Регуляция протеолиза продуктов митохондриальной трансляции в дрожжах Новикова Людмила Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Принятые сокращения 5

ВВЕЩЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Продукты митохондриальной трансляции 9

1.1. Состав митохондриально синтезируемых полипептидов 10

1.2. Свойства митохондриально синтезируемых полипептидов 16

Глава 2. Протеолиз продуктов митохондриальной трансляции 20

Глава 3. Митохондриальные протеиназы 27

3.1. Индивидуальные митохондриальные протеиназы . 29

3.2. Участие митохондриальных протеиназ в регуляции обмена продуктов митохондриальной трансляции . 34

3.3. Отношение митохондриальных протеиназ к протео-литическому процессингу предшественников митохондриальных белков ..38

Постановка задачи 40

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ . .

Материалы и методы исследования ..... 42

Результаты эксперимента

Глава I. Влияние глюкозной репрессии на деградацию продуктов митохондриальной трансляции в дрожжах . . 59

1.1. Клеточное дыхание дрожжей . 59

1.2. Изменение содержания белка в условиях глюкозной репрессии ...... 61

1.3. Содержание цитохромов в интактных клетках . 61

1.4. Изменение активностей протеиназ А и В при глюкозной репрессии дрожжей 61

1.5. Включение Н-лейцина в продукты митохондриальной трансляции в условиях глюкозной репрессии ... 68

1.6. Содержание Н-лейцина в продуктах митохондриальной трансляции СЩ, выделенных в присутствии ингибиторов протеиназ ... 68

1.7. Влияние глюкозной репрессии на протеолиз продуктов митохондриальной трансляции 70

1.8. Влияние глюкозной репрессии на протеолиз продуктов митохондриальной трансляции в изолированных митохондриях 74

Глава 2. Митохондриальные протеиназы дрожжей: электрофоретическое выявление, субстратная специфичность и чувствительность к ингибиторам 76

2.1. Определение в бана.-, бала- и цитохром.с-гидролазных активностей белков СЩ 76

2.2. Протеолитическая активность СЩ с Н-цитохромом

с в качестве субстрата 81

2.3. Протеолитическая активность СЩ с азоколлом, гемоглобином, казеином и цитохромом ев качестве субстратов 82

2.4. Протеолитическая активность СЩ с использованием синтетических субстратов сериновых протеиназ . 82

2.5. Изменение гидролазных активностей СЩ после процедуры замораживания-оттаивания 87

2.6. Чувствительность гидролазных активностей СЩ к ингибиторам протеиназ 87

Глава 3. Регуляция скорости протеолиза продуктов митохондриальной трансляции в дрожжах . 91

3.1. Изменение протеолитической активности внутренней митохондриальной мембраны в условиях глюкозной репрессии . . 91

3.2. Влияние глюкозной репрессии на состав продуктов митохондриальной трансляции 92

3.3. Изменение физического состояния внутренней митохондриальной мембраны при глюкозной репрессии 98

Глава 4. Универсальность корреляции между скоростью деградации продуктов митохондриальной трансляции и параметрами, характеризующими физическое состояние внутренней митохондриальной мембраны . . . 114

ОБСУВДЕНЙЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Глава I. Факторы, определяющие эффективность элиминации

продуктов митохондриальной трансляции в дрож

жах ......... 124

Глава 2. Некоторые аспекты контроля за сборкой митохонд

рий 127

Заключение 131

ВЫВОДЫ 133

ЛИТЕРАТУРА 135

• Состав митохондриально синтезируемых полипептидов
• Протеолиз продуктов митохондриальной трансляции
• Индивидуальные митохондриальные протеиназы
• Клеточное дыхание дрожжей
• Определение в бана.-, бала- и цитохром.с-гидролазных активностей белков СЩ

Введение к работе

Биогенез митохондрий привлекает в настоящее время внимание большого числа исследователей. Изучение механизмов формирования митохондрий необходимо не только для понимания принципов организации и функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрии, но и для выяснения общих закономерностей форшрования субклеточных структур и построения клетки в целом.

Значительные успехи уже достигнуты в установлении состава и структуры митохондрий, а также в изучении топографии синтеза отдельных их компонентов. Известно, что митохондриальные белки синтезируются как на цитоплазматических / 12, 28 /, так и на мито-хондриальных /7, 14, 153 / рибосомах, причем работа этих белок-синтезирующих систем, по-видимому, скоординирована /28, 93, 153, 160 /w Если говорить о принципах сборки митохондриальиых мембран, то в этом направлении особенно перспективными представляются работы, посвященные выяснению механизмов формирования их энзима-тических комплексов. Предполагалось / 171, 172, 173 /, что ключевую роль в этом процессе играют продукты митохондриальной трансляции, которые образуют во внутренней мембране органеллы строго организованную "решетку" и избирательно связывают цитоплазматичес-ки синтезируемые полипептиды. Однако работы последних лет показали, что такая точка зрения может считаться слишком упрощенной. Согласно современным представлениям, сборка митохондриальных мембран представляет собой многостадийный процесс, в ходе которого предшественники митохондриальных белков, синтезируемые как на цитоплазматических рибосомах, так и на митохондриальных рибосомах, независимым образом связываются мембраной, переносятся через неё, подвергаются протеолитическому процессингу, претерпевают различные виды модификации и затем диффундируют в мембране, пока не находят своих партнеров по комплексам / 12, 76/. Вследствие этого во внутренней митохондриальной мембране всегда имеется пул свободных предшественников энзиматических комплексов в виде зрелых полипептидов, их предшественников и промежуточных ассоциатов /12, 76 /.

