Содержание к диссертации
Предметная областьПоследовательности ДНК генов
Гены, кодирующие белки б
Гены транспортных РНК
Актуальность проблемы
Постановка задачи
Научная новизна
Практическое значение работы
Положения, выносимые на защиту
Структура и объем диссертации
Опубликование и апробация результатов работы
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Определение спектра научных работ для литературного обзора
1.2. Изучение триплетнои периодичности последовательностей оснований
1.2.1. Феномен триплетнои периодичности в кодирующих последовательностях ДНК
1.2.2. Методы поиска триплетнои периодичности, основанные на позиционнозависимых предпочтениях нуклеотидов в кодирующих последовательностях
1.2.3. Методы поиска триплетнои периодичности с помощью корреляционного анализа и преобразований Фурье
1.2.4. Методы поиска триплетнои периодичности, основанные на динамическом программировании
1.2.5. Методы поиска триплетнои периодичности, основанные на нейронных сетях
1.2.6. Метод информационного разложения последовательностей ДНК
1.2.7. Выбор метода поиска триплетнои периодичности в последовательностях ДНК
1.3. Мутации, приведшие к сдвигу рамки считывания в гене
1.3.1. Биологическое значение сдвига рамки считывания в гене
1.3.2. Сравнительный обзор методов поиска возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в гене
1.4. Сравнительный обзор методов поиска отдаленного подобия между последовательностями и последовательностями и их семейством
1.4.1. Методы поиска гомологии между последовательностями ДНК
1.4.2. Алгоритм Нидельмана-Вунша
1.4.3. Эвристические алгоритмы для поиска гомологичных последовательностей ДНК
1.4.4. Применение скрытых Марковских моделей
1.4.5. Профильный анализ
1.4.6. Алгоритм модифицированного профильного анализа
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Классификация триплетнои периодичности в кодирующих последовательностях ДНК
2.1.1. Поиск триплетнои периодичности в кодирующих районах ДНК
2.1.2. Алгоритм классификации триплетнои периодичности
2.2. Алгоритм поиска возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности триплетнои периодичности со вставками и делециями символов
2.2.1. Влияние вставок и делеций символов на триплетную периодичности
2.2.2. Построение оптимального выравнивания искомой последовательности относительно профиля триплетнои периодичности
2.2.3. Алгоритм оптимизации параметров поиска слабовыраженного подобия последовательностей ДНК к заданному семейству последовательностей методом модифицированного профильного анализа
2.2.4. Алгоритм поиска периодичности со вставками и делециями символов в областях последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности
2.2.5. Поиск белковых подобий для продуктов действующей и древней рамки считывания гена
2.3. Поиск тРНК-подобных последовательностей
2.3.1. Сравнение чувствительности метода модифицированного профильного анализа с известными аналогами при поиске тРНК-подобных последовательностей
2.3.2. Классификация тРНК-подобных последовательностей
2.3.3. Поиск прямых фланкирующих повторов
2.4. Программная реализация используемых алгоритмов
Глава 3. Разработка баз данных с результатами исследований
3.1. Разработка базы данных последовательностей ДНК со скрытой периодичностью
3.1.1. Методы и источники данных
3.1.2. Логическая структура БД
3.1.3. Интерфейс пользователя
3.1.4. Перенос данных по периодичности на ЭВМ пользователя
3.1.5. Сравнительный анализ созданной БД с существующими аналогами
3.2. Разработка базы данных тРНК-подобных последовательностей в геномах различных видов
3.3. Разработка базы данных по классификации триплетнои периодичности
3.3.1. Логическая структура БД
3.3.2. Интерфейс пользователя
3.4. Разработка базы данных по триплетнои периодичности со вставками и делециями символов в областях кодирующих последовательностей ДНК, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности
Глава 4. Результаты
4.1. Поиск непрерывной триплетнои периодичности в кодирующих последовательностях генов БД KEGG
4.2. Классификация триплетнои периодичности
