Введение к работе
Актуальность проблемы. Геном эукариот отличается от генома прокариот в первую очередь большими размерами и сложностью организации. Суммарное количество ДНК гаплоидного набора может быть измерено в пикограммах. Так в каждой диплоидной клетке человека содержится около 6 пикограммов ДНК, а общая длина гаплоидного набора оценивается в 3,5х10чпар пуклеотидов (Као Г\-Т., 1985). Размер генов прокариот составляет в среднем 3 - 4кб., следовательно, количества ДНК, содержащегося в гаплоидном наборе человека, вполне достаточно для кодирования по крайней мере миллиона генов. Однако, по многим независимым оценкам истинное число структурных генов человека лежит в пределах 50000 -100000, и, вероятнее всего, составляет около 80 000. Если сопоставить это значение со средними размерами гена и соотношением между размерами интронных и экзонных областей, получается, что кодирующие последовательности занимают не более 10 % всего генома (McKusick V. A., Ruddle F. Н., 1977; Singer, 1982). Таким образом, основная часть молекулы ДНК человека, как и других эукариот, не несет информации об аминокислотной последовательности белков, не кодирует структуру различных типов РНК, а представляет собой некую "избыточную" ДНК, функции которой в значительной степени до сих пор не изучены, хотя ее структура выяснена достаточно подробно. В составе этой "избыточной" ДНК выделяют три фракции - высокоповторяющихся, умеренно повторяющихся, и уникальных последовательностей. Высокоповторяюшиеся последовательности многократно представлены в геноме (до 106 копий), в их состав входят 4 основные типа сателлитной ДНК, альфоидные повторы, мини- и микросателлнтные последовательности, инвертированные повторы. Группа умеренно повторяющихся последовательностей генома человека составляет около 20 % и представлена множеством классов гетерогенных по длине и числу копий (от 10 до 10 ) последовательностей. Подлине повторяющихся элементов последовательности этой группы принято делить на короткие (Sines), повторенные в геноме 10 раз и имеющие длину до 500 н.п. и более длинные (Line), повторенные в геноме не более чем 10 000 раз. Половина - (10% генома) всех умеренно повторяющихся последовательностей входит в состав двух основных семейств умеренных повторов - Alu и Крп I. Уникальные не кодирующие последова-
телыюстн представлены псевдогенами, нитронами и регуля горными элементами генома. Относительно функции "избыточной" ДНК имеется ряд предположений. Она может участвовать в регуляции экспрессии генов и процессинге РНК, выполнять структурные функции, повышать точность рекомбинации, способствовать успешной репликации, накапливать в себе неизбежно возникающие в процессе фило- и онтогенеза мутации, не имеющие фенотипическо-го проявления, иметь эволюционную значимость и так далее. Но все же, получается, что человек практически мало что знает о функциональной роли (или отсутствии таковой) 90 % , то есть, основной части собственного генома. Изучение этой части генома представляет большой теоретический и практический интерес, так как позволит понять механизмы эволюции и функционирования генома и может дать возможность влиять на работу генов, выявлять предрасположенность к различным наследственным патологиям, идентифицировать личность на генетическом уровне, устанавливать отцовство и тому подобное.
Данная работа посвящена изучению распределения, происхождения и роли в регуляции генной экспрессии самого многочисленного по числу копий семейства умеренно повторяющихся последовательностей генома человека - АІіі-повторов.
Цели и задачи исследования. Цель работы заключалась в выяснении распределения Alu - повторов и их ориентации в индивидуальных хромосомах человека, получении экспериментального подтверждения гипотезы автора о происхождении Alu-повторов и выяснении возможной роли Alu-повторов в регуляции экспрессии белок кодирующих генов. Исходя из этого были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Выяснить распределение инвертированных Alu-повторов в индивидуальных хромосомах человека.
-
Показать наличие в геномах некоторых рыбообразных, рыб и беспозвоночных нуклеотидных последовательностей, гомологичных различным областям Alu-повторов человека.
-
Показать наличие в Alu-повторах различных регуляториых элементов, модулирующих экспрессию белок кодирующих генов.
-
Изучить инсерционно - делеционнын полиморфизм Alu-пов-тора в 16 интроне гена ангиотензин-1-конвертирующего фермента человека у жителей С.-Петербурга и Ленинградской области.
Научная новизна. Впервые показано распределение инвертированных Alu-повторов в 1, 3 и 13 хромосомах человека. На основе длины участков ДНК, фланкированных Alu-повторамн, получены фин-герпринты указанных хромосом и предложен метод іщентнфикацин человеческого материала в гибридных клетках. Показана возможность использования для физического картирования генома человека фланкированных AIu-повторами последовательностей, выделенных из пулов и индивидуальных клонов хромосомспецифическнх клонотек, созданных на основе фага А. и космид, а также из изолированных хромосом. В составе внеклеточной ДНК крови женщин во время первого триместра беременности показано наличие фрагментов, фланкированных Alu-повторами, исчезающих во втором триместре. Обсуждена возможная роль описанных структур в онтогенезе. Впервые показано, что в геномах некоторых рыбообразных, рыб, моллюсков н иглокожих имеются структуры, подобные отдельным областям Alu-повторов человека. Выдвинута гипотеза происхождения Alu-повторов приматов путем "самосборки" из блоков, уже имеющихся в геномах более примитивных животных, то есть происхождения независимым путем от других гомологичных повторяющихся элементов генома приматов. Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ) в человеческих промоторах, м-РНК и ре-тропозонах Alu семейства. Показано, что плотность этих сайтов значительно выше в промоторах и Alu-повторах, чем в м-РНК, и что Alu-повторы потенциально способны регулировать экспрессию белок кодирующих генов посредством модуляции транскрипции, осуществляемой при помощи РНК полимеразы II. Выяснено, что встречаемость Alu - повтора в 16 нитроне гена анпютензнн-1-конвертирующего фермента у жителей С.-Петербурга и Ленинградской области соответствует таковой в европейских популяциях. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе результаты важны для понимания структуры, функционирования и эволюции повторяющихся элементов генома человека -Alu-повторов. В практическом отношении полученные результаты представляют интерес при проведении медико-генетического консультирования и преподавании этой дисциплины в медицинских институтах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на первой (Переславль-Залесскин 1990), второй (Переславль-
Залесский 1991) всесоюзных и третьей (Черноголовка 1993) всероссийской конференциях по программе "Геном человека", первой европейской конференции "Организация генома человека" (Гейдельберг 1990), восьмой конференции Международного Общества Дифференцировки (ISD) (Хиросима 1994), пятом Всероссийском совещании по систематике, биологии и биотехнике разведения лососевых рыб (С.-Петербург 1994), четвертом европейском конгрессе по биологии клетки (Прага 1994), всероссийской конференции "Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики" (Уфа 1998) и на совместном семинаре лаб. стабильности хромосом и клеточной инженерии, лаб. радиационной цитологии и лаб. биохимических основ репродукции клеток Института цитологии РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на /JTP страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 15 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает, наименований, из них MS на иностранном языке.
Похожие диссертации на Консервативные нуклеотидные последовательности ретропозонов Alu семейства: происхождение и роль в регуляции генной экспрессии
