 зависимых генов, включая IL-17. Эти гены ассоциированы с пролиферацией Т клеток памяти [151]. Было показано, что блокировка IL-12 опосредованного пути приводит к ингибированию ТЫ дифференцироки и протективно по отношению к экспериментальному аллергическому энцефаломиелиту [152, 153]. Таким образом, JAK-STAT сигнальный путь активно вовлечен в развитие заболеваний ЦНС.
Показано, что агонисты PPARy ингибируют IL-12-индуцированное фосфорилирование Jak2, Tyk2, Stat3, и Stat4 в Т клетках, дифференцировку ТЫ клеток и патогенез экспериментального аллергического энцефаломиелита [153]. Точный механизм, по которому агонисты PPAR осуществляют негативную регуляцию нейровоспаления, до сих пор не изучен. Известно, что PPARy агонисты ингибируют JAK-STAT в астроцитах и микроглии, в то же время они индуцируют экспрессию супрессоров цитокинового сигналинга (SOCS 1 и 3), которые способны ингибировать активность JAK в глиальных клетках [154]. Более того, агонисты PPAR могут модулировать JAK-STAT путь через активацию тирозинфосфатазы SHP2, которая также ингибирует нейровоспалительные заболевания [102].
Таким образом, активация иммунокомпетентных клеток, выброс провоспалительньгх цитокинов, а также активация NF-K:B И JAK-STAT сигнальных путей играют важную роль в патогенезе заболеваний ЦНС. Тонкая модуляция этих сигнальных путей может быть эффективна при лечении нейровоспалительных заболеваний. Ядерные рецепторы PPAR являются многообещающими мишенями для лекарств от различных заболеваний ЦНС, так как они способны модулировать активность всех важных для этих заболеваний сигнальных путей.
Астроцити - один из ключевых типов клеток, участвующих в воспалении В настоящее время показано, что воспалительный ответ при нейродегенеративных заболеваниях может запускаться множеством факторов: белковыми агрегатами, стимулами, выбрасываемыми поврежденными клетками, медиаторами, выделяемыми инфильтрованными в ЦНС иммунными клетками и/или астроцитами [101]. По этой причине астроциты активно изучаются как ключевой тип клеток, участвующий в воспалении ЦНС. Известно, что различные сигнальные молекулы, образующиеся на ранних этапах воспалительного ответа, приводят к гибели нейронов и вызывают нейродегенерацию [155]. Более того, астроциты активируются провоспалительными медиаторами, которые синтезируются иммунными клетками, и эти астроциты начинают продуцировать провоспалитепьные медиаторы уже самостоятельно [156, 157]. Схема участия глиальньтх клеток в развитии воспалительного ответа в ЦНС представлена на Рис. 2.5. Активация астроцитов называется астроглиозом и сопровождает все виды воспаления ЦНС [156]. Избыточный астроглиоз приводит к формированию глиального рубца, который препятствует регенерации аксонов и восстановлению ЦНС (Рис. 2.5.). При этом нарушаются взаимодействия астроцитов с нейронами, усиливается пролиферация астроцитов в местах повреждения [157]. Избыточный астроглиоз характерен для таких заболеваний как рассеянный склероз, болезнь Паркинсона и др. [127].
Среди множества провоспалительных медиаторов, выбрасываемых активированными астроцитами, следует выделить фактор некроза опухолей-(TNF-cc), интерлейкин (IL)-ip и интерферон-у (IFN-y) (Рис. 2.5.). Эти провоспалительные цитокины участвуют в развитии множества заболеваний ЦНС [101].