Возникает вопрос, как контролируется содержание всех этих белковых компонентов в мембране, не подвергаются ли они протеолизу, какие протеиназы их расщепляют и т.д. Имеются данные о том, что протеияазы играют значительную роль в регуляции белкового обмена митохондрий / 67, 141 /, в активации и инактивации ряда ферментов / 179 /, в деградации аномальных белков / 65, ИЗ /ив посттраяс-ляционной модификации предшественников митохондриальных белков /40, 41, 132, 161 /.

Несколько лет назад в отделе биогенеза внутриклеточных структур Межфакультетской научно-исследовательской лаборатории им. А.Н.Белозерского МГУ было обнаружено /2, II /, что в дрожжах продукты митохондриальной трансляции деградируют в определенных физиологических условиях с высокой скоростью: время их полужизни составляет от 15 до 60 минут в зависимости от фазы роста дрожжей. Показано также, что эти полипептиды расщепляются под действием эндогенной митохондриальной протеиназы (или протеиназ) /10, 90 /.

Настоящая работа является продолжением этих исследований. Она посвящена, главным образом, изучению механизмов регуляции деградации продуктов митохондриальной трансляции при росте дрожжей $ c&c&VLSlae. в различных физиологических условиях. В работе показано, что скорость протеолиза этих полипептидов может контролироваться посредством изменения физического состояния внутренней митохондриальной мембраны, которое зависит, в частности, от относительного содержания ненасыщенных жирнокислотных остатков в молекулах фосфолипидов.

Полученные результаты проливают свет на некоторые аспекты митохондриального биогенеза: контроль за сборкой митохондрий, регуляцию содержания митохондриального материала в клетке, адаптацию дыхательного аппарата клеток к изменяющимся физиологическим условиям. Эти результаты показывают необходимость изучения роли протеолитических ферментов в дифференцировке и трансформациях клеточных органелл. Они могут иметь практическое значение, в частности, при выяснении механизмов развития различных патологических состояний клетки и механизмов адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям роста.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. ПРОДУКТЫ МйТОХОНДРИАЛЪНОЙ ТРАНСЛЯЦИИ В настоящее время известно, что в синтезе митохондриальных белков принимают участие две пространственно разделенные белок-синтезирующие системы. Одни белки митохондрий кодируются ядерной ДНК и продуцируются цитоплазматической системой трансляции, другие кодируются митохондриальной ДНК и являются продуктами митохондри-альной трансляции ( ПМТ ) / 14, 28 /. Митохондриальная и ядерная ДНК не имеют комплементарных участков, и информационные РНК не транспортируются из одной системы в другую / 153 /.

Одним из наиболее широко используемых подходов для изучения топографии синтеза митохондриальных белков является применение селективных ингибиторов трансляции. Известно, что белковый синтез на цитоплазматических рибосомах эукариот ингибируется циклогекси-мидом ( ЦТИ ), а также анизомицином, эметином или педерином, в то время как синтез на митохондриальных рибосомах чувствителен к хлорамфениколу (ХАФ), эритромицину, линкомицину, спирамицину,кар-бомицину и олеандомицину/ 12 /.

Критерии, определяющие, какой белоксинтезирующей системой продуцируется тот или иной компонент, подробно рассмотрены Шатцем и Мэйсоном / 153 /. К таким критериям относятся: наличие или отсутствие данного компонента в митохондриях клеток, выращенных в присутствии ингибиторов мйтохондриального белкового синтеза / 98, 102, 122 /, влияние ингибиторов мйтохондриального и цитоплазматического белкового синтеза на включение радиоактивных аминокислот в белки внутренней мембраны митохондрий в клетке / 98 /, синтез определенных белков в изолированных митохондриях / 51, 107, 159 /, наличие или отсутствие того или иного белка в митохондриях цитоплазматических pti'de. мутантов дрожжей, частично или полностью лишенных митохондриальной ДНК и не имеющих функционирующей системы синтеза белка / 133, 154, 173 /, некоторые генетические критерии / 12 /.

Исследования влияния ингибиторов цитоплазматического и митохондриального белкового синтеза на включение меченых аминокислот в белки митохондрий показали, что подавляющее большинство митохондриальных белков синтезируется в цитоплазме. ПМТ составляют только 5-15$ от общего митохондриального белка / 12 /, причем все они, за исключением одного полипептида малой субъединицы митохондриальных рибосом (см. ниже), включаются во внутреннюю мембрану органеллы и, по данным ряда авторов / 31, 134, 153 /, могут составлять от 20 до 40% суммарного белка мембраны.

