Содержание к диссертации
Введение
1 Материал и методы исследования 16
1. Объект исследования 16
2. Получение зародышей мышей 16
3. Рентгеновское облучение 16
4. Гамма-облучение 16
5. Трансплантация кроветворной ткани и кроветворные колонии в селезенке 16
6. Определение самообновления кое-с 16
7. Н3-тимидиновое и н3-уридиновое «самоубийство» 17
8. Оксимочевиновое «самоубийство» 17
9. Обработка антибиотиками 18
10. Обработка 5-фторурацилом (5-фу) 18
11. Обработка дипином 18
12. Анемия 18
13. Эктопическая трансплантация 18
14. Культивирование клеток костного мозга 19
15. Получение кроличьей антисыворотки к головному мозгу мыши (касмм) и экспозиция с ней кроветворных клеток 19
16. Обработка результатов 20
2 Обзор литературы 21
1. Фенотипическая и функциональная характеристика кроветворных стволовых клеток 22
2. Пролиферативный статус кроветворных стволовых клеток 29
2.1. Исследование кроветворных стволовых клеток с помощью мультипараметрического анализа 29
2.2. Содержание РНК 31
2.3. Фенотипические различия покоящихся и пролиферирующих КСК 32
2.4. Положение КСК в клеточном цикле и способность к репопуляции 33
2.5. Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов 34
2.6. Сочетанный эффект цитотоксических препаратов и цитокинов 38
2.7. Кинетика клеточного цикла КСК 39
3. Родоначальные кроветворные клетки, образующие кроветворные колонии в селезенке (кое-с) 42
3.1. Метод селезеночных колоний и его применение для исследования популяции родоначальник клеток 42
3.2. Фенотипическая характеристика КОЕ-С 43
3.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С, образующих ранние и поздние селезеночные колонии 45
3.3.1. Экспрессия антигенов клеточной поверхности 46
3.3.2. Пролиферативный статус КОЕ-С и регуляция их пролиферации 47
3.3.3. Чувствительность к цитотоксическим агентам 49
3.4. Положение КОЕ-С в гистогенетическом ряду кроветворных клеток 51
4. Кроветворное микроокружение и гемопоэз 57
4.1. Характеристика кроветворного микроокружения и его регуляторной функции 57
4.2. Мезенхимные (стромальные) стволовые клетки 60
4.2.1. Фенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных (стромальных) стволовых клеток 60
4.2.2. КОЕ-Ф - стромальная стволовая клетка 61
4.2.3. Эктопическая трансплантация костного мозга в виде фрагмента 62
4.2.4. Гистогенетические отношения МСК и КСК 64
4.2.5. МСК и мезенхимные сосудистые гладкомышечные клетки (МСГК) 64
5. Кроветворные стволовые клетки в пренатальном развитии 66
5.1. Происхождение КСК в эмбриональном развитии млекопитающих 66
5.2. Печень как основной кроветворный орган в пренатальном онтогенезе 73
5.2.1. Развитие кроветворения в печени 73
5.2.2. Кроветворное микроокружение эмбриональной печени и миграция кроветворных клеток в кроветворные органы в пренатальном развитии 75
5.2.3. Характеристика КСК из фетальной печени 80
Обсуждение результатов 173
Общее заключение 199
Выводы 204
Литература 207
- Гамма-облучение
- Обработка дипином
- Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов
- Фенотипическая характеристика КОЕ-С
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тканеспецифи-ческих стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей.
Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гра-нулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные стволовые клетки (КСК). Основные их свойства - способность к самоподдержанию и по-липотентность. Благодаря самоподдержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани — способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с кроветворными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК.
Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетерогенна и включает два подотдела (компартмента) клеток, различающихся по фенотипу (антигенным характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференцировке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподдержанием; второй — КСК, самоподдерживающиеся не более 3-6 недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоци-тарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки — КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и КСК.
Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференцировке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования были неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии.
Прижизненное наблюдение кроветворных клонов-колоний в селезенке, образованных костномозговыми КОЕ-С показало, что колониеобразование является динамическим процессом появления и исчезновения клонов, образуемых клоногенными клетками, различающимися по степени зрелости и времени формирования клона (Magli et al., 1982; Priestley, Wolf, 1985; Molineux et al., 1986; Wolf, Priestley, 1986). Было обнаружено, что у половозрелых животных популяция КОЕ-С костного мозга гетерогенна, и в зависимости от срока регистрации колоний можно анализировать категории более «молодых» и более «старых» КОЕ-С (Magli et al., 1982). К началу нашего исследования немногочисленные факты указывали на то, что эмбриональная кроветворная ткань отличается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущовым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников.
Как известно, одним из важных показателей клеточной активности является интенсивность синтеза РНК, меняющаяся в зависимости от стадии дифференцировки клетки, потребностей в белковом синтезе, фазы митотического цикла и т.д. В норме КСК и КОЕ-С представляют собой покоящиеся популяции клеток (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Lerner, Harrison, 1990; Berardi et al., 1995; Ross et al., 1982; Morrison et al., 1997). Предполагалось, что синтез РНК в митотически инертных КОЕ-С, находится на достаточно низком уровне и для вступления в пролиферацию необходима его активация. Однако эта цитофизиологическая особенность КОЕ-С оставалась практически не изученной, и ее исследование нуждалось в новых подходах, поскольку традиционная радиоавтография не может быть использована для анализа клоногенных кроветворных клеток, не имеющих характерных морфологических признаков в отличие от дифференцированных клеток таких, например, как малые лимфоциты.