4.3. Возможные мутации, приведших к сдвигу рамки считывания в кодирующих последовательностях ДНК
4.3.1. Пример №1. Цинковый палец приматов
4.3.2. Пример №2. Глютамат-дегидрогеназа
4.3.3. Пример №3. Пример выявления вероятной ошибки секвенирования
4.3.4. Пример №4. Пример аннотации (фактор элонгации)
4.4. Возможные мутации, приведшие к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности
4.4.1. Пример №1. Кодирующая последовательность гена виментина
4.4.2. Пример №2. 2-дегидро-З-деоксигалактонат киназа
4.5. тРНК-подобные последовательности в геномах различных видов
4.5.1. Анализ расположения выявленных тРНК-подобных последовательностей в аннотированных последовательностях GenBank
4.5.2. Поиск прямых повторов, фланкирующих районы, содержащие тРНКподобные последовательности
4.5.3. Дополнительные инструменты анализа
4.5.4. Основные результаты
4.5.5. Анализ расположения выявленных тРНК-подобных последовательностей в аннотированных последовательностях GenBank
4.5.6. Анализ изотипического состава тРНК-подобных последовательностей
4.5.7. Идентификация возможных мобильных элементов (transposable elements), содержащих тРНК-подобные последовательности
4.5.8. Состав классов тРНК-подобных последовательностей
4.5.9. Идентификация районов, содержащих тРНК-подобные последовательности, известными повторами
4.5.10. тРНК-подобные последовательности в известных повторах
Выводы
Введение к работе
Предметная область Последовательности ДНК генов В представленной работе предметом исследования являются последовательности нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), которые содержатся во всех известных живых организмах. Эти последовательности играют роль носителей генетической информации, обеспечивая развитие и функционирование живых систем. С помощью символьных последовательностей этого четырехбуквенного алфавита закодирована основная часть программы клеточного развитие, определяющей ее функционирование как системы во внешнем окружении.
В настоящее время для определения последовательностей ДНК (секвенирования) существуют высокоэффективные методы, позволяющие в промышленных масштабах полные последовательности ДНК (геномы) организмов. Развитие этих методов является причиной экспоненциального роста объема полученных последовательностей ДНК. Так, за последние 25 лет объем крупнейшего БД генетических последовательностей GenBank удваивался каждые 18 месяцев [18]. Динамика роста объема последовательностей в нем показана ниже (Рисунок 1).
g 1е+09 с о ш 2
01/82 01/85 01/88 01/91 01/94 01/97 01/00 01/03 01/06 01/09 месяц/гад РИСУНОК 1. РОСТ ОБЪЕМА БД GENBANK Кроме отдельных участков последовательностей ДНК различных организмов получены полные последовательности ДНК более чем 500 прокариот (бактерий и архей) и 20 эукариот, в том числе для человека и мыши. Такой массив первичных данных позволяет выявлять свойства последовательностей ДНК, присущие разнообразным видам организмов.
Настоящее исследование посвящено анализу функционально наиболее значимой структуры последовательностей ДНК - генов. Существуют два вида генов: белоккодирующие гены (синтез белков происходит посредством многоступенчатых механизмов транскрипции и трансляции, преобразующих последовательности РНК в последовательности аминокислот) и РНК гены (они рассмотрены на примере генов транспортных РНК).
Гены, кодирующие белки Значительная, особенно у прокариот, часть функциональных последовательностей ДНК кодирует аминокислотные последовательности белков. В клетках эукариот последовательности генов, кодирующие белок, разбиты на участки, называемые экзонами, между которыми находятся некодирующие участки - интроны. Интроны удаляются после транскрипции ДНК на этапе сплайсинга. В настоящей работе рассмотрены последовательности матричной ДНК (CDS), которые содержат только кодирующие белок нуклеотиды. В этих последовательностях наиболее явно наблюдается триплетная периодичность кодирующих последовательностей, тесно связанная стриплетным генетическим кодом, с помощью которого синтезируется аминокислотная последовательность.