I.I. Состав митохондриально синтезируемых полипептидов

Митохондриальная белоксинтезирующая система была открыта в 1958 году / 153 /, однако, лишь в последнее десятилетие работы по идентификации ПЖ получили широкое распространение. Основной методический прием при изучении ПЖ - это включение меченых аминокислот в изолированные митохондрии или в клетки в присутствии ингибиторов цитоплазматического белкового синтеза с последующей солюбилизацией митохондрий (или СМ) и электрофорезом в ПААГ полученных лизатов. Для митохондрий дрожжей / 124, 173, 187 /, клеток животных /82, 96, 192 / и А/есшярош слома / іб7 / первоначально было обнаружено от 5 до 10 полипептидов, синтез которых нечувствителен к ЦТИ, но подавляется ХАФ. Молекулярные веса малых полипептидов составляли 7800-14000 дальтон, а самых крупных - до 45000-50000 дальтон. По мере совершенствования методических приемов количество обнаруживаемых ПМТ росло и достигло в настоящее время 26 для митохондрий клеток HeL а / 47 /.

Большой интерес представляет вопрос о том, какие функции несут во внутренней митохондриальной мембране полипептиды, синте- - II - зируемые на митохондриальных рибосомах и, в частности, в состав каких энзиматических комплексов они входят.

В результате многочисленных исследований установлено, что ХАФ, эритромицин и бромистый этидий подавляют развитие цитохром с-оксидазной активности и препятствуют появлению цитохрома аа₃ в клетках различных организмов С грибов, простейших, млекопитающих) / 14, 153, 180 /. По данным Эбнера с соавт. / 60 /, цитохром с-оксидаза, выделенная из дрожжей $acc&cwnuj<&> cewttsCae _t включает в свой состав семь полипептидов. Три больших полипептида ( I, П и Ш с молекулярными весами 42000, 34500 и 23000, соответственно) синтезируются на митохондриальных рибосомах: включение в них меченых аминокислот подавляется ХАФ и эритромицином и не чувствительно к ЦГИ. Аналогичные результаты были получены для /fawzospcza cvassa / 159 /, для клеток HeL а /78 / и для культуры ооцитов Xenapus icmis J 96 /. Раскати и Парсонс / 143 / продемонстрировали включение ³Н-лейцина в три большие субъединицы цитохром G-оксидазы в изолированных митохондриях печени крысы. Субъединицы I, П и Ш, синтезируемые в митохондриях, составляют 27,9, 18 и 14,2%, соответственно, от общего содержания белка цитохром с-окси-дазы / 159 /, а в сумме три больших полипептида комплекса составляют 20-25% всех митохондриально синтезируемых полипептидов / 60 /.

Указанные компоненты играют важную роль при формировании каталитически активного цитохром с-оксидазного комплекса /36, 60, 157, 160 /. Например, по данным Бертранда и Вернера / 36 /, в митохондриях цитоплазматического мутанта f/etwospoza* otassa , не синтезирующего субъединицу II цитохром с-оксидазы, субъединицы Y и ЇТ, хоть и синтезируются на цитоплазматических рибосомах, но теряют способность нормально соединяться друг с другом.

На митохондриальных рибосомах синтезируются полипептиды "мембранного сектора" АТФазного комплекса. Включение метки в эти белки не подавляется ЦГИ / 177 /.

Необходимо отметить, что количество полипептидов "мембранного сектора", синтезируемых внутримитохондриально, варьирует у разных авторов. Так, в культуре ооцитов fenopu$ faws к ХАФ чувствителен синтез трех компонентов АТФазного комплекса с молекулярными весами 29000, 21000 и 17000 / 96 /, а в случае //ecwspota, cwssd в качестве ПМТ указывали лишь два полипептида с молекулярными весами 19000 и 11000 / 84 /. Такие расхождения могут объясняться, в частности, различиями состава "мембранного сектора" ЕГ^-АТФазы из разных источников, либо недостаточной определенностью самого понятия "мембранный сектор".

По данным разных авторов, в дрожжах внутримитохондриально синтезируются четыре ( 29000, 22000 - субъединица 6, 12000 и 7500 -субъединица 9, выполняющая, вероятно, функции протонного канала) / 178 /, три (21000, 10000 и 8000) /61/, или даже два ( 20000 и 7800) / 164 / полипептида. В клетках печени / 100 / на митохон-дриальных рибосомах транслируются два полипептида с молекулярными весами 21500 и 9000 ( Ф_н-связывающий полипептид, характеризующийся высоким сродством к фосфату и, предположительно, играющий роль его переносчика в ІГ^-АТФазе). Наконец, в грибе (botwodipfodia tfrec&wffiQx только один полипептид ( 20000 дальтон) из 12 полипептидов Н⁺-АТФазы синтезируется в митохондриях / 189 /. Внутримитохондриально синтезируемые компоненты "мембранного сектора" необходимы для функционирования АТФазного комплекса / 152, 171, 172, 177 /.

В настоящее время принято считать, что из всех компонентов убихинол:цитохром с-редуктазного участка дыхательной цепи только цитохром b синтезируется на митохондриальных рибосомах в клетках животных, водорослей и дрожжей / 93, 153, 188 /. Лин и Битти / III с помощью антисыворотки к очищенному препарату дрожжевого цитохро- - ІЗ - ма b выделили один главный полипептид с молекулярным весом 31000. ХАФ подавляет включение радиоактивных аминокислот в этот белок, в то время как ЦГИ таким действием не обладает. Катая с соавт. / 93 / показали, что ХАФ или акрифлавин подавляют включение меченых аминокислот в дрожжах только в один из семи полипептидов bcj-комплекса (фрагмента убихинол:цитохром с-редуктазы), индентичный по молекулярному весу апопротеину цитохрома Ь. Кроме того, цитохром не был обнаружен в цитоплазматическом pdde мутанте дрожжей / III /.

