Введение к работе
Актуальность темы.
В настоящее время процесс старения привлекает внимание множества исследователей (Zhang et al., 1995; Mattson et al., 1999, 2001; Kim et al., 2001; Beneke and Burkle, 2004). В процесс старения, как известно, вовлечены сложные механизмы, в которых принимают участие самые различные молекулярные системы – иммуномодуляторы, ростовые факторы, гормоны, нейрогормоны, рецепторные и многие другие белки (Cutler, 1991; Browner et al., 2004; Heiser et al., 2004; Holzenberger et al., 2004; Lutomska et al., 2008). Согласно некоторым авторам, старение может запускаться 2 механизмами: укорочением теломер и повреждением ДНК (Ding and Shen, 2008), что индуцирует клеточное старение (Eller et al., 2006; Lucassen et al., 1997; Harrigan et al., 2007). Однако и тот, и другой механизмы старения в высокой степени зависят от р53-статуса (Li et al., 2008, Campisi, 2002). Продукт гена-онкосупрессора р53 играет критическую роль в поддержании геномной целостности в клетках млекопитающих. Возможность р53 индуцировать апоптоз – важнейшая функция этого белка-фактора супрессии опухолей, определяющая его роль в старении (Sommers et al., 2005; Sharma et al., 2007). Необратимая остановка пролиферации старых клеток сопровождается p53-зависимой транскрипционной активацией генов-мишеней p53 (). Активация p53 в старых клетках, по-видимому, происходит в ответ на хромосомные разрывы, ассоциированные с укорочением теломер в стареющих клетках (). Таким образом, многими авторами показано активное участие апоптоза в старении клеток (Fearnley and Lees, 1991; et al., 1991; Nagai et al., 1993; et al., 1994; Taglialatela et al., 1996; Kiatipattanasakul et al., 1996).
Как известно, старение организма во многом зависит от изменения нейроэндокринной регуляции (Olovnikov, 2007). Очевидно, что состояние нейросекреторных клеток на поздних этапах онтогенеза влияет на их морфофункциональную активность и определяет темпы и направление старения органов-мишеней.
В то же время практически не изучены инволюционные изменения нейронов мозга, генетические «триггеры» старения и пути утилизации стареющих клеток. Не определены молекулярные механизмы клеточной гибели на поздних этапах онтогенеза. Имеющиеся литературные данные представлены результатами, полученными в основном на клеточных культурах, т.е. в условиях изоляции однородных клеток (Oshima et al., 1995; Gray et al., 1997; Poot et al., 2004; Dimri et al., 2005; Kimura et al., 2005; Nyunoya et al., 2009). Подобные данные невозможно адаптировать к физиологическим процессам, протекающим в целом организме.
В связи с этим, представляется актуальным исследовать механизмы регуляции апоптоза клеток нейроэндокринной системы при старении. Использование в качестве модели трансгенных мышей даст возможность изучить роль тирозинкиназного рецептора онкопротеина HER2/neu в регуляции апоптоза нейронов старых животных. Предполагается, что изменение сигнальных каскадов апоптоза при старении является базой для развития новообразований. Известно, что недостаточная активность онкосупрессора р53 является причиной канцерогенеза и, соответственно, сокращения продолжительности и качества жизни индивида (Sommers et al., 2005; Пискунова и др., 2007). Таким образом, очевидно, что выявление механизма р53-зависимого апоптоза и взаимосвязи онкогена HER2/neu c генами, регулирующими р53 (WRN) и транскрипционными мишенями р53 будет иметь большое практическое значение в теоретической и клинической медицине.
Кроме того, представляет глубокий интерес выявление роли другого важного проапоптотического фоктора – TNF-alpha (tumor necrosis factor, фактор некроза опухолей) в регуляции апоптоза при старении. На модели TNF-нокаутных мышей будут исследованы изменения механизмов апоптоза, вызванные отсутствием гена TNF.
Результаты данного исследования будут иметь практическое значение в онкологии и геронтологии.
Цель исследования - изучить молекулярныe механизмы регуляции апоптоза клеток нейроэндокринной системы на поздних этапах онтогенеза и выявить морфофункциональные изменения, связанные со старением.
Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих задач:
-
изучить адаптивные возможности и механизмы стрессорного ответа гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы при старении.
-
изучить сигнальные пути, приводящие к изменению уровня апоптоза нейронов мозга при старении.
-
оценить вклад клеточных рецепторов – рецептора эпидермального фактора роста (HER2) и фактора некроза опухолей (TNFa) в реализацию апоптоза нейронов гипоталамуса при старении.
-
изучить возможность модуляции старческого апоптоза нейронов мозга и определить возможные геропротекторы.
-
выявить изменения морфофункциональной активности клеток нейросекреторной системы гипоталамуса, связанные с активацией генов апоптоза в позднем онтогенезе.
Научная новизна.
Впервые дан комплексный анализ нонапептидергической, NPY-ергической и моноаминергической систем гипоталамуса на поздних этапах онтогенеза. Выявлена возрастная динамика функциональных и адаптивных возможностей нейросекреторной системы, а также зависимость синтеза вазопрессина и апоптоз-ассоциированных молекул от генотипа животного.
Разработано концептуальное представление об участии апоптоза в инволюционных процессах нейронов мозга. Впервые получены данные, объясняющие механизм регуляции апоптоза нейросекреторных клеток гипоталамуса млекопитающих на поздних этапах онтогенеза. Выявлены гены, активирующие/тормозящие сигнальные пути апоптоза нейронов при старении и определены апоптотические сигнальные каскады гибели нейронов молодых и старых животных. Анализ результатов выявил ряд генов, активация которых характерна для нейросекреторных клеток на поздних этапах онтогенеза, что позволило определить возможные генетические «триггеры старения» в НЭС. Подтверждено наличие caspase-зависимого пути клеточной гибели при старении.
Впервые изучены инволюционные изменения нейронов гипоталамуса ускоренно стареющих мышей линии HER2/neu и обнаружены причины низкого уровня апоптоза у этих животных. Впервые показано, что отсутствие определенных генов, участвующих в канцерогенезе (TNF) (TNF-нокаутные мыши), и сверхэкспрессия онкопротеина HER2/neu (HER2/neu-трансгенные мыши) оказывает определенное влияние на онтогенетическую модель регуляции апоптоза.
Впервые изучено действие иммуномодуляторов (альфа-интерферон, циклоферон) на синтез нейрогормонов и апоптоз-ассоциированных белков в нейросекреторных клетках в позднем онтогенезе. Показано, что участие иммуномодуляторов в регуляции апоптоза зависит от стадии онтогенеза.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Гипоталамо-гипофизарная система старых животных находится в состоянии напряжения (включая пептидергическую, NPY-ергическую, моноаминергическую системы), в связи с чем механизмы гипоталамического стрессорного ответа у старых крыс значительно отличаются от реакции молодых животных. На поздних этапах онтогенеза адаптивные реакции протекают тяжелее и с запаздыванием в связи с возрастными нарушениями в нейроэндокринной системе.
-
При физиологическом старении нейросекреторные клетки гибнут путем апоптоза, при этом активируется внешний путь клеточной гибели (caspase-8-зависимый), митохондриальный (изменения экспрессии белков семейства Bcl-2) и р53-зависимый путь, связанный с повреждением ДНК.
-
Индукция апоптоза при старении не зависит от наличия гена TNF.
-
Сигнальные пути апоптоза одинаковы в нейросекреторных центрах молодых мышей, но различаются у старых животных в физиологических условиях и при стрессе.
-
Участие иммуномодуляторов в регуляции клеточной гибели нейронов гипоталамуса зависит от стадии онтогенеза и от вида иммуномодулятора.
-
Сверхэкспрессия HER2/neu достаточна для защиты от возраст-зависимой активации апоптоза в нейросекреторных центрах. Основным механизмом подавления апоптоза у трансгенных мышей является блокирование р53-зависимого каскада, что приводит к снижению синтеза caspase-8 и Вах, дисрегуляции синтеза антиапоптотических белков Bcl-2 и Mcl-1.
Теоретическая и практическая значимость.