Триплетная организация последовательностей ДНК, кодирующих белки, является свойством всех известных на настоящее время живых систем. Причинами периодичности являются избыточность генетического кода, предпочтения в использовании специфичных кодонов для кодирования аминокислот, а также насыщенность белков определенными аминокислотами. Существует также гипотеза, что триплетная периодичность может возникнуть вследствие необходимости контроля за мутациями посредством сдвига рамок считывания. В данном исследовании с помощью метода информационного разложения символьных последовательностей она была обнаружена в 79% кодирующих районов ДНК. Как показано в данной работе, триплетная периодичность имеет корреляцию с рамкой считывания в гене, т.е. фаза периодичности привязана к первой позиции кодонов, кодирующих аминокислоты. Отметим также, что, как показано автором, триплетная периодичность не может исчезнуть в отдельных эволюционных событиях, таких как замены нуклеотидов или же инверсии последовательностей оснований ДНК. При делециях и вставках периодическая последовательность разбивается на подпоследовательности, также обладающие периодичностью, но с различными фазами. Поэтому триплетная периодичность может служить эффективным инструментом для выявления в генах районов, в которых произошел эволюционный сдвиг рамки считывания или инверсия последовательности оснований ДНК. Гены транспортных РНК Транспортные РНК (тРНК) вместе с различными РНК, входящими в состав рибонуклеопротеиновых комплексов (в первую очередь рибосомальными РНК), по праву могут считаться одними из самых древних последовательностей генома, возникших еще во времена РНК-мира [69]. Четкая, относительно простая пространственная структура транспортных РНК, их способность быть узнанными специальными ферментами, среди которых аминоацил тРНК-синтетазы, РНКаза Р, различные модифицирующие ферменты, факторы инициации и элонгации биосинтеза, а также и то, что гены тРНК (tDNAs) содержат внутри себя промотор для РНК полимеразы III, сделали их привлекательными объектами для использования в других функциональных процессах в геноме. Например, для ретровирусов тРНК клеток-продюсеров служат праймерами для обратной транскриптазы [25]. Кроме того, возможна обратная транскрипция ретровируса, направляемая эндогенными тРНК новой инфицированной клетки [103]. тРНК-подобные последовательности на З'-концах РНК вирусов растений, сохраняющие лишь отдельные элементы сходства со структурой тРНК, задействованы в репликации и трансляции вирусов. Являясь сайтами начала репликации для плюс и минус цепей, они избирательно препятствуют трансляции минус цепи вируса [43]. тРНК-подобные последовательности были найдены и в РНК вирусов животных, бактериофагов, в мРНК бактерий [86]. В бактериях существует отдельный класс малых РНК, подобных тРНК-Ala, и кодирующих пептид из 10 аминокислот, так называемые транспортно-матричные РНК - тмРНК (transfer- messenger RNAs - tmRNAs) [88]. тмРНК функционируют одновременно как тРНК и как мРНК, способствуя бесперебойной работе бактериальной рибосомы, если произошел обрыв транслируемой мРНК. В этом случае трансляция завершается присоединением химерного пептида, кодируемого тмРНК, и являющегося своеобразной меткой транслируемых дефектных белков, которые затем расщепляются.
Целая группа элементов, ответственных за нестабильность генома высших организмов, так называемые SINE повторы, доля которых в геноме человека составляет 13%, в геноме мыши - 8% [125,127], содержат тРНК-производную часть. Но эта доля может быть и выше, если иметь возможность идентифицировать самые древние копии SINEs.
В целом доля повторяющихся элементов в геноме, возникших в результате транспозиции оценивается как 40% и выше [125]. Появление тРНК-производной части SINE повторов связывают с использованием тРНК в качестве праймеров для обратной транскрипции ретровирусов [94,95]. Часть ретротранскрипта вируса вместе с тРНК-праймером затем встраивалась в последовательность LINE ретропозона, и имея возможность самостоятельно транскрибироваться РНК полимеразой III, захватывала З'-конецШЕ, приобретая, таким образом, сайт связывания фермента интегразы LINE повтора (обладающего одновременно активностью обратной транскриптазы и ДНК эндонуклеазы) [127]. Так SINE-повторы заимствовали у LINE-повторов механизм встраивания в последовательности генома.
