Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование всасывания, т.е. переноса низкомолекулярных веществ, содержащихся в пище или образующихся в результате полостного и мембранного гидролиза пищевых биополимеров, из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма, является одним из актуальных направлений физиологии пищеварения и питания.
Современные представления о функционировании пищеварительного аппарата (в том числе – в отношении всасывания пищевых веществ) сформировались во многом под влиянием открытия А.М. Уголевым в конце 50-х годов мембранного пищеварения. Локализация мембранного гидролиза пищевых веществ и всасывания образующихся продуктов на одной и той же поверхности – апикальной мембране энтероцитов – является одним из факторов, обеспечивающих тесную интеграцию этих процессов и высокую эффективность работы пищеварительно-транспортного конвейера.
В значительном прогрессе, достигнутом в исследовании механизмов всасывания пищевых веществ и его адаптации, важную роль сыграли различные аналитические (редуцированные) модели: от эвертированных препаратов тонкой кишки (обзоры: Уголев, 1972; 1985; Kimmich, 1981; Karasov, Diamond, 1987; Foulkes, 1996; Barthe et al., 1999; Тимофеева и др., 2000; Метельский, 2007) до везикул изолированных мембран щеточной каймы энтероцитов и клонированных мембранных транспортеров (Уголев, 1985; Уголев, Иезуитова, 1991; Hopfer, 1987; Cheeseman, Tsang, 1996; Kushak, Winter, 2005; Drozdowki, Thomson, 2006a; Wright et al, 2007).
На основе опытов с эвертированными препаратами тонкой кишки была разработана основная модель переноса глюкозы через энтероцит, предполагающая вход глюкозы через апикальную мембрану в клетки с участием натрий-зависимого вторичного активного транспорта и выход глюкозы из них через базолатеральную мембрану с участием облегченной диффузии (Crane et al., 1961), которая в дальнейшем получила развитие в отношении всасывания аминокислот и дипептидов (обзоры: Hopfer, 1987; Тимофеева и др., 2000; Kushak, Winter, 2005). Позднее были получены новые данные в пользу указанной модели благодаря выделению и клонированию апикального натрий-зависимого транспортера глюкозы SGLT1 и базолатерального транспортера облегченной диффузии глюкозы GLUT2 (обзоры: Hopfer, 1986; Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Kushak, Winter, 2005; Wright et al, 2007).
Вместе с тем в последние годы были предприняты попытки ревизии общепринятого представления о вторичном активном транспорте как основном механизме переноса глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов в тонкой кишке млекопитающих. Выдвинуты две новые гипотезы: о преимущественно парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды (Pappenheimer 1987, 2001) и об облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который включается в апикальную мембрану энтероцитов при высоких углеводных нагрузках (Kellett, Helliwell, 2000; Kellett, 2001).
Обе гипотезы основаны главным образом на результатах опытов in vitro или острых опытов in vivo на анестезированных животных. Вместе с тем при использовании разработанной А.М.Уголевым и Б.З. Зариповым (1979) методики хронических опытов было показано, что в отсутствие наркоза и операционной травмы гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке протекают с более высокой скоростью, а степень их сопряжения значительно выше, чем в случае широко применявшихся методов in vivo и in vitro. Существенные различия между острыми и хроническими опытами in vivo обнаружены в отношении реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на некоторые экспериментальные воздействия (введение уабаина и/или удаление ионов натрия) (Уголев и др., 1984; 1986; 1987), а также в отношении проницаемости преэпителиального («неперемешиваемого») слоя тонкой кишки, значительно более высокой в хронических опытах (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996). Все это диктовало необходимость проверки указанных новых гипотез в условиях хронического опыта как наиболее близких к физиологическим.
Остается дискуссионным вопрос о соотношении транспорта продуктов расщепления белков через апикальную мембрану энтероцита в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе пептидов, и в виде малых пептидов (ди- и трипептиды), подвергающихся затем внутриклеточному гидролизу (обзоры: Grimble, Silk, 1989; Уголев и др., 1990; Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 2000; Adibi, 2003; , ). Следует отметить, что кинетические параметры транспорта аминокислот и олигопептидов до настоящего времени практически не исследовались в опытах in vivo в отсутствие наркоза и операционной травмы. Вместе с тем указанные факторы могут существенно изменять относительный вклад «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывание продуктов гидролиза белков.