Костный мозг половозрелых животных является источником наряду с КСК и других стволовых клеток, в частности мезенхимных (стромальных), которые тестируются in vitro по образованию колоний фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф) и обладают, как и кроветворные клетки, определенной иерархической организацией (Owen, 1988). В прена-тальном и раннем постнатальном развитии стволовые клетки стромы выявлены в печени и селезенке, причем их численность, оцененная по числу формируемых ими колоний in vitro, соответствует гемопоэтической активности кроветворного органа (Van Den Heuvel et al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка — позволяет вывить ме-зенхимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша.
В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофи-зиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию применения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стромальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани.
Помимо практического применения цитотоксические препараты могут использоваться в качестве адекватного инструмента для изучения иерархической организации клеточных популяций. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифферен-цировки позволяет не только определить их роль в восстановлении ткани, но и установить положение той или иной клеточной категории в диффероне. Учитывая специфику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе.
Еще одной фундаментальной и практически значимой проблемой, связанной с функционированием кроветворной ткани, является адаптация организма к несвойственной ему среде обитания. Способность быстро отвечать на функциональные запросы, изменения окружающей среды, стрессовые и экстремальные воздействия позволяют считать кроветворную и соединительную ткани уникальными объектами и адекватными тест-системами и для изучения различных внешних воздействий. В частности, нормальное функционирование кроветворной системы является одним из непременных условий космических полетов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что пребывание в космическом полете вызывает изменения в периферической крови у человека и млекопитающих (Berry, 1970; Газенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978, 1980; Илюхин, Бурковская 1981; Udden et al., 1995). Некоторые изменения, зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы могут быть вторичными и являться результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов космического полета. Поэтому актуальность приобретают исследования других отделов кроветворного дифферона и, в первую очередь, отделов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне. Модельные эксперименты на лабораторных животных дают уникальную возможность на обширном и однородном материале получить максимально полную картину изменений в кроветворной системе, связанных с действием факторов полета. В экспериментах на биоспутниках серии «Космос», выполненных нами совместно с учеными Чехословацкой академии наук, было оценено влияние космического полета на стволовые кроветворные клетки млекопитающих (крыс) и плодов, развитие которых частично проходило в условиях полета.
Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку у- облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002).
Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной дифференцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и со единительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных субпопуляций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей. Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование:
- структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стромаль-ного дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей);
- влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.
Конкретными задачами работы были следующие:
Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С - и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития.
Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С.
Исследование чувствительности отдельных категорий КОЕ-С зародышей и взрослых животных к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину).
Исследование чувствительности родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) к действию цитотоксических препаратов (5-фторурацилу и дипину).
Характеристика потенций к дифференцировке мезенхимы печени в зависимости от уровня ее гемопоэтической активности.
Исследование влияния факторов космического полета на родоначальные кроветворные клетки в плодном периоде развития и постнатальном онтогенезе млекопитающих (крыс).
Изучение влияния непрерывного у- облучения в низких дозах на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.
Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре - и постнатальном онтогенезе, цитофи-зиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток, об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия.
Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постнатального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветворной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории кло ногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С - пре-КОЕ-С.
Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальных клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи.
Установлено, что КОЕ-С-11, присутствующие в печени в постнатальном онтогенезе, представляют собой более зрелые клетки по сравнению с КОЕ-С-11 из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Таким образом, очевидно, КОЕ-С поступают в печень из циркуляции и не являются «дремлющими» эмбриональными.
Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначальных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и коло-ниеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК.
Выявлено, что однократное введение алкилирующего препарата дипина вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, проявляющееся в периодических (синусоидальных) изменениях содержания кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11) в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, дифференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии
В популяции стромальных клеток костного мозга выделены категории клеток, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину) и участию в регенерации эктопических трансплантатов. Наиболее чувствительные к дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаративными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы.
Впервые показано, что мезенхима печени зародышей в период активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При трансплантации печени 14-суточных зародышей мыши под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов происходит последовательное новообразование гиалинового хряща, кости и кроветворных очагов.
Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращении численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде.
Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия непрерывного у- облучения в малых дозах (радиационный гормезис) на стромальные родоначальные клетки костного мозга, который выражается в активации пролиферации, увеличении численности популяции КОЕ-Ф и усиление регенераторных потенций стромальных родоначальных клеток.
Теоретическая значимость работы. В данной работе проведено комплексное исследование родоначальных кроветворных и стромальных клеток, согласованная работа которых обеспечивает нормальное функционирование кроветворной ткани как единой системы.
В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренатального и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе кло-нальной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток, различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки.
Выявлено негативное воздействие факторов космического полета на миелопоэз, которое заключается в резком уменьшении численности родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах млекопитающих.
Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении про-лиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и
соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении.
Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цито-физиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репаративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих рабочих, Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях, совещаниях и симпозиумах: 6-м Совещании европейской группы по изучению клеточной пролиферации (Москва, СССР, 1973), Республиканской конференции «Структурные и функциональные изменения в клетках мезенхимы» (Киев, СССР, 1982), 5-м Ежегодном симпозиуме комиссии по гравитационной физиологии международного союза физиологических наук (Москва, СССР, 1983 г.), 17-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Брно, Чехословакия, 1984 г.), 18-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Гагра, СССР, 1985 г.), 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, СССР, 1986), Научной конференции «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах» (Иркутск, СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее COSPAR (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семина ре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования.