Важную роль единственного компонента Ьст-комплекса, синтезирующегося на митохондриальных рибосомах, можно продемонстрировать, в частности, на следующем примере. Как показали Катан с соавт. / 93 /, шесть полилептидов bcj-комплекса, синтезируемые в цитоплазме, не образуют обычного ансамбля при нарушении синтеза цитохрома &.

Одним из продуктов митохондриальной трансляции является белок S-4a с молекулярным весом 52000 - компонент малой субъединицы митохондриальных рибосомов в Мешюврога- cvassa / 103 /. Этот белок характеризуется исключительно малым свободным фондом и, возможно, контролирует скорость сборки рибосом. ХАФ подавляет его синтез и препятствует "созреванию" 30S субъединицы рибосомы / 105 /.

По данным других авторов, частичное подавление синтеза белков митохондриальных рибосом ХАФом имеет место в дрожжах / 155 / и 3elxahf

Недавние более детальные исследования Бьютова и соавт. / 168, 169 /, показали, что 38S рибосомальная субъединица дрожжевых митохондрии содержит полипептид ( va/tl), синтез которого не подавляется ЦТЙ, но ингибируется ХАФ и, еще лучше, эритромицином. Полипептид присутствует в рибосомах в эквимолекулярном отношении к другим белкам 38S субъединицы и может рассматриваться как ее интегральный компонент.

Итак, суммируя сведения об идентифицированных ЇЇМТ, можно заключить, что в клетках низших эукариот внутримитохондриально продуцируются три субъединицы цитохром с-оксидазы, две (или три) ' субъединицы Н⁺-АТФазы, апоцитохром b и один из белков малой рибосомальной субъединицы. В случае высших эукариот доказана трансляция на миторибосомах трех субъединиц цитохром с-оксидазы, двух субъединиц Б⁺-АТазы и апоцитохрома Ь. Однако, общий набор ЇЇМТ не исчерпывается этими полипептидами.

Гаузе / 7 /, суммируя сведения о размерах митохондриальной ДНК из разных источников, пришел к выводу, что максимальный предел ее кодирующей емкости составляет около 4000 аминокислотных остатков, что соответствует примерно 40 полипептидам по 100 аминокислот в каждом. Синклер и Стивене / 163 / указывали, что молекула митохондриальной ДНК, имеющая длину около 5 мкм, способна кодировать синтез 30 полипептидов со средним молекулярным весом 20000 дальтон. Таким образом, общий молекулярный вес всех внутримитохондриально синтезируемых полипептидов не должен превышать 600000.

Определенные недавно полные последовательности митохондриальной ДНК человека / 24, 25 / и мыши / 38 / указывают на существование 13 читаемых рамок, которые транскрибируются в предположительно функциональные матричные РНК / 136 / и кодируют полипептиды с молекулярными весами в области 7800-66000 дальтон. Из них

6 полипептидов хорошо известны (см.выше), а семь остаются не-идентифицированяыми.

В последнее время появились данные, согласно которым число митохондриально синтезируемых полипептидов, определяемое экспериментально, может значительно превышать число читаемых рамок. Бхат и соавт. / 37 /, используя высокоэффективную двумерную систему разделения белковых смесей, выявили от 19 до 24 полипептидов, синтезируемых в клетках асцита Эрлиха, а также в клетках печени крысы и шши в присутствии ЦТИ или в изолированных из этих клеток митопластах. В HeLa клетках / 47 / было определено 26 полипептидов, являющихся продуктами митохондриальной трансляции по общепринятым критериям. Предлагалось множество объяснений превышению числа реально обнаруживаемых полипептидов над числом читаемых рамок в митохондриальном геноме, начиная с возможной гетерогенности молекул ДНК / 37 / и кончая такими явлениями, как перекрывание кодирующих последовательностей для некоторых полипептидов, преждевременная терминация трансляции и др. / 47 /. Велика вероятность вторичной модификации начальных продуктов трансляции, например, ковалентного связывания полипептидов с образованием высокомолекулярных продуктов (см. ниже).

Эксперименты по включению меченых аминокислот в животные клетки в присутствии ингибиторов цитоплазматическоы трансляции и в изолированные из них митохондрии показали, что внутримитохондри-ально в животных клетках синтезируется 8-14 полипептидов /49, 51, 68 /.

В случае дрожжей в экспериментах по избирательному включению метки в ЇЇМТ обнаруживается до 21 меченых полипептидов / 57 /. Насколько это число соответствует структуре митохондриального генома дрожжей сказать нельзя, поскольку она еще полностью не расшифрована. В настоящее время известны гены для апог(тохрома b / 175/ для трех больших субъединиц цитохром с-оксндазы / 174 / для субъединицы 6 / 119 / и субъединицы 9 / 118 / ВГ^-АТФазы и для белка уагі / 45 /

1.2. Свойства митохощщиально синтезируемых полипептидов

Основная масса продуктов митохондриального белкового синтеза характеризуется чрезвычайно высокой гидрофобностью, что позволило ряду исследователей считать указанную белковую фракцию протеоли-пидами. Установлено, что ЇЇМТ прочно связывают жирные кислоты, которые могут быть отделены только после продолжительной обработки 0,5Н JfaOH в метаноле / 56 /, а также фосфатиды / 88 /.