В последние десятилетия установлены основные факторы, влияющие на протекание гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке (пищевые субстраты, желчь, панкреатический секрет, гормоны), среди которых ведущая роль отводится субстратному регулированию (Karasov, Diamond, 1987; Уголев и др., 1991; Levin, 1994; Ferraris, Diamond, 1997; Ferraris, 2001; Drozdowski, Thomson, 2006b; Wright et al, 2007). Но до настоящего времени нет ясности в отношении роли желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов (обзоры: Karasov, Diamond, 1983; 1987; Уголев и др., 1991б). В литературе имеются сведения, главным образом, о совместном действии желчи и панкреатического секрета. Представлялось важным выявить влияние каждого из них в отдельности на всасывательную способность тонкой кишки, в частности, в отношении всасывания продуктов гидролиза углеводов.
До сих пор при исследовании субстратной регуляции всасывания нутриентов в тонкой кишке практически не использовалась методика хронических экспериментов. Вместе с тем ее применение для этой цели имеет ряд важных преимуществ перед существующими методами, а именно: 1) проведение многократных опытов на одной и той же группе животных; 2) контроль уровня и специфичности локальной субстратной нагрузки на тонкую кишку и возможность выявления реакции на эту нагрузку со стороны соответствующих мембранных гидролитических и транспортных систем; 3) возможность исследования роли эндогенных (в основном, гормональных) факторов, сопутствующих изменению функционального состояния организма, на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки.
Представлялось целесообразным использовать указанные преимущества хронических опытов для выявления особенностей регуляции всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки под влиянием регулярной субстратной нагрузки различной специфичности, а также системных факторов, сопутствующих полному голоданию, белковой депривации и наркозу.
Все вышеизложенное определило постановку цели и задач исследования.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и его адаптивной регуляции при действии различных люминальных и эндогенных факторов.
Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Выявить относительную роль различных механизмов транспорта (парацеллюлярный перенос, облегченная диффузия с участием GLUT2, вторичный активный транспорт с участием SGLT1) во всасывании глюкозы в тонкой кишке.
2. Разработать математический подход и использовать его для оценки по данным, полученным в хронических опытах, «истинных» (с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) кинетических параметров мембранного гидролиза мальтозы и дипептидов, а также всасывания глюкозы, аминокислот и дипептидов.
3. Определить соотношение «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании дипептидов.
4. Оценить влияние различных по специфичности субстратных нагрузок на структурные и функциональные характеристики тонкой кишки.
5. Оценить роль желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.
6. Изучить влияние наркоза на гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке.
7. Исследовать влияние полного голодания и белковой депривации на гидролитические и транспортные функции тонкой кишки.
НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые показано, что высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне больших концентраций мальтозы имеют место в отсутствие всасывания воды (в случае гипоосмотических инфузатов) и даже на фоне секреции воды (в случае гиперосмотических инфузатов); эти результаты свидетельствуют о том, что парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.
Впервые показано, что флоретин (ингибитор GLUT2), введенный с мукозной стороны кишки, в условиях хронического опыта не только ингибирует всасывание глюкозы (или галактозы), но и способен неспецифически тормозить всасывание глицина. В опытах in vitro обнаружено, что он снижает выход глюкозы из энтероцитов в эвертированных мешках тонкой кишки и ингибирует активность пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой оболочки. Эти результаты позволяют заключить, что используемый рядом зарубежных исследователей подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, дает завышенную оценку вклада облегченной диффузии и заниженную оценку вклада вторичного активного транспорта с участием транспортера SGLT1 во всасывание глюкозы.
С применением разработанного математического подхода впервые по данным о кинетике гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке в хронических опытах получена оценка проницаемости преэпителиального слоя и, с ее учетом, определены значения «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы. Это позволило впервые установить, что значительно бльшие скорости всасывания глюкозы в хронических опытах, по сравнению с острыми опытами in vivo, обусловлены не только лучшей проницаемостью преэпителиального барьера тонкой кишки, но и более высоким значением константы максимальной скорости активного транспорта глюкозы.