Выделение и культивирование первичных астроцитов крысы
Тотальная РНК выделялась из астроцитов с помощью набора RNeasy (Qiagen, Германия). После отбора культуральной среды клетки дважды промывали PBS и лизировали в 600 мкл RLT буфера. Гомогенизацию клеток проводили пипетированием. К гомогенату лизированных клеток добавляли 600 мкл 70 % этанола, после чего смесь тщательно перемешивали. Полученный образец наносили на микроцентрифужную колонку и пропускали через нее при 10000 об/мин в течение 1 мин, проскок отбрасывали. Для промывки на колонку наносили 350 мкл буфера RW1, после чего колонка центрифугировалась 1 мин при 10000 об/мин. Далее, сорбированные на колонке нуклеиновые кислоты обрабатывали ДНКазой. Для этого использовался набор RNase-Free DNase Kit (Qiagen, Германия). 10 мкл стокового раствора ДНКазы I смешивали с 70 мл буфера RDD. 10 мкл полученного раствора наносили на колонку и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Далее на колонку наносили 350 мкл буфера RW1 и центрифугировали 1 мин при 10000 об/мин. Колонка RNeasy переносилась в другую 2 мл пробирку-коллектор и в нее добавляли 500 мкл RPE буфера. Затем центрифугировали колонку 1 мин при 10000 об/мин. Проскок отбрасывали и вновь добавляли в колонку 500 мкл RPE буфера. Затем центрифугировали колонку 2 мин на максимальной скорости, чтобы тщательно просушить мембрану. В итоге колонку вставляли в 1,5 мл пробирку-коллектор и наносили в центр мембраны колонки 30 мкл воды свободной от РНКаз. После 10 мин инкубации при комнатной температуре колонка центрифугировалась 1 мин при 10000 об/мин, чтобы эллюировать тотальную РНК. Для определения концентрации РНК и отсутствия примесей ДНК в образце РНК, 10 мкл раствора тотальной РНК разводили в буфере ТЕ в 100 раз, далее с помощью спектрофотометра (Pharmacia Biotech, Германия) в кварцевых кюветах измеряли оптическую плотность раствора при 260 нм и 280 нм.
Концентрацию РНК определяли по адсорбции при длине волны 260 нм (A260). A260 равное 1, соответствует 40 мкг РНК. Расчет концентрации образца проводили по формуле: А260 100(фактор разведения) 40 мкг/мл = [концентрация образца] мкг/мл РНК Примеси ДНК определяли, исходя из соотношения А260/А280. Работу проводили только с образцами, где соотношение А260/А280 было больше 1,9. Отсутствие деградации РНК подтверждали агарозным РНК электрофорезом. Выделенную РНК замораживали и хранили при -80С.
Обратную транскрипцию проводили в амплификаторе ТЗ Thermocycler (Biometra, Германия) по следующей программе: реакционная смесь инкубировалась 5 мин при 25С, затем 30 мин при 42 С и 5 мин при 85С, в конце программы смесь охлаждалась до 4С.
ПЦР в реальном времени является количественным методом, основанным на флуоресценции красителя SYBR Green, связанного с двуцепочечной ДНК. Для количественных измерений использовали экспоненциальное приближение зависимости интенсивности флуоресценции от количества двуцепочечной ДНК. По результатам, полученным на пробах с последовательным разведением кДНК, выбирали пороговый уровень флуоресценции, далее для каждой пробы вычисляли цикл на котором это значение достигается (Q)- Концентрацию любой мРНК вычисляли как 2" . Затем значения нормировали на уровень GAPDH, а уровень экспрессии гена в контрольных клетках принимали за 1.
Специфичность амплификации подтверждали агарозным электрофорезом и анализом кривых плавления ПЦР-продукта. Кривая плавления ПЦР продукта представляет собой график, отображающий зависимость интенсивности флуоресценции ПЦР-продукта, связанного с SYBR Green, от температуры смеси. Температура плавления каждого ПЦР продукта специфична и позволяет доказать отсутствие неспецифических продуктов и димеров праймеров в ПЦР смеси. ПЦР в реальном времени проводили с помощью набора iQSYBRGreen Supermix (BioRad). Для проведения реакции замешивали следующую смесь:
Реакцию проводили в амплификаторе iCycler (Bio-Rad) по следующей программе: 95С - 3 мин; затем сорок циклов: 94С - 30 сек, 60С — 30 сек, 72С— 1 мин; после завершения циклов строили кривые плавления (скорость изменения температуры 0,5С/сек, температура варьировала от 60С до 95С).