В работе использованы 10-, 14- и 18-суточные зародыши, 2-х и 7-ми дневные мышата и половозрелые лабораторные мыши гибриды F1 (СВАхС57В1/6) самцы и самки, а также 18-суточные зародыши и половозрелые самцы и самки крыс линии Wistar.
Получение зародышей мышей.
Скрещивали 3-месячных самок СВА с самцами С57В1/6. Срок зародышевого развития определяли, считая первым днем развития день обнаружения влагалищной пробки. Зародышей извлекали из матки, помещали в среду 199, освобождали от оболочек и под бинокулярной лупой извлекали кроветворные органы (желточный мешок, печень и селезенку).
Рентгеновское облучение.
Сингенных мышей-реципиентов облучали на рентгеновской установке РУМ-17 (175 кВт, 15 мА, фильтры 1,0 А1 + 0,5 Си, мощность дозы - 53 Р/мин) в дозе 7,1 Гр. Дозу облучения контролировали с помощью клинического дозиметра 27012 (Германия).
Гамма-облучение.
Животные-доноры костного мозга (10-15 жив) подвергались непрерывному 10-суточному гамма- излучению от радионуклида 60Со (энергия гамма- квантов 1,17 и 1,33 МэВ, среднесуточная поглощенная доза 0,15-0,2 сГр, суммарная доза 1,5-2 сГр). Часть доноров (10-15 жив) служила контролем и находилась в соседнем помещении, где радиационные условия соответствовали естественному радиационному фону. Радиационный фон в помещении при закрытом источнике гамма - облучения составлял 7,7 мкГр/сут.
Трансплантация кроветворной ткани и кроветворные колонии в селезенке.
Содержание родоначальных кроветворных клеток определяли методом Тилла и МакКаллока (Till, McCulloch, 1961). Взвесь кроветворных клеток вводили внутривенно в дозе 0,5-2х 105 клеток мышам и 1 -2х 106 клеток крысам. Подсчет колоний в селезенках проводили на 7-11-е сутки после облучения реципиентов.
Определение самообновления КОЕ-С.
Облученным первичным реципиентам вводили внутривенно взвесь клеток печени
14-суточного зародыша или костного мозга. Через 7 и 11 суток животных забивали. На
каждый исследуемый срок половину селезенок использовали для определения числа колоний, другую половину - для приготовления взвеси клеток и ретрансплантации их в дозе 106 клеток/жив (0,2-3,7 колоний/жив) вторичным реципиентам. На 11 сутки проводили раздельную ретрансплантацию клеток крупных и мелких колоний. Для этого под бинокулярной лупой вырезали участки селезенки с крупными колониями и отдельно приготовляли взвесь клеток из ткани селезенки, содержащей крупные и мелкие колонии. Величину индекса самообновления каждой категории КОЕ-С определяли, как соотношение числа вторичных КОЕ-С, приходящихся на одну первичную КОЕ-С.
Н-тимидиновое и Н-уридиновое «самоубийство».
Взвесь клеток костного мозга экспонировали с радиотоксическими дозами изотопа in vitro в течение 30-60 минут. Доза 3Н-тимидина составляла 50 мкКю/мл (удельная актив-ность - 12,5 Кю/мМ), доза Н-уридина - 50-75 мкКю/мл (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199 с холодным уридином или тимидином. При введении 3Н-тимидина и 3Н-уридина in vivo животные получали соответственно 50мкКю/г (удельная активность - 12,5 Кю/мМ) и 50-75 мкКю/г (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Контрольные животные или образцы клеточной взвеси экспонировали с холодным тимидином, соответственно с 400 мкг/жив или 30 мкг/мл.
Оксимочевиновое «самоубийство».
Оксимочевину в дозе 0,9 мг/г вводили
а) внутривенно в 0,3 мл среды 199 облученным реципиентам непосредственно после трансплантации взвеси кроветворных клеток (Monette, Demers, 1982). Контрольным животным вводили соответствующий объем среды 199.
б) внутрибрюшинно в 0,2 мл среды 199 за 1 час до забоя. Контрольным животным вводили 0,2 мл среды. Число клеток в костном мозге от каждого животного-донора подсчитывали отдельно и объединяли равное число клеток от 5-10 животных для последующего введения летально облученным реципиентам или культивирования в жидкостной культуре.
Долю КОЕ-С и КОЕ-Ф в S-фазе рассчитывали как разность между числом колоний в селезенке (матрасе), образованных клетками контрольного и обработанного оксимоче-виной костного мозга, деленную на число колоний в контрольном варианте.
Обработка антибиотиками.
А) Экспозиция in vitro. Взвесь кроветворных клеток кратковременно (30-60 мин) инкубировали с антибиотиками (3 мкг/мл и 0,04-0,4 мкг/г/мл для актиномицина и сибиро-мицина соответственно). Время экспозиции составляло 30-60 мин. при 37° С. Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199.
Б) Экспозиция in vivo. Мышам-донорам костного мозга актиномицин Д вводили внутрибрюшинно в дозах 0,04-0,4 мкг/г за 2 часа до забоя.