Впервые с применением разработанного математического подхода определены в условиях хронического опыта значения «истинных» кинетических констант мембранного гидролиза и всасывания дипептидов (глицилглицин и глицил-L-лейцин) и составляющих их аминокислот (глицин и лейцин), что позволило количественно оценить относительную роль «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании каждого из этих дипептидов в широком диапазоне их концентраций.
В опытах с перевязкой желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов впервые показано повышение активного транспорта свободной глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов. После перевязки панкреатического протока у кроликов отсутствовали заметные изменения в активном транспорте глюкозы, образующейся при мембранном гидролизе крахмала. Повышение активного транспорта глюкозы в указанных отделах тонкой кишки обеспечивает сохранение высокой эффективности работы пищеварительно-всасывательного конвейера в отношении углеводных полимеров при снижении темпов полостного пищеварения вследствие недостаточности панкреатических ферментов.
Впервые исследована динамика развития адаптивных изменений гидролиза и всасывания различных субстратов в изолированном участке тонкой кишки крыс в хронических опытах при белковой депривации животных в течение двух недель. Обнаружены разнонаправленные изменения всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина на разных сроках безбелкового рациона. Несмотря на то, что в некоторые сроки эти показатели снижаются, их уровень остается довольно высоким, что играет жизненно важную роль при возобновлении кормления.
Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие современных представлений о механизмах транспорта глюкозы, аминокислот и дипептидов в тонкой кишке млекопитающих в физиологических условиях. Полученные результаты показывают, что парацеллюлярный перенос на потоке воды, рассматривавшийся некоторыми исследователями как основной механизм всасывания глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках, в этих условиях не играет заметной роли. Наши данные свидетельствуют о том, что основным механизмом всасывания глюкозы является ее активный транспорт, опосредованный SGLT1, тогда как роль облегченной диффузии с участием GLUT2 становится существенной лишь при высоких углеводных нагрузках. Согласно результатам нашей работы, относительный вклад «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывание дипептидов в физиологических условиях определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида.
Представленные результаты способствуют более глубокому пониманию путей и механизмов адаптивной регуляции всасывания нутриентов при действии различных люминальных и эндогенных факторов. Раскрыты особенности влияния наркоза и операционной травмы, присущих острым опытам in vivo, на всасывание нутриентов. Показано, что наркоз влияет на проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и на величину максимальной скорости активного транспорта глюкозы. Данные о реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на полное голодание и безбелковое питание предполагают участие эндогенных факторов, сопутствующих этим состояниям, в регуляции процессов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов. Показано сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ в условиях полного голодания или содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе, что, по-видимому, играет важную роль в обеспечении эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасывания основных компонентов пищи при возобновлении питания. Проанализированы особенности изменения активного транспорта глюкозы в тонкой кишке после перевязки желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов. Полученные данные позволяют полагать, что повышение активного транспорта глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов направлено на сохранение эффективного всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе углеводных полимеров, в условиях снижения темпов полостного пищеварения вследствие исключения желчи и панкреатического секрета.
Результаты экспериментального исследования различных механизмов всасывания глюкозы, а также механизмов гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот, могут иметь значение для совершенствования методов энтерального и парентерального питания, а также для оценки механизмов действия лекарственных веществ олигопептидной природы.
Результаты исследования субстратной регуляции всасывания в изолированном участке тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта способствуют пониманию механизмов адаптивных перестроек тонкой кишки после хирургических вмешательств и могут быть полезны при разработке диетического питания в постоперационном периоде.
Данные о реакции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе углеводов различной степени полимерности, на исключение желчи или панкреатического секрета расширяют представления о механизмах адаптивных перестроек тонкой кишки при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической a-амилазы) и могут быть полезны для разработки лечебных диет при указанной патологии.
Исследование изменений функциональных характеристик изолированного участка тонкой кишки в хронических опытах, а также изменений функциональных характеристик препаратов тонкой кишки в опытах in vitro на фоне полного голодания или безбелкового питания, имеет практическое значение для разработки лечебных диет, обеспечивающих оптимальный рефидинг – переход от состояния голодания (лечебного или вынужденного) к нормальному питанию.
Математические подходы, позволяющие оценить проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и, с ее учетом, «истинные» кинетические константы мембранного гидролиза и всасывания субстратов, могут найти применение при анализе результатов перфузионных исследований in vivo на животных и на человеке.
Данные, полученные в работе, могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и биохимии.
