Введение к работе
Актуальность темы
Успехи в области генетической инженерии растений, исследования фундаментальных механизмов экспрессии растительных генов, открьши новые возможности в использовании растений в качестве биофабрик для получения рекомбинантных белков, в том числе белков медицинского назначения, таких как антитела, вакцины и тп Производство целевых белков в растениях имеет существенные преимущества по сравнению с использующимися в настоящее время для этих целей системами экспрессии на основе клеток животных, дрожжей или бактерий Культивирование растений не требует больших затрат, за счет чего стоимость целевых белков, выделяемых из растений, оказывается существенно ниже стоимости аналогичных продуктов, полученных в других экспрессионных системах Кроме того, использование растений вместо микроорганизмов или клеток животных исключает риск передачи человеку патогенов или токсинов Использование трансгенных растений в качестве «биофабрик» является одним из приоритетов все большего числа международных биотехнологических компаний Однако широкое использование этого подхода сдерживается в настоящее время низкой эффективностью систем экспрессии Наряду с эффективностью транскрипции, уровень экспрессии генов растений может регулироваться на стадии трансляции мРНК Эффективные трансляционные энхансеры могут, во-первых, повысить уровень экспрессии целевого гена, а во-вторых, обеспечить его специфическую трансляцию в определенных тканях или в определенных условиях внешней среды
Существенной проблемой при создании растений - «биофабрик» является достижение высокого уровня экспрессии целевых генов в условиях роста растений, отличающихся от нормальных (например, гипоксия, обусловленная затоплением, повышенная или пониженная температура, засуха и другие стрессы) Проблема экспрессии в стрессовых
условиях связана со снижением эффективности трансляции большинства растительных (а также чужеродных) мРНК, что, соответственно, приводит и к снижению выхода целевого продукта Разработка технологий эффективной экспрессии генов в стрессовых условиях необходима также для конструирования трансгенных растений, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессам, поскольку «анти-стрессовый» продукт должен эффективно синтезироваться именно в этих условиях
Целью настоящей работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях Для создания этой системы мы использовали в качестве трансляционного энхансера лидерную последовательность мРНК гена алкогольдегидрогеназы кукурузы, adhl, эффективно транслирующегося в условиях гипоксии
Кроме обычного механизма кэп-зависимой трансляции, у эукариот в некоторых случаях реализуется и механизм внутренней инициации трансляции, направляемой сайтом внутренней посадки рибосом (IRES -internal ribosome entry site) Впервые IRES был обнаружен у вируса полиомиелита Позднее IRES-сайты были обнаружены в РНК других вирусов, а также в ряде клеточных мРНК В основном белки, транслируемые с таких клеточных мРНК, являются регуляторными (некоторые ростовые факторы, транскрипционные и трансляционные факторы и др.) В настоящее время активно обсуждается гипотеза, согласно которой кэп-независимая внутренняя инициация трансляции у эукариот может являться одним из способов экспрессии генов, который функционирует в случаях, когда эффективность нормальной кэп-зависимой трансляции снижается, например, при вирусной инфекции, в стрессовых условиях, канцерогенезе и апоптозе
Мы предположили, что adh обеспечивает эффективную трансляцию мРНК в стрессовых условиях вследствие наличия в ней IRES-сайта Гипотеза о том, что adh обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции
мРНК, была проверена экспериментально в настоящей работе и подтверждена, вклад IRES по сравнению с обычной кэп-зависимой инциацией трансляции был определен количественно Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является характеристика лидерной последовательности гена adhl алкогольдегидрогеназы кукурузы (adh) в качестве трансляционного энхансера, активного в стрессовых условиях, и сайта внутренней инициации трансляции Практической целью работы является создание системы, обеспечивающей эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях Задачи работы
Анализ влияния adh в 5' НТО мРНК на уровень экспрессии целевого гена в стрессовых условиях в клетках растений Nicotiana benthamiana
Изучение эффективности функционирования adh в качестве сайта внутренней инициации трансляции в системах трансляции in vitro
Оценка эффективности функционирования adh в качестве сайта внутренней инициации -фансляции т vivo в клетках растений Nicotiana benthamiana
Оценка вклада внутренней инициации трансляции в общую эффективность трансляции мРНК, содержащей adh, в клетках растений Nicotiana benthamiana в нормальных и в стрессовых условиях
Научная новизна и практическая значимость работы
Установлено, что лидерная последовательность мРНК гена adhl является трансляционным энхансером, эффективным в стрессовых условиях Ее присутствие в 5' НТО мРНК обеспечивает уровень экспрессии целевого гена в условиях гипоксии и теплового шока, сопоставимый с уровнем экспрессии в аэробных условиях, в то время как эффективность трансляции большинства мРНК значительно снижается
Показано, что adh является IRES-сайтом и обеспечивает внутреннюю инициацию трансляции мРНК in vivo и in vitro, что позволяет использовать
adh в качестве межцистронной области при экспрессии бицистронных конструкций в растениях Однако в результате выполнения работы установлено, что эффективность внутренней инициации трансляции, обеспечиваемой adh, составляет менее 1% от общего уровня трансляции мРНК как при нормальных условиях, так и при условиях теплового шока Таким образом, эффективная трансляция содержащей adh мРНК в стрессовых условиях происходит не за счет внутренней инициации трансляции
Практическая значимость работы состоит в разработке метода, обеспечивающего эффективную трансляцию мРНК и экспрессию целевого гена в растениях в стрессовых условиях за счет включения трансляционного энхансера adh в кассету экспрессии между промотором и целевым геном Апробация работы
Полученные в диссертации результаты были представлены автором на следующих международных и российских конференциях "Системная биология и биоинженерия" (Москва, 2005), "Генетика в России и мире", (Москва, 2006), "Биология - наука XXI века " (Пущино, 2006), "Translation Control and Non-Coding RNA Meeting" (Новые Грады, Чехия, 2006), "Ломоносов-2007" (Москва, 2007), "Gene expression and analysis" (Манчестер, Великобритания, 2008) Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 91 странице машинописного текста и включают 26 рисунков и 10 таблиц Диссертация состоит из разделов "Введение", "Цели и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 4 отечественных и 132 иностранных источника
Похожие диссертации на Роль лидерной последовательности гена алкогольдегидрогеназы кукурузы в регуляции трансляции мРНК