Актуальность проблемы Предметом данного исследования являются мутации в кодирующих последовательностях ДНК, приводящие к сдвигам рамки считывания гена. Они представляют особый по сравнению с заменами в последовательностях ДНК интерес, т.к. в результате образуется полностью новый белок или домен белка. Возникает вопрос о механизме контроля клеткой таких мутаций и о причинах выживания образованных такими мутациями генов и кодируемых ими белков. Такие мутации сложно выявить с помощью классических методов поиска подобия между последовательностями ДНК, т.к. в этом случае последовательность ДНК подвержена высокой изменчивости, вызванной эволюционным давлением на новую рамку считывания.
В рамках данной работы акцент сделан на классификацию такого свойства кодирующих последовательностей ДНК как ихтриплетная периодичность. При создании классификации триплетной периодичности появляется возможность проследить эволюцию кодирующих последовательностей уже не на уровне подобия символьных последовательностей, а на уровне их производных характеристик, имеющих большую устойчивость к мутациям, чем сами последовательности. К тому же привязка триплетной периодичности к рамке считывания генов позволяет проводить поиск возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в генах, или инверсии последовательности гена. Ранее сдвиги рамок считывания выявлялись только прямым сравнением кодирующих последовательностей и транслированных по ним аминокислотных последовательностей между собой, что уменьшало чувствительность поиска и не давало возможности ввести точку отсчета для сдвигов рамки считывания. В данном исследовании такая точка отсчета вводится за счет наличия в формируемых классах доминирующей фазы триплетной периодичности. В дополнение к этому поиск возможных мутаций в кодирующих последовательностях генов осуществляется использованием найденных районов непрерывной триплетной периодичности в качестве профилей для поиска в этих же генах триплетной периодичности уже с учетом возможных вставок и делеций нуклеотидов. В данной работе это задача решается методом модифицированного профильного анализа.
Кроме генов, кодирующих белки, существенный научный интерес представляют гены транспортных РНК (тРНК). В данном направлении достигнуты высокие результаты при поиске действующих генов тРНК. В то же время, не были выявлены их сильно измененные копии, являющихся элементами некоторых структур в последовательностях ДНК. В частности, многие мобильные генетические элементы (например, SINE-повторы) содержат тРНК-подобные последовательности. Поиск и анализ мобильных элементов имеет высокую значимость, так как они составляют существенную часть генома эукариот (особенно высших) и тесно ассоциированы с их эволюционным развитием. Наряду с тем, что тРНК - это одна из древнейших структур генетического аппарата клетки, тРНК-подобные последовательности являются частью некоторых семейств мобильных элементов (повторов). Известно, что у эукариот (в особенности у высших) мобильные элементы составляют существенную часть генома и тесно ассоциируются с их высокой изменчивостью. В этой части работы были выявлены все последовательности в БД GenBank, родственные существующим генам тРНК. Для этого был применен метод модифицированного профильного анализа, выявляющий сильно измененные копии заданных в профиле исходных последовательностей. Данный метод обладает большей чувствительностью, чем такие широко используемые методы поиска подобий как BLAST. По результатам применения метода показано существование большого количества тРНК-подобных последовательностей, в т.ч. и в составе повторов, не ассоциированных с ними раннее. По результатам исследования создан банк данных тРНКподобных последовательностей.
Постановка задачи Целью представленной работы является классификация триплетной периодичности в последовательностях ДНК генов, кодирующих белки. По данным классификации в генах выявляются возможные мутации, приведшие к сдвигу рамки считывания или к инверсии кодирующих последовательностей. В части анализа генов тРНК задачей данного исследования является поиск последовательностей ДНК, имеющих отдаленное подобие к известным генам тРНК. В результате проведенного анализа области исследования был определен состав задач, решаемый настоящей работой:
1. Поиск методом информационного разложения последовательностей ДНК со скрытой триплетной периодичностью в кодирующих областях генов из БД KEGG.