Анализ аминокислотного состава многих внутримитохондриально синтезируешх полшептидов (субъединйц 1,11 и III цитохром с-окси-дазы, субъединицы 9 Е^-АТФазы и др.) показывает высокое содержание гидрофобных аминокислот. По данным Диану с соавт. / 56 /, суммарное содержание гидрофобных аминокислот (аланина, лейцина, изолейцина и фенилаланина) во фракции протеолипидов митохондрий печени крысы составляет 44$.

Значительная часть ПМГ может быть экстрагирована из митохондрий смесью хлороформ:метанол. До 80-90$ ПМГ экстрагируется указанной смесью из митохондрий печени крысы / 56 /, №илоьрош скша /147 / и дрожжей / 173 /. Вместе с тем известны случаи, когда экстракция была не столь полной / 89, 99 /, причем метка, предварительно включенная в ПМГ, частично оставалась в высокомолекулярных полипептидах мембранной фракции.

Фракция протеолипидов в случае митохондрий печени крысы представляет собой смесь полипептидов с молекулярными весами от 8000 до 30000, причем после дезагрегации в кислой среде полипептиды дают один продукт с молекулярным весом около 7 000 даль-тон / 56 /. Аналогичные данные представлены для растворимых в ней- тральной смеси хлороформа и метанола ПМТ клеток /l/wtosjxrtfr сгшда / 147 /.

В работе Цаголова и Акай / 173 / показано, что из пяти главных ПМТ дрожжей только один ( с молекулярным весом 7800) растворим в нейтральной смеси хлороформ : метанол, в то же время кислая смесь этих растворителей экстрагирует из митохондриальных мембран практически все полипептиды, синтезируемые дрожжами иг vivo в присутствии ЦГИ. Вслед за Цаголовым и Акай, Кужела и соавт. / 99 / обнаружили, что при обработке мембранной фракции меченых т шго митохондрий печени крысы нейтральной смесью хлороформа и метанола вымывается только один низкомолекулярный полипептид (молекулярный вес 10000), а при подкислении смеси растворителей экстрагируется набор полипептидов с молекулярными весами 10000-40000. В том и другом случае в мембране обнаруживаются ПМТ не растворяющиеся в смесях хлороформа и метанола, это, в основном, полипептиды с молекулярными весами 22000-58000,

Таким образом, одной из характерных особенностей ПМТ является их способность к агрегации / 178 /.

Высокая гидрофобность полилептидов, связанных с митохонд-риальными рибосомами, является также причиной агрегации последних in, Y'dto / ізо /. Рибосомы дезагрегируют только при добавлении пуромицина, когда с них сходят полипептидные цепи. Сами полилеп-тиды, как свободные, так и в форме пептидил-тРНК и пептидилпуро-мицина, поддерживаются в растворимом состоянии только в присутствии детергентов, таких как ДЦС-Ла.

Включаясь во внутреннюю митохондриальную мембрану, мито-хондриально транслируемые полипептиды подвергаются модификации, проявляющейся, в частности, в уменьшении их электрофоретической подвижности в ПААГ. Михел и Нойперт / 130 / наблюдали переход метки, предварительно включенной в IIMT с молекулярными весами 11000 и 18000, во фракцию высокомолекулярных полипептидов (20000-40000) в процессе последующей инкубации клеток Newtosjxna &№№> в нерадиоактивной среде. Аналогичные данные получили Кужела с соавт. / 99 /, осуществляя совместную инкубацию меченых h, vdto низкомолекулярных митохондриальных полипептидов, экстрагированных смесью хлороформ : метанол, с немечеными митохондриями печени крысы в присутствии ингибитора митохондриальной трансляции. В этом случае содержание метки уменьшалось во фракций низкомолекулярных белков и увеличивалось в высокомолекулярных белках как мембранной фракции митохондрий, так и постмитохондриального супер-натанта. Миграция метки рассматривалась как результат взаимодействия низкомолекулярных гидрофобных ПМТ с другими митохондриальными белками. Интересно, что для осуществления конверсии первичных ПМТ ик vitxo необходим АТФ / 99 /. Поскольку физиологическое значение таких превращений пока что не установлено, нельзя исключить, что оно является экспериментальным артефактом. Следует отметить чрезвычайно высокую прочность образующихся агрегатов, которые не диссоциируют даже в средах, содержащих ДДС-#а и 2-меркаптоэнанол / 79, 99, 178 /.

Имеются данные о содержании протеолипидов в определенных олигофермеитных комплексах внутренней митохондриальной мембраны. Согласно Роу с соавт. / 147 /, большая часть ( до 80 %) ПМТ входящих в состав цитохром с-оксидазы l/ewwsfoza слща , растворима в кислой смеси хлороформа и метанола. Из трех субъединиц цитохром с-оксидазы, синтезируемых на митохондриальных рибосомах, две экстрагируются этой смесью из изолированного фермента, в то время как одна ( 30 000 дальтон) проявляет большую гидрофиль-ность. По данным Сиерры и Цаголова / 162 / до 75% радиоактивных продуктов экстрагируется смесью хлороформ : метанол из АТФазного комплекса дрожжей, меченного Ui, vivo в присутствии ЦТИ. Эта радиоактивность может быть приписана полипептиду с молекулярным весом 7500 дальтон, являющемуся девятой субъединицей АТФазного комплекса.