Обработка 5-фторурацилом (5-ФУ).
Кроветворные клетки подвергали воздействию 5-ФУ in vivo (А) и in vitro (Б).
А) мышам-донорам клеток костного мозга и селезенки, а также беременным самкам 5-ФУ вводили внутривенно в дозе 150 мг/кг за 24 часа до извлечения кроветворных органов и трансплантации кроветворных клеток.
Б) взвесь клеток костного мозга и печени в концентрации 10x106 кл/мл инкубировали с различными дозами 5-ФУ (0, 5, 10, 25, 50 и 100 мкг/мл) в 90% среде 199 или Игла и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37° С 2 часа. Затем клетки дважды отмывали средой, центрифугируя при 2 тыс. об/мин в течение 5 минут.
Обработка дипином.
Дипин в дозе 0,03 мг/г вводили внутрибрюшинно донорам клеток костного мозга и селезенки однократно. Содержание КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в кроветворных органах (костном мозге и селезенке) определяли через 1 сутки, 2, 4, 7, 14, 22, 54 и 91 недели. Содержание КОЕ-Ф определяли через 1 сутки, 4,6, 8,12 и 24 месяца.
Анемия.
Анемию вызывали у доноров костного мозга двукратным (с интервалом 24 часа) взятием 0,3-0,5 мл крови из орбитального синуса. Гематокрит определяли рутинным способом, центрифугируя пробы крови на гематокритной центрифуге.
Эктопическая трансплантация.
А) трансплантация кроветворной ткани от половозрелых доноров. Под капсулу почки сингенных половозрелых самцов-реципиентов помещали: (1) содержимое бедренных костей в виде костномозговой «колбаски» («трансплантат костного мозга»), (2) бедренную кость с диафизом («бедренная кость») и (3) селезенку. Селезенку пересаживали целиком на почку реципиентов III группы, закрепляя ее пояском из почечной капсулы (Старостин, 1984). Контролем служили трансплантаты животных, получивших инъекцию раствора
Хенкса. Все операции проводили на наркотизированных животных в операционной. Через
2 и 4 мес трансплантаты извлекали, определяли их размер (по числу кариоцитов) и содержание в них КОЕ-С по методу Тилла и Маккаллока (Till, McCulloch, 1961), что давало возможность судить о так называемой «стромальной функции» фибробластов (Chamberlin etal., 1974).
Б) трансплантация печени 14-суточных зародышей. Печень помещали под капсулу почки половозрелым самцам-реципиентам, предварительно (за 24 часа) облученным в дозе 650 р. Через 1 и 4 суток трансплантаты извлекали и исследовали на содержание КОЕ-С вышеописанным методом.
В части экспериментов печень трансплантировали под капсулу почки и в подкожную соединительную ткань передней брюшной стенки необлученным реципиентам. Трансплантаты вместе с окружающими тканями фиксировали жидкостью «суза», заливали в парафин и приготовляли серийные срезы. Срезы окрашивали по методу Гимза и в некоторых случаях водным раствором толуидинового синего, альциановым синим 8GS ("Merck", Германия) на 3% уксусной кислоте для выявления гликозоаминогликанов, а также по методу шифф-иодная кислота (ШИК) (Лилли, 1969).
Культивирование клеток костного мозга.
КОЕ-Ф определяли методом клонирования стромальных клеток в монослойной культуре (Фриденшетйн, Лурия, 1980). Суспензии клеток из костного мозга или селезенки, полученные от 6-7 животных, вносили в культуральные матрасы в конечной концентрации соответственно 1x106 или 6-10x106 ядерных клеток в 1мл полной питательной среды, состоящей из среды Фишера или альфа-MEM и с 10% эмбриональной телячьей сыво-роткой. В каждый матрас с площадью дна 25 см помещали по 10 мл взвеси костномозговых клеток. До начала культивирования матрасы продували смесью 5% СОг и воздуха и инкубировали в термостате при 37° С 10-12 суток с однократной сменой среды через 5-7 суток. По окончании культивирования среду удаляли, клетки фиксировали метанолом и окрашивали по Гимза. Колонии фибробластов, выросшие в 5-10 матрасах, подсчитывали под бинокулярной лупой.
Получение кроличьей антисыворотки к головному мозгу мыши (КАСММ) и экспозиция с ней кроветворных клеток.
Антисыворотку получали после подкожной иммунизации кролика гомогенатом головного мозга мышей по стандартной методике (Golub, 1972) и адсорбировали эритроцитами и тимоцитами мыши до полного исчезновения реакции с этими клетками в гемагг-лютинации и цитотоксическом тесте соответственно. Клетки печени 14-суточных зародышей обрабатывали КАСММ (40 мин., 20° С) и комплементом (60 мин., 37° С).
Обработка результатов
Обработка результатов проведена с помощью формул математической статистики (Севастьянов, 1982). Сравнение экспериментальных и теоретических данных проводили с помощью критериев х и Колмогорова-Смирнова X. Достоверность различий определяли с помощью критерия Стьюдента.