Результаты проведенных исследований позволяют расширить и углубить представления о возрастных изменениях одной из наиболее важных регуляторных систем организма - нейроэндокринной системы, как ее центрального звена (гипоталамо-гипофизарная система), так и периферического (кора надпочечников). Данные, полученные в работе, позволяют выявить роль отдельных генов в регуляции старения и апоптоза, а также конкретные механизмы гибели нейронов мозга при старении.
Практическая ценность результатов исследования состоит в необходимости учета возрастных особенностей при использовании иммуномодуляторов и лечебной гипероксигенации в эксперименте и в клинике.
Выявленные в работе закономерности регуляции апоптоза на поздних этапах онтогенеза, особенности протекания инволюционных процессов в нейронах мозга могут быть использованы при изучении курсов физиологии, клнточной биологии, возрастной физиологии, геронтологии и гериатрии в вузах биологического и медицинского профиля, при подготовке аспирантов данных специальностей, а также учтены при использовании в геронтологии, гериатрии и онкологии.
Материалы диссертации включены в курс лекций по физиологии Российского государственного педагогического университета им. Герцена
(Санкт-Петербург).
Апробация работы.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: Международная конференция «Колосовские чтения» (С-Петербург, 1997, 2006), II National Gerontology Congress with international participant (Bucharest, Romania, 1997), World Congress of neurohypophysial hormones (Monreal, Quebec, Canada, 1997), 1-я и 2-я конференции с международным участием “Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии”, посвященная 75- и 80-летию проф. Колпакова (Новосибирск, 1997, 2002), The 4th International Congress of Neuroendocrinology (Kitakyushu, Japan, 1998), Genetic and developmental psychoneuroendocrinology, International Symposium (Новосибирск, 1999), Всероссийские конференции с международным участием «Нейроэндокринология» (С.-Петербург, 2000, 2003, 2005, 2010), ХХХ Всероссийское Совещание по проблемам высшей нервной деятельности, посвящ. 150-летию Павлова (С.-Петербург, 2000), International Conference “Free radicals in the development and functions of CNS. From fetus to aging” (С.-Петербург, 2001), конференция молодых ученых и специалистов (С.-Петербург, 2003), VIII Meeting on high pressure biology (Москва, 2003), International Symposium “Neuron differentiation and plasticity – regulation by intercellular signals” (Москва, 2003), the 2nd International Conference on Functional Genomics of Ageing (Crete, Greece, 2004), научно-практическая конференция «Общество, государство и медицина для пожилых и инвалидов» (Москва, 2004), VII международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2004), XIX съезд Физиологического общества им. Павлова (Екатеринбург, 2004), электронная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2004, 2005, 2008), 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), V Методологический семинар «Методология и методика научных исследований в области естественно-научного образования» (С.-Петербург, 2005), International Summer school in Behavioral Neurogenetics (Москва. 2005), XIII Международное Совещание им. Орбели по эволюционной физиологии (С.-Петербург, 2006), межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» (С.-Петербург, 2006), международная конференция «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), the 2nd World Congress on Gender-Specific Medicine (Rome, Italy, 2007), ХХ съезд Физиологического общества им. Павлова (Москва, 2007), VI European Congress of International Association of Gerontology and Geriatrics (С.-Петербург, 2007), IX Российско-Китайский симпозиум «Новые материалы и технологии» (Астрахань, 2007), конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (С.Петербург, 2008), международный симпозиум «Профессиональное здоровье и качество жизни» (Гавана, Куба, 2009), 12th International TNF Conference «The TNF superfamily and its interactions with other signaling proteins in infection, autoimmunity, cancer and therapy» (El Escorial, Madrid, Spain, 2009), 1st International Congress on Controversies in Longevity, Health and Aging (Barcelona, Spain, 2010).
Результаты исследований опубликованы в следующих журналах: «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Морфология», «Neuroscience Behavior Physiology», «Цитология», «Успехи современной биологии», «Естественные науки», «Mechanisms of ageing and development», «Успехи геронтологии», «Доклады Академии наук», а также в сборнике трудов «Environment and human health: The complete works of International Ecologic Forum», 2003, St. Petersburg, Russia / Editor in chief G.A. Sofronov. Spb.: SpecLit, 2003. – 864 p.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 59 работ, в том числе 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.
Структура и объем диссертации.