Итак, в настоящей главе даны общие сведения о составе и свойствах ПМТ. Приведены также данные о соотношении цитоплазмати-ческой и митохондриальной трансляции. Из этих данных следует, что, несмотря на небольшой по массе ( 5-15$ от общего митохондриального белка) и по номенклатуре (около 20 из 150 полипептидов) вклад в обеспечение митохондрий белками, митохондриальная трансляция играет принципиально важную роль в формировании дыхательно-компетентных митохондрий, поскольку продуцируемые в митохондриях полшеп-тиды являются неотъемлемой составной частью энзиматических комп- * лексов дыхательной цепи и Е^-АТФазы. Следует подчеркнуть, что ПМТ являются типичными мембранными белками, причем многие из них имеют трансмембранное расположение. Сказанное, в частности, относится к субъедияицам I и Ш цитохром с-оксидазы / 39 / и цитохро-му b / 33, 35 /. Это обстоятельство очень важно для понимания механизма регуляции протеолиза ПМТ.

Состав митохондриально синтезируемых полипептидов

Митохондриальная белоксинтезирующая система была открыта в 1958 году / 153 /, однако, лишь в последнее десятилетие работы по идентификации ПЖ получили широкое распространение. Основной методический прием при изучении ПЖ - это включение меченых аминокислот в изолированные митохондрии или в клетки в присутствии ингибиторов цитоплазматического белкового синтеза с последующей солюбилизацией митохондрий (или СМ) и электрофорезом в ПААГ полученных лизатов. Для митохондрий дрожжей / 124, 173, 187 /, клеток животных /82, 96, 192 / и А/есшярош слома / іб7 / первоначально было обнаружено от 5 до 10 полипептидов, синтез которых нечувствителен к ЦТИ, но подавляется ХАФ. Молекулярные веса малых полипептидов составляли 7800-14000 дальтон, а самых крупных - до 45000-50000 дальтон. По мере совершенствования методических приемов количество обнаруживаемых ПМТ росло и достигло в настоящее время 26 для митохондрий клеток HeL а / 47 /.

Большой интерес представляет вопрос о том, какие функции несут во внутренней митохондриальной мембране полипептиды, синтезируемые на митохондриальных рибосомах и, в частности, в состав каких энзиматических комплексов они входят.

В результате многочисленных исследований установлено, что ХАФ, эритромицин и бромистый этидий подавляют развитие цитохром с-оксидазной активности и препятствуют появлению цитохрома аа3 в клетках различных организмов С грибов, простейших, млекопитающих) / 14, 153, 180 /. По данным Эбнера с соавт. / 60 /, цитохром с-оксидаза, выделенная из дрожжей $acc&cwnuj & cewttsCae t включает в свой состав семь полипептидов. Три больших полипептида ( I, П и Ш с молекулярными весами 42000, 34500 и 23000, соответственно) синтезируются на митохондриальных рибосомах: включение в них меченых аминокислот подавляется ХАФ и эритромицином и не чувствительно к ЦГИ. Аналогичные результаты были получены для /fawzospcza cvassa / 159 /, для клеток HeL а /78 / и для культуры ооцитов Xenapus icmis J 96 /. Раскати и Парсонс / 143 / продемонстрировали включение 3Н-лейцина в три большие субъединицы цитохром G-оксидазы в изолированных митохондриях печени крысы. Субъединицы I, П и Ш, синтезируемые в митохондриях, составляют 27,9, 18 и 14,2%, соответственно, от общего содержания белка цитохром с-окси-дазы / 159 /, а в сумме три больших полипептида комплекса составляют 20-25% всех митохондриально синтезируемых полипептидов / 60 /.

Указанные компоненты играют важную роль при формировании каталитически активного цитохром с-оксидазного комплекса /36, 60, 157, 160 /. Например, по данным Бертранда и Вернера / 36 /, в митохондриях цитоплазматического мутанта f/etwospoza otassa , не синтезирующего субъединицу II цитохром с-оксидазы, субъединицы Y и ЇТ, хоть и синтезируются на цитоплазматических рибосомах, но теряют способность нормально соединяться друг с другом.

На митохондриальных рибосомах синтезируются полипептиды "мембранного сектора" АТФазного комплекса. Включение метки в эти белки не подавляется ЦГИ / 177 /.

Протеолиз продуктов митохондриальной трансляции

Как следует из материалов, изложенных в предыдущей главе, митохондриально синтезируемые полипептиды являются необходимыми компонентами нормально фунщионирующих митохондриіі, Исследования, посвященные их синтезу и деградации, а также ферментам, регулирующим их содержание в митохондриях, необходимы для выяснения механизма, обеспечивающего формирование такого "уникального структурно-функционального единства многочисленных компонентов" / 15 /, каким является внутренняя мембрана митохондрий.

Уилдон и соавт. /190 / первыми обнаружили быструю деградацию ПМТ, меченых иь vilw 14С-лейцином в присутствии ЦТИ, при инкубации изолированных митохондриіі печени крысы. 14С-лейцин удаляется из органеллазиде продуктов, не осаждаемых 10%-ной ТХУ и через 20-30 минут в кислотонерастворимой фракции остается 20-40% метки; время полужизни ПМТ составляет около 20 минут при наличии АТФ в среде инкубации.