2. Построение меры подобия между типами скрытой триплетной периодичности. Разработка алгоритма классификации триплетной периодичности по построенной мере подобия между ее типами. Классификация триплетной периодичности, найденной в кодирующих районах генов из БД KEGG.
3. Поиск мутаций в кодирующих районах генов, приведших к сдвигу рамки считывания или инверсии последовательности. Поиск подобий для аминокислотных последовательностей, полученных при трансляции кодирующих районов генов, имеющих мутацию, как по действующей рамке считывания гена, так и по найденной гипотетической (древней) рамке считывания, к последовательностям известных белков из БД UniProt с использованием программы BLAST.
4. Разработка банка данных, содержащего информацию о классах триплетной периодичности, найденной в кодирующих районах ДНК, и возможных мутациях, приведших к сдвигу рамки считывания в гене или его инверсии.
5. Разработка алгоритма оптимизации параметров поиска слабовыраженного подобия последовательностей ДНК к заданному семейству последовательностей методом модифицированного профильного анализа.
6. Поиск методом модифицированного профильного анализа возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетной периодичности.
7. Разработка банка данных, содержащего информацию о возможных мутациях в кодирующих последовательностях генов, приведших к сдвигу рамки считывания в областях, смежных с районом непрерывной триплетной периодичности.
8. Поиск методом модифицированного профильного анализа последовательностей из БД GenBank, подобных изотипическим семействам генов тРНК и их классификация.
9. Разработка банка данных, содержащего информацию о найденных тРНК-подобных последовательностях.
Научная новизна Представляемая работа обладает научной новизной, т.к. в ее рамках:
1. Впервые создана система классификации триплетной периодичности. В рамках данной системы введено понятие типа триплетной периодичности, меры подобия между типами и разработан алгоритм классификации триплетной периодичности.
Введенные классы позволяют на основе сходства типов триплетной периодичности выявлять потенциальные случаи мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания генов или инверсии кодирующей последовательности гена.
2. Впервые разработан метод поиска сдвигов рамки считывания в кодирующих областях генов и инверсий кодирующих последовательностей генов с использованием устойчивой к мутациям меры подобия. С помощью созданных классов триплетной периодичности найдено множество случаев возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания и инверсии кодирующих последовательностей. Для существенной части кодирующих последовательностей со сдвигами и инверсиями рамки считывания найдены подобия между аминокислотными последовательностями, кодированными по предполагаемой древней рамке считывания, к известным белкам из БД UniProt.
3. При поиске подобия к семействам последовательностей генов тРНК в последовательностях ДНК из БД GenBank было обнаружено множество тРНК-подобных последовательностей, не идентифицированных ранее другими методами. тРНКподобные последовательности были найдены в различных районах ДНК, например, в кодирующих последовательностях генов и повторах нескольких типов, в т.ч. в повторах, не ассоциированных ранее с тРНК-подобными последовательностями.
Предложены варианты происхождения найденных тРНК-подобных последовательностей и их возможные функции. Построена классификация тРНК-подобных последовательностей.
Практическое значение работы Практическое значение созданных алгоритмов, программного обеспечения и полученных результатов состоит в следующем:
1. Банк данных, содержащий информацию о сформированных классах триплетнои периодичности, найденной в белок-кодирующих районах ДНК, может быть полезен при исследовании эволюции кодирующих последовательностей. В настоящей работе этот банк данных применен при поиске возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания гена.
2. Алгоритм классификации и классы триплетнои периодичности могут использоваться для разработки новых методов поиска белок-кодирующих последовательностей, т.к. классы являются по своей сути профилями для поиска районов триплетнои периодичности, в т.ч. и с учетом вставок и делеций символов.
3. Банк данных, содержащий информацию о возможных мутациях, приведших к сдвигу рамки считывания гена, может быть полезен при исследовании эволюции кодирующих последовательностей ДНК, в т.ч. эволюции путем сдвига рамки считывания
4. Алгоритм оптимизации параметров поиска методом модифицированного профильного анализа слабовыраженного подобия последовательностей ДНК к заданному семейству последовательностей может применяться для автоматической настройки параметров метода модифицированного профильного анализа для увеличения его чувствительности метода при поиске подобий к любому задаваемому профилю. Также алгоритм может применяться для поиска периодических последовательностей по ее матрице частот с учетом вставок и делеций нуклеотидов.