Гамма-облучение
В работе использованы 10-, 14- и 18-суточные зародыши, 2-х и 7-ми дневные мышата и половозрелые лабораторные мыши гибриды F1 (СВАхС57В1/6) самцы и самки, а также 18-суточные зародыши и половозрелые самцы и самки крыс линии Wistar. Скрещивали 3-месячных самок СВА с самцами С57В1/6. Срок зародышевого развития определяли, считая первым днем развития день обнаружения влагалищной пробки. Зародышей извлекали из матки, помещали в среду 199, освобождали от оболочек и под бинокулярной лупой извлекали кроветворные органы (желточный мешок, печень и селезенку). Сингенных мышей-реципиентов облучали на рентгеновской установке РУМ-17 (175 кВт, 15 мА, фильтры 1,0 А1 + 0,5 Си, мощность дозы - 53 Р/мин) в дозе 7,1 Гр. Дозу облучения контролировали с помощью клинического дозиметра 27012 (Германия). Животные-доноры костного мозга (10-15 жив) подвергались непрерывному 10-суточному гамма- излучению от радионуклида 60Со (энергия гамма- квантов 1,17 и 1,33 МэВ, среднесуточная поглощенная доза 0,15-0,2 сГр, суммарная доза 1,5-2 сГр). Часть доноров (10-15 жив) служила контролем и находилась в соседнем помещении, где радиационные условия соответствовали естественному радиационному фону. Радиационный фон в помещении при закрытом источнике гамма - облучения составлял 7,7 мкГр/сут. Содержание родоначальных кроветворных клеток определяли методом Тилла и МакКаллока (Till, McCulloch, 1961). Взвесь кроветворных клеток вводили внутривенно в дозе 0,5-2х 105 клеток мышам и 1 -2х 106 клеток крысам. Подсчет колоний в селезенках проводили на 7-11-е сутки после облучения реципиентов.
Облученным первичным реципиентам вводили внутривенно взвесь клеток печени 14-суточного зародыша или костного мозга. Через 7 и 11 суток животных забивали. На каждый исследуемый срок половину селезенок использовали для определения числа колоний, другую половину - для приготовления взвеси клеток и ретрансплантации их в дозе 106 клеток/жив (0,2-3,7 колоний/жив) вторичным реципиентам. На 11 сутки проводили раздельную ретрансплантацию клеток крупных и мелких колоний. Для этого под бинокулярной лупой вырезали участки селезенки с крупными колониями и отдельно приготовляли взвесь клеток из ткани селезенки, содержащей крупные и мелкие колонии. Величину индекса самообновления каждой категории КОЕ-С определяли, как соотношение числа вторичных КОЕ-С, приходящихся на одну первичную КОЕ-С. Взвесь клеток костного мозга экспонировали с радиотоксическими дозами изотопа in vitro в течение 30-60 минут. Доза 3Н-тимидина составляла 50 мкКю/мл (удельная актив-ность - 12,5 Кю/мМ), доза Н-уридина - 50-75 мкКю/мл (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199 с холодным уридином или тимидином. При введении 3Н-тимидина и 3Н-уридина in vivo животные получали соответственно 50мкКю/г (удельная активность - 12,5 Кю/мМ) и 50-75 мкКю/г (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Контрольные животные или образцы клеточной взвеси экспонировали с холодным тимидином, соответственно с 400 мкг/жив или 30 мкг/мл. Оксимочевину в дозе 0,9 мг/г вводили а) внутривенно в 0,3 мл среды 199 облученным реципиентам непосредственно после трансплантации взвеси кроветворных клеток (Monette, Demers, 1982). Контрольным животным вводили соответствующий объем среды 199. б) внутрибрюшинно в 0,2 мл среды 199 за 1 час до забоя. Контрольным животным вводили 0,2 мл среды. Число клеток в костном мозге от каждого животного-донора подсчитывали отдельно и объединяли равное число клеток от 5-10 животных для последующего введения летально облученным реципиентам или культивирования в жидкостной культуре. Долю КОЕ-С и КОЕ-Ф в S-фазе рассчитывали как разность между числом колоний в селезенке (матрасе), образованных клетками контрольного и обработанного оксимоче-виной костного мозга, деленную на число колоний в контрольном варианте. А) Экспозиция in vitro. Взвесь кроветворных клеток кратковременно (30-60 мин) инкубировали с антибиотиками (3 мкг/мл и 0,04-0,4 мкг/г/мл для актиномицина и сибиро-мицина соответственно). Время экспозиции составляло 30-60 мин. при 37 С. Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199. Б) Экспозиция in vivo. Мышам-донорам костного мозга актиномицин Д вводили внутрибрюшинно в дозах 0,04-0,4 мкг/г за 2 часа до забоя. Кроветворные клетки подвергали воздействию 5-ФУ in vivo (А) и in vitro (Б). А) мышам-донорам клеток костного мозга и селезенки, а также беременным самкам 5-ФУ вводили внутривенно в дозе 150 мг/кг за 24 часа до извлечения кроветворных органов и трансплантации кроветворных клеток. Б) взвесь клеток костного мозга и печени в концентрации 10x106 кл/мл инкубировали с различными дозами 5-ФУ (0, 5, 10, 25, 50 и 100 мкг/мл) в 90% среде 199 или Игла и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37 С 2 часа. Затем клетки дважды отмывали средой, центрифугируя при 2 тыс. об/мин в течение 5 минут. Дипин в дозе 0,03 мг/г вводили внутрибрюшинно донорам клеток костного мозга и селезенки однократно. Содержание КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в кроветворных органах (костном мозге и селезенке) определяли через 1 сутки, 2, 4, 7, 14, 22, 54 и 91 недели.