Этот процесс частично подавлялся тозиламидфенилэтилхлор-метилкетоном, одним из специфических ингибиторов сериновых про-теиназ. Уилдон и соавт. / 190 / показали также, что деградации подвергаются преимущественно новообразущиеся полипептиды после их высвобождения с рибосом. Пуромицин, способствующий отделению от рибосом новообразующихся полипептидов, ускорял их протеолиз, ХАФ, который препятствует реакции транспептидации, замедлял накопление продуктов деградации. Таким же действием обладали эти-диум бромид и акрифлавин. Последние нарушали процесс транскрипции в митохондриях и вследствие этого замедляли продуцирование полипептидов на митохоядриальных рибосомах. Напротив, расщепление ПМТ стимулировалось АТФ, что, как полагают Уилдон и соавт. / 190 / было связано с ускорением трансляции на митохондриальных рибосомах.

Итак, митохондрии печени крысы синтезируют ш, vliio полипептиды, значительная часть которых в определенных условиях быстро деградирует, давая растворимые в Ю -ной ТХУ продукты. Уилдон и соавт. / 190 / высказали предположение, что эта деградация обусловлена действием митохондриальной протеиназы, которая атакует полипептиды, сходящие с митохондриальных рибосом, и выполняет регуляторные функции в формировании митохондриальных мембран. Согласно предположению этих авторов, протеолизу подвергаются в первую очередь полипептиды, неправильно встроенные в мембрану или несущие ошибки трансляции, однако доказательства справедливости этих предположений авторами не представлены.

Константине и Аттарди / 50 / попытались оценить стабильность ряда индивидуальных митохондриально синтезируемых полипептидов в клетках HeL а. Упомянутые авторы наблюдали за выходом меченого изолейцина, включенного в присутствии ЦТИ в митохондриальные полипептиды, и обнаружили, что большая часть радиоактивности, связанной с двумя из восьми компонентов, не обнаруживается уже через 4 часа.

Предположение об избирательном и быстром расщеплении ПМТ, синтезированных в присутствии ЦТИ, высказывалось также фон Рюкером с соавт. / 182 /. В его основе лежали некоторые косвенные данные, полученные в экспериментах с tfewwzpota сяалъес # Фон Рюкер с соавт. / 182 / рассматривали такие полипептиды как избыточные, не интегрируемые в функциональные комплексы мембраны. К их числу относили, в частности, субъединицы I, П и Ш цитохром с-оксидазы. Деградация ПМТ приписывалась гипотетической митохондриальной про-теиназв.

Индивидуальные митохондриальные протеиназы

В последние годы в результате работы многих исследователей выделены и охарактеризованы эндогенные митохондриальные протеиназы из митохондрий клеток животных.

Аоки с соавт. / 26 / изолировали митохондриальную протеина-зу из ретикулоцитов костного мозга человека. Эта протеиназа избирательно расщепляла апоферменти пиридоксаль-зависимых ферментов (в частности, орнитинаминотрансферазы). Фермент был очищен до состояния индивидуального белка с молекулярным весом около 18000 и оптимумом активности при рН 8,5. Активность протеиназы полностью подавляется диизопропилфторфосфатом, что, по мнению авторов, указывает на наличие серина в активном центре фермента. Эффективным ингибитором фермента оказался также эластатинал. В то же время протеиназа не проявляла эластолитической активности и не была чувствительной к ЭДТА, п-хлормеркурибензоату и ряду пептидных ингибиторов (химостатину, лейпептину, пепстатину и антипаину). Характерной особенностью протеиназы являлось то, что инактивация апо-ферментов была следствием ограниченного протеолиза ферментного бел -30 ка, по-видимому, вследствие специфического отщепления аминокислотных остатков от С- или «/-конца. Отсутствие ингибиругащего эффекта п-хломеркурибензоата указывает на возможное отличие этого фермента от протеиназ, описанных Альберти и Бартли /21, 22 /.

Катунума и соавт. / 94 / выделили протеиназу с аналогичными свойствами из митохондрий печени крысы. В отличие от протеиназы Аоки и соавт., фермент проявлял высокую чувствительность к химо-статину, в то время как эластатинал не обладал ингибирующим действием.

Сведения относительно природного ингибитора митохоядриаль-ной протеиназы, способной расщеплять апопротеины пиридоксалевых ферментов, приводились Банно и соавт. / 32 /, которые полагали, что ингибитор протеиназы содержится в матриксе, в то время как местом локализации протеиназы является внутренняя митохондриаль-ная мембрана.

Хэйр / 77 / обнаружил в клетках печени крысы протеиназу, связанную с внутренней митохондриальной мембраной, которая с высокой скоростью расщепляла инсулин при рН 8,0-8,5. Протеолитическая активность подавлялась реагентами на SH-группы : п-аминобензами-дином, L- 1-тозиламидо-2-фенилэтилхлорметилкетоном, но была нечувствительна к ФМСФ и ингибитору трипсина из сои. При высоких концентрациях солей (КСІ или фосфата калия) лишь небольшое количество протеиназы экстрагировалось из мембраны. Ее удалось солю-билизировать только с помощью детергентов (тритона Х-100, твина 80, луброла /УХ), что говорит о гидрофобной природе связи протеиназы с внутренней митохондриальной мембраной. Авторы высказали предположение, что гидрофобная протеиназа может катализировать протеолиз ЇЇМТ, не включившихся во внутреннюю митохондриальную мембрану.