5. Банк данных, содержащий информацию о возможных мутациях, приведших к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности может быть полезен при исследовании эволюции кодирующих последовательностей ДНК, в т.ч. эволюции путем сдвига рамки считывания на участке кодирующей последовательности, не покрывающем весь ген.
6. Банк данных с информацией о тРНК-подобных последовательностях может использоваться при исследованиях в области эволюции генов тРНК и мобильных элементов.
Все созданные банки данных имеют открытый доступ из сети Интернет.
Положения, выносимые на защиту
1. Система классификации скрытой триплетнои периодичности в последовательностях
2. Метод поиска возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в гене, по созданным классам триплетнои периодичности.
3. Метод поиска возможных мутаций, приведших к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности
4. Алгоритм оптимизации параметров поиска слабовыраженного подобия последовательностей ДНК к заданному семейству последовательностей методом модифицированного профильного анализа.
5. Банк данных, содержащий информацию о сформированных классах триплетнои периодичности.
6. Банк данных, содержащий информацию о возможных мутациях, приведших к сдвигу рамки считывания гена.
7. Банк данных, содержащий информацию о возможных мутациях, приведших к сдвигу рамки считывания в областях кодирующих последовательностей, смежных с районами непрерывной триплетнои периодичности.
8. Банк данных с информацией о найденных тРНК-подобных последовательностях.
Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка сокращений, списка литературы и семи приложений. Общий объем работы 116 стр., в том числе основной машинописный текст 92 страницы, 36 рисунков, 4 таблицы, список литературы из 128 наименований.
Опубликование и апробация результатов работы По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ:
1. Frenkel F.E., Korotkov E.V. Revealing and functional analysis of tRNA-like sequences in various genomes. // Proceedings of the 2nd international conference on bioinformatics of genome regulations and structure. - Новосибирск. - 2002. -
2. Френкель Ф.Е., Чалей М.Б., Короткое E.B. Поиск и функциональный анализ тРНК-подобных последовательностей. // Материалы 7-й Пущинской школыконференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» . - Пущино. - 2003. - 257.
3. Короткое Е.В., Короткова М.А., Френкель Ф.Е., Кудряшов Н.А. Информационная концепция поиска периодичности в символьных последовательностях. // Молекулярная биология. - 2003. -Том 37(3) - 436-451.
4. Френкель Ф.Е., Чалей М.Б., Короткое Е.В., Скрябин К.Г. Эволюция тРНКподобных последовательностей и изменчивость генома. // Материалы 2-ого Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2003. - 26-27.
5. Frenkel F.E., Chaley М.В., Korotkov E.V., Skryabin K.G. Informational aspects of the latent triplet periodicity analysis. // Proceedings of the 3rd international confe- rence on bioinformatics of genome regulations and structure. - Новосибирск. - 2004. - P. 58-59.
6. Frenkel F.E., Chaley M.B., Korotkov E.V., Skryabin K.G. Revealing and functional analysis of tRNA-like sequences in various genomes. // In "Bioinformatics Of Genome Regulation And Structure" .- Kluwer. - 2004. - P. 39-46.
7. Frenkel F.E., Chaley M.B., Korotkov E.V., Skryabin K.G. Evolution of tRNA-like sequences and genome variability // Gene. - 2004. - Vol. 335 - P. 57-71.
8. Frenkel F.E., Korotkov E.V. Fuzzy triplet periodicity as a footprint of coding regions evolution. // Proceedings of 2nd FEBS Advanced Lecture Course on Systems Biology: From Molecules to Life. - Austria. - 2007. - P. 176.
Результаты, представленные в данной диссертационной работе, докладывались на международной конференции BGRS'2002 (Новосибирск, 2002), на Международной школе-конференции «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, 2005) и на межлабораторном семинаре Центра «Биоинженерия» РАН (Москва, 2007).