Содержание КОЕ-Ф определяли через 1 сутки, 4,6, 8,12 и 24 месяца. Анемию вызывали у доноров костного мозга двукратным (с интервалом 24 часа) взятием 0,3-0,5 мл крови из орбитального синуса. Гематокрит определяли рутинным способом, центрифугируя пробы крови на гематокритной центрифуге. А) трансплантация кроветворной ткани от половозрелых доноров. Под капсулу почки сингенных половозрелых самцов-реципиентов помещали: (1) содержимое бедренных костей в виде костномозговой «колбаски» («трансплантат костного мозга»), (2) бедренную кость с диафизом («бедренная кость») и (3) селезенку. Селезенку пересаживали целиком на почку реципиентов III группы, закрепляя ее пояском из почечной капсулы (Старостин, 1984). Контролем служили трансплантаты животных, получивших инъекцию раствора Хенкса. Все операции проводили на наркотизированных животных в операционной. Через 2 и 4 мес трансплантаты извлекали, определяли их размер (по числу кариоцитов) и содержание в них КОЕ-С по методу Тилла и Маккаллока (Till, McCulloch, 1961), что давало возможность судить о так называемой «стромальной функции» фибробластов (Chamberlin etal., 1974). Б) трансплантация печени 14-суточных зародышей. Печень помещали под капсулу почки половозрелым самцам-реципиентам, предварительно (за 24 часа) облученным в дозе 650 р. Через 1 и 4 суток трансплантаты извлекали и исследовали на содержание КОЕ-С вышеописанным методом. В части экспериментов печень трансплантировали под капсулу почки и в подкожную соединительную ткань передней брюшной стенки необлученным реципиентам. Трансплантаты вместе с окружающими тканями фиксировали жидкостью «суза», заливали в парафин и приготовляли серийные срезы. Срезы окрашивали по методу Гимза и в некоторых случаях водным раствором толуидинового синего, альциановым синим 8GS ("Merck", Германия) на 3% уксусной кислоте для выявления гликозоаминогликанов, а также по методу шифф-иодная кислота (ШИК) (Лилли, 1969).
Обработка дипином
Ключевая роль в процессе кроветворения принадлежит полипотентным стволовым кроветворным клеткам, которые, с одной стороны, обладают значительными потенциями к дифференцировке, давая начало всем типам миелоидных и лимфоидных клеток, а, с другой стороны, наделены способностью к самоподдержанию (самообновлению) и продукции новых, себе подобных, КСК.
По способности к самоподдержанию мультипотентные кл оно генные клетки подразделяется на три популяции (Morrison a. Weissman, 1994; Chung a. Johnson, 1995; Randall a. Weissman, 1998; Weissman, 2000; Park et al., 2002). На протяжении жизни функционируют КСК с большим реконструктивным потенциалом (длительным самоподдержанием) ("longerm-HSC", LT-KCK). Всего несколько таких клеток обеспечивают полное и продолжительное восстановление гемопоэза (Sprangrude et al., 1995; Jones et al., 1996; Yang et al., 2002). КСК с небольшим реконструктивным потенциалом поддерживают кроветворение не более 6-12 недель ("shorterm-HSC", ST-KCK). Наконец, мультипотентные (родоначальные) клетки-предшественники не способны к самоподдержанию и восстанавливают кроветворение на срок до 4 недель ("МП" или зрелые КСК). Часть МП, дифференцирующихся в миелоидном направлении (общие миелоидные предшественники, ОМП), в отличие от первых двух субпопуляций КСК (LT-KCK и ST-KCK), способны формировать кроветворные колонии-клоны в селезенке облученных мышей-реципиентов и, таким образом, поддаются визуальному количественному учету (Till, McCulloch,196I).
Содержание КСК в кроветворных тканях крайне мало. В основном кроветворном органе млекопитающих - костном мозге — они составляют около 0,005 % от общего числа ядерных клеток (Jones et al., 1996; Sharkis et al., 1997). Идентификация столь малочисленной популяции КСК наряду с отсутствием специфических синтезов не возможна обычными цитохимическими и радиоавтографическими методами, требует специальных приемов обогащения, мечения и выделения. Принадлежность выделенных из ткани клеток к категории стволовых определяют с помощью функциональных критериев, позволяющих оценить потенции клеток к самоподдержанию и дифференцировке: in vivo - путем трансплантации реципиентам с генетически дефектным или разрушенным облучением гемопоэзом и in vitro - по способности поддерживать гемопоэз и отвечать пролиферацией на несколько ростовых факторов.
Экспериментальная гематология - чрезвычайно быстро развивающаяся область исследований. Данный обзор литературы посвящен лишь некоторым аспектам организациикроветворного дифферона, фенотипическим и функциональным характеристикам стволовых и родоначальных клеток кроветворного и стромального рядов дифференцировки, регуляторному взаимодействию мезенхимных и кроветворных клеток, а также происхождению кроветворных стволовых клеток в индивидуальном развитии.