Протеиназа, идентифицированная как гистон-расщепляющий фермент, была выделена из митохондрий печени крысы и охарактеризована по ряду энзиматических и физико-химических параметров. Эта протеиназа связана с внутренней митохоядриальной мембраной / 75 / и обладает способностью эффективно расщеплять гистоны, глюкагон и некоторые другие белки / 86 /. Фермент был выделен как индивидуальный белок с молекулярным весом 22500-23500, оптимум активности которого находится между рН 7, 5 и 8,0 / 86 /. Ингибитор трипсина из сои, ФМСФ, диизопропилфторфосфат, Ъ-1-тозилаг/1Идо-2-фенил.Э тилхлорметил-кетон в значительной степени подавляют активность фермента.

Клеточное дыхание дрожжей

Эксперименты по определению скорости деградации ПМТ в условиях глгокозяой репрессии проводили, используя сгущенную (5% по весу) суспензию дрожжей. Сгущение предотвращает деление клеток при добавлении глюкозы в среду инкубации, что существенно упрощает интерпретацию получаемых результатов. Как установлено ранее в нашей лаборатории / 115 /, сгущение само по себе не вызывает каких-либо заметных биохимических или морфологических изменений в митохондриях и не влияет на жизнеспособность клеток.

Из результатов, приведенных на рис. I, следует, что дрожжевые клетки, инкубировавшиеся в виде сгущенной и несгущенной суспензий, не идентично реагируют на добавление глюкозы (в конечной концентрации 10$) в среду. Так, клеточное дыхание дрожжей в обычной суспензии снижалось более чем на 80% за 3 час инкубации в присутствии глюкозы, тогда как клеточное дыхание дрожжей в сгущенной суспензии в аналогичных условиях снижалось приблизительно на 50%, после чего оставалось неизменным по крайней мере в течение 3 час. Следует отметить, что повышение (до 20%) содержания глюкозы в среде инкубации сгущенной суспензии дрожжей не стимулировало дополнительного падения клеточного дыхания.

После переноса дрожжей в среду, лишенную глюкозы, клеточное дыхание быстро восстанавливалось (рис.1). Приблизительно за 3 час оно достигало начального уровня ( что составляло 44 натома О/мин на мг сырого веса клеток) независимо от концентрации клеточной суспензии, что соответствует данным Джайарамаяа с соавт.

Определение в бана.-, бала- и цитохром.с-гидролазных активностей белков СЩ

До сих пор не было известно, сколько и каких протеиназ находится во. внутренней митохондриальной мембране дрожжей.

В настоящей работе разработан экспериментальный подход к решению этой проблемы. При этом за основу был взят метод разработанный Бардом / 183, 184 / для определения активностей некоторых протеолитических ферментов в ПААГ.

Специальные эксперименты позволили подобрать оптимальные условия для электрофоретического разделения белков СМЧ с последующим выявлением непосредственно в геле БАНА-, БАЛА- й цшюхром б -гидролазных активностей. При этом варьировали системы разделения, концентрацию ПААГ, время электрофореза, температуру, детергент, с помощью которого солюбилизировали СМЧ, и концентрацию белка.

После 2,5-часового электрофореза солюбилизированных 0,3$ тритоном Х-100 СМЧ в ПААГ / 184 / и окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым Р-250 в геле выявлялись 2 основные зоны белков, одна из которых занимала приблизительно 1/3 геля сразу после старта (катодная зона), а другая соседствовала с фронтом подвижных ионов ( анодная зона). Нефиксированные гели инкубировали с синтетическими субстратами сериновых протеиназ (БАНА и БАЛА), продукты гидролиза которых обнаруживались в катодной зоне. Из денситограм-мы гелей следует, что эти продукты образуют две полосы в катодной зоне (рис.8а). После увеличения продолжительности электрофореза до 4 час полосы в катодной зоне сохранялись, а в средней зоне геля появлялась еще одна узкая полоса (рис.86). Приведенные данные означают, что либо СМЧ содержат 3 фермента, гидролизующих БАНА и БАЛА, либо одна гидролаза обладает способностью связываться с различными мембранными компонентами.

Гидролиз БАНА и БАЛА не удавалось обнаружить, если СМЧ до нанесения на гель инкубировали в течение 5 мин при 100. Следует отметить, что продукты гидролиза синтетических субстратов диффундируют из геля в среду, вследствие чего через 6-8 суток желтые полосы, характеризующие активность гидролаз, становятся шгохо различимыми.

В другом эксперименте электрофоретическое разделение белков СМ, солюбилизированных тритоном Х-ЮО, завершали через 2,5 час, гели импрегнировали цитохромом с, после чего инкубировали их в течение 10-60 мин при 35 и фиксировали 12,5% ТХУ, как описано ранее / 185 /. В этом случае на матовом фоне наблюдалось появление полосы просветления в анодной зоне вследствие гидролиза цитохрома с (рис.9). Денситометрия гелей выявила в полосе минимум поглощения с двумя слабо разрешающимися вершинами. Поскольку гидролиз цитохрома с осуществлялся только вблизи от фронта подвижных ионов, можно было думать, что фермент (или ферменты), ответственный за эту реакцию, полностью высвобождается из митохондриальных мембран во время электрофореза в присутствии тритона Х-ЮО.