Перед проведением иммуноблотинга образцы смешивали с буфером Лэмли. Далее образцы разделяли с помощью белкового денатурирующего электрофореза в 10% SDS ПААГ геле. На каждую дорожку наносили 10 мкг тотального белка. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Protran ВА83, Whatman, Германия). Равномерность переноса контролировалась окраской по Понсо. Забивку мембран проводили при их инкубации с 10% раствором реактива Rotiblock (Roth, Германия) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем мембрану 3 раза отмывали в буфере PBST; часовую инкубацию с первичными антителами (СОХ-1, СОХ-2 (1:1000), PPARa, PPAR(3, PPARy, sPLA2 и cPLA2 (1:200)) проводили в PBST. После трехкратной отмывки в буфере PBST мембраны инкубировали со вторичными антителами в течение часа при комнатной температуре. Мембраны проявляли с помощью набора хемилюминесценции (Super-Signal West Pico; Pierce, Германия). Для иммуноблотинга р-тубулипа мембрану 30 мин инкубировали в буфере для «отшпаривания» при 40С, после инкубации мембрану промывали водой 5 раз. Далее мембрану гибридизовали с первичными антителами к Р-тубулину (1:10000) и со вторичными антителами «anti-mouse IgG» (Dianova, Германия). Интенсивность сигналов измеряли денситометрией с помощью прибора GS-800 (Bio-Rad, Германия).
Магнитную трансфекцию клеток проводили с помощью реактивов МАТга-А. Перед трансфекцией клетки культивировали на 21,5 см2 чашках Петри до образования монослоя. 6 мкг миРНК или плазмидьт растворяли в 400 мкл культуральной среды и смешивали с 6 мкл реагента «МАТга-А Reagent». Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем в смесь добавляли к клеткам, находящимся в 3,5 мл культуральной среды. Чашку Петри помещали на магнитный штатив. После 15 мин инкубации чашку Петри снимали с магнитного штатива и меняли культуральную среду. Эффективность сверхэкспрессии и нокдауна проверялась иммуноблотингом через 36 часов (Рис.3.1.).
Влияние комбинаций агонистов PPAR на экспрессию PPAR a,p\y
Обнаруженное влияние росиглитазона на экспрессию СОХ-2 исключительно важно в свете предполагаемого использования синтетических PPAR агонистов как нейропротективных средств. Поэтому нами были проведены исследования по влиянию росиглитазона на выброс физиологически активных медиаторов воспаления- простагландинов. Был разработан метод количественного определения концентрации простагландинов с помощью метода масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением [228]. В рамках этой работы было предложено использовать метод масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для количественного анализа простагландинов и полиненасыщенных жирных кислот с длинной углеродной цепи С18-С22. Показали, что анализ данных веществ можно проводить одновременно, в наномолярном диапазоне концентраций, без предварительного хроматографического разделения.
В ходе исследования астроцитов было показано, что концентрации всех изучаемых простагландинов при ответе астроцитов на LPS меняются согласованно с простагландином Е2, который является общепризнанным маркером воспаления. Поэтому далее активность полиферментной системы синтеза простагландинов оценивалась по уровню выбрасываемого астроцитами простагландина Е2, который измеряли иммуноферментным методом. Был показано, что стимуляция астроцитов LPS приводит к выбросу простагландина Ег, концентрация которого становится равной 1,1±0,11 нг/мл, а росиглитазон PPARy увеличивает этот выброс до концентрации 2,1±0,09 нг/мл. Действие росиглитазона снимается в присутствии антагониста PPARy, который снижает уровень простагландина Е2 до 0,9±0,12 нг/мл. Таким образом, обнаруженная росиглитазон-индуцированная экспрессия СОХ-2 является физиологически значимой.