Для КСК характерен относительно низкий уровень экспрессии Thy-1.1 антигена, практически полное отсутствие специфических маркеров клеточной дифференцировки (Lin) и высокий уровень экспрессии антигена стволовых клеток (Sca-1) (Sprangrude et al., 1988; Morrison, Weissman, 1994), а также антигенов главного комплекса гистосовместимо-сти Н-2К и антигена АА4.1 (Szilvassy, Cory, 1993). Окрашивание таких клеток витальным митохондриальным красителем родамином 123 (Rh-123) позволяет выявить две субпопуляции КСК - с ограниченным (Rh-I23hlgh) и неограниченным (Rh-123 или Rh-123") репо-пуляционным потенциалом (Bertoncello et al., 1985; Sprangrude, Johnson, 1990; Li, Johnson, 1995). Слабое окрашивание обеспечивающих длительную репопуляцию облученного костного мозга LT-KCK связано, как с низким содержанием в них митохондрий, так и с множественной лекарственной устойчивостью («multidrug resistance»). Ее обеспечивают гены, кодирующие энергетически зависимые белки клеточной мембраны (например, Р-гликопротеин), работающие как насос и выводящие краситель за пределы клетки (Zijlmans et al., 1995; Fibbe et al., 1997; Kim et al., 1998).Антиген клеточной поверхности CD34 был первым идентифицирован как кроветворный маркер на клетках линии миелолейкоза человека (Koeffler et al., 1980), и с тех пор широко используется для идентификации КСК. Он обнаружен также на КСК мыши (Morel et al., 1996). Разделение клеток с характеристиками поверхностных антигенов КСК (с-kit+Sca-1+Lin-) на две субпопуляции по степени выраженности CD34 (CD34+ и CD34-) и введение отдельных клеток облученным животным показало, что CD34+ клетки ответственны за непродолжительное, но ранее восстановление кроветворения, тогда как CD34-клетки мультипотентны и обеспечивают длительную репопуляцию (Osawa et al., 1996). Чистота субпопуляции CD34- была проверена в полимеразной цепной реакции (PCR), которая не выявила экспрессию мРНК CD34. Таким образом, было получено экспериментальное доказательство существования КСК, лишенных CD34. Thy-llow Sca-1+Lin" LT-KCK костного мозга также гетерогенны по содержанию CD34, и около половины клеток не не сет этого маркера (Morel et al., 1998). Среди клеток, выявляемых как Lin-, CD34- приблизительно в 100 раз меньше, чем CD34+ (Donnelly et al., 1999). Эти две группы авторов, в отличие от Osawa с соавторами, показали, что среди LT-KCK есть как CD34-, так и CD34+ клетки, причем часть CD34+ несет линиеспецифичные антигены Мас-1 и CD4 (Ishida et al., 2002). Таким образом, возможно, CD34 не является безусловным маркером КСК. Так, в ксеногенной ситуации была показана обратимость экспрессии CD34 в клетках человека (Dao et al., 2003). Через 8-12 месяцев после трансплантации высоко очищенных CD34+/CD38- кроветворных клеток костного мозга человека мышам с иммунодефицитом beige/nude/xid (bnx) в костном мозге реципиентов были идентифицированы клетки человека фенотипа CD45+, лишенные белка и мРНК CD34. Эти клетки были способны к длительному поддержанию in vitro и при вторичной трансплантации мышам с иммунодефицитом (bnx или NOD/SCID) давали потомство CD34+ КСК. При культивировании in vitro в присутствии инетрлейкина-11 и фактора стволовых клеток (ФСК) CD34- клетки мыши, которым предварительно вводили 5-фторурацил (5-ФУ), также давали CD34+ клетки (Sato et al, 1999). Весьма вероятно, что CD34+ клетки можно рассматривать как активную форму КСК, возникающих после воздействия 5-ФУ или цитокинов (Ogawa et al., 2001; Guo et al., 2003). По данным Zhao и соавторов КСК фенотипа Lin" Sca+kit+CD38+CD34" удовлетворяют критериям наиболее потентных LT-KCK (Zhao et al., 2000). Они составляют около 0,0022% клеток костного мозга, способны к длительной и краткосрочной репопуляции и восстанавливают кроветворение при серийных трансплантациях. Однако быстрая пролиферация CD38+CD34" КСК после трансплантации требовала участия других категорий КСК с фенотипом Lin"Sca+kit+CD38 CD34+. Недавно описан новый тип КСК, происходящих из высоко очищенных мобилизованных в периферическую кровь CD133+ клеток человека, которые культивировали в присутствии РкЗ/Р1к2-лиганда и интерлейкина-6 (Kuci et al., 2003). Эти клетки обладают адгезивными способностями и экспрессируют ряд молекул адгезии, но не имеют маркеров КСК, эндотелиальных, мезен-химньгх и дендритных клеток, а также стромальных фибробластов. Спонтанно или после стимуляции фактором роста стволовых клеток (ФСК) адгезивные клетки дают рост транс-плантабельным, неадгезивным CD133+CD34- стволовым клеткам, не образующим кроветворных колоний in vitro, но более эффективно (длительно) восстанавливающих миелоид-ное и лимфоидное кроветворение у NOD/SCID мышей по сравнению с CD34+ клетками.