Изменение экспрессии СОХ-2 при комбинированном применении PPAR агонистов. Так как эффекты взаимодействия изоформ PPAR наиболее ярко проявляются при комбинированном применении их синтетических агонистов, то мы изучили экспрессию СОХ-2 в LPS-стимулированных астроцитах, обработанных различными комбинациями синтетических PPAR агонистов. Получено, что при совместной обработке астроцитов росиглитазоном и GW7647 уровень экспрессии СОХ-2 не изменился по сравнению с клетками обработанными только PPARy агонистами (Рис. 4.13. А; столбцы 2 и 3). Комбинированная обработка клеток PPARa и PPARp агонистами не приводила к изменению экспрессии СОХ-2 по сравнению с LPS-стимулированными астроцитами (Рис. 4.13. А; столбцы 1 и 5). Одновременная обработка клеток PPARy и PPAR(3 агонистами приводила к 3-х кратному увеличению экспрессии СОХ-2 по сравнению с LPS-стимулированными астроцитами (Рис. 4.13. А; столбцы 1 и 4), однако это увеличение снималось при добавлении агониста PPARa (сравнение столбцов 4 и 6 на Рис. 4.12. А). С использованием метода иммуноблотинга показано, что данные по количеству мРНК СОХ-2 соответствуют данным по количеству белка (Рис.4.13. Б). GW7647
Влияние комбинаций синтетических агонистов PPARa, р и у на уровни экспрессии СОХ-2 в LPS-стимулированных астроцитах. Астроцити предынкубировали в течение 10 мин с GW7647 (1мкМ), L-165041 (1 мкМ) иросиглитазоном (Ros, 20 мкМ) или циглитазоном (Cig, 40 мкМ). Затем клетки стимулировали LPS (100 нг/мл). (А) Через 4 часа с помощью ПЦР в реальном времени измеряли уровни мРНК СОХ-2 (см. Материалы и методы). Результаты нормировали на GAPDH. (Б) Количество белка изоформ PPAR определяли с помощью иммуноблотинга. (В) Астроциты предынкубировали в течение 10 мин с L-165041 (1 мкМ) и с указанной концентрацией росиглитазона. Затем клетки стимулировали LPS (100 нг/мл). Через 4 часа с помощью ПЦР в реальном времени измерячи уровни мРНК СОХ-2 (см. Материалы и методы). Результаты нормировали на GAPDH. Экспрессия СОХ-2 в контрольных клетках принята за 1. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Все эксперименты проводили не менее трёх раз, ( р 0,05). Предобработка астроцитов агонистом PPARp увеличивала их чувствительность к обработке росиглитазоном (Рис. 4.13. В). 1 мкМ росиглитазона при одиночном добавлении не влиял на экспрессию СОХ-2, тогда как в сочетании с PPARP агонистом L-165041 эта же концентрация росиглитазона увеличивала экспрессию СОХ-2 (Рис. 4.13. В). Таким образом, совместное применение агонистов PPARp и PPARy позволяет снизить действующую концентрацию PPARy агонистов.
Таким образом, показано, что взаимодействия между изоформами PPAR вносят значительный вклад в регуляцию экспрессии СОХ-2, ключевого фермента синтеза простагландинов в активированных астроцитах.
Поскольку мы показали, что агонист PPARy росиглитазон приводит к индукции экспрессии PPARp, то логично было предположить, что этот эффект может быть причиной наблюдаемого потенцирования экспрессии СОХ-2 росиглитазоном. Для доказательства этой гипотезы мы использовали астроциты с нокдауном PPARp. На этих клетках были изучены эффекты комбинированного применения PPARy агониста росиглитазона с PPARP агонистом L-165041.
Получено, что уровень экспрессии СОХ-2 в LPS- стимулированных астроцитах при нокдауне PPARp не изменяется по сравнению с контролем (Рис. 4.14. А. столбцы 1 и 2). Мы также показали, что нокдаун PPARp не только убирает эффект сочетанного применения росиглитазона и L-165 041 (Рис. 4.14. А.; сравнение столбцов 5 и 6), но также ингибирует эффект одного росиглитазона (сравнение столбцов 3 и 4 на Рис. 4.14. А). Эти результаты позволяют сделать вывод, что для проявления эффекта росиглитазона на экспрессию СОХ-2 необходимо наличие активного PPARp.