Таким образом, отсутствие экспрессии CD34 характеризует, по-видимому, наиболее молодые кроветворные клетки с более широкими потенциями, нежели КСК. Показано, что CD34- клетки могут генерировать, помимо кроветворных, мезенхимные клетки, такиекак остеобласты, хондро-, адипо- и миелоциты (Huss, 2000 b).По степени связывания родамина-123, наличию антигенов Lin, Ly6A (Sca-1) и рецепторов тирозинкиназы c-kit выделяются три субпопуляции кроветворных клеток (Li а. Johnson, 1996). Клетки, способные к длительному самоподдержанию in vivo, были Rhl23lowLin"Ly6A+; содержание их во фракции превышало таковое в костном мозге в 2000 раз. Клетки фенотипа Rhl23hlghLin"Ly6A+ были отнесены к категории «зрелых» КСК, неспособных к длительной репопуляции, но в высокой степени обогащенных колониеобра-зующими клетками (КОЕ-С-12). Клетки Lin", не содержащие Ly6A и ярко окрашенные родамином, представляли категорию коммитированных клеток-предшественников, поскольку in vitro вступали в пролиферацию в присутствии одного цитокина (Г-КСФ или ГМ-КСФ). Все три субпопуляции клеток имели на клеточной поверхности рецептор тирозинкиназы c-kit. Наряду с Sca-1 антигеном, наличие c-kit характеризовало КСК со способностью к длительной репопуляции (LT-KCK), которые при введении в очень низких дозах (5-100 клеток/жив) излечивали летально облученного реципиента и восстанавливали мие-лоидный и лимфоидный ростки (Osawa et al., 1996). Среди клеток костного мозга, устойчивых к 5-фторурацилу, обладающих низкой плотностью и антигенными характеристиками Lm CD71"class lhlgh, были обнаружены КСК с разной степенью экспрессии c-kit (Doi et al., 1997). Клетки c-kitlow экспрессируют c-kit м-РНК и рецептор, в то время как c-kit Iow слабо экспрессируют м-РНК и не имеют рецептора на клеточной поверхности. В серийных трансплантациях была установлена принадлежность c-kit low клеток к КСК с длительной репопуляционной способностью, восстанавливающих все типы кроветворной диффе-ренцировки у вторичных и третичных реципиентов, тогда как репопуляционный потенциал c-kitlow был ограничен. Таким образом, Lin"CD7rH-2hl8hc-kit low полностью удовлетворяют критерию плюрипотентных КСК, обладая способностью к кроветворной дифферен-цировке во всех направлениях и самоподцержанием. Randall и Wiessman (1998) также идентифицировали популяцию клеток костного мозга, которая по многим антигенным характеристикам (положению в цикле, слабому окрашиванию родамином, устойчивости к 5-фторурацил) была сходна с КСК, но не восстанавливала кроветворения у облученных реципиентов, не образовывала кроветворных колоний in vivo и не отвечала на ростовые факторы in vitro. Единственным фенотипическим отличием этих клеток от Lin-Sca-1+Thy-1.1 low КСК было отсутствие рецептора c-kit. На этом основании предположили, что эта загадочная популяция клеток может представлять стареющие КСК, которые не функционируют и накапливаются с возрастом. Хотя, по данным этих авторов, число c-kit клеток увеличивается у мышей в течение первых 20 недель жизни, трудно себе представить, что КСК начинают утрачивать функциональную активность в раннем онтогенезе.
Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов
Цитотоксические агенты служат важным инструментом анализа КСК. Избирательно убивая пролиферирующие клетки, цитотоксические препараты повышают содержание в исследуемой клеточной взвеси покоящихся КСК, что применяется для дальнейшего фе-нотипического и функционального анализа более однородной популяции КСК (Dunn, Constable, 1973; Millard, et al, 1973; Doi et al., 1997; Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Randall, Weissman, 1998; Yang et al., 2002). Кроме того, цитотоксические препараты позволяют проводить дифференциальный анализ клеточных популяций по уровню пролифе ративной активности и степени дифференцировки (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984).
Наиболее широко в исследовании клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости используются 5-фторурацил (5-ФУ) и оксимочевина (ОМ). Будучи резистентными к 5-ФУ и ОМ, КСК, однако, после их воздействия вступают в пролиферацию, поскольку делящиеся и убитые этими препаратами более зрелые клетки нуждаются в замене. Ускорение пролиферации сопровождается повышением чувствительности КСК к цито-токсическим препаратам. Скорость вступления КСК в цикл может быть определена при повторной инъекции 5-ФУ или ОМ или при введении высоких доз 3Н-тимидина, избирательно убивающих клетки в S-фазе.5-фторурацил (5-ФУ) - циклоспецифический агент, действующий на клетки на протяжении всего цикла. 5-ФУ подавляет синтез ДНК, подавляя тимидилатсинтетазу. Недостаток тимидина индуцирует разрывы цепи ДНК и ведет к гибели клеток (Santi et al., 1974; Shohei et al., 1985; Papamichael, 2000). Таким образом, 5-ФУ проявляет себя, как радиомиметик. Однократное введение 5-ФУ, несмотря на значительное снижение концентрации КСК, не оказывает, по-видимому, непосредственного токсического действия на выжившие КСК, поскольку в конкурентной репопуляции не выявлено различий в числе эритроидных и лимфоидных клеток, образованными КСК интактных доноров и доноров, которым вводили 5-ФУ (Lemer, Harrison, 1990). При репопуляции, вызванной сублетальным облучением реципиентов и исследованной в те же сроки (90 суток), также не было найдено различий между клетками, полученными от интактных и обработанных 5-ФУ доноров. Оксимочевина (ОМ) относится к классу фазоспецифических химеотерапевтических агентов, избирательно убивает клетки в фазе синтеза ДНК (Sinclair, 1967; Phillips et al., 1967) и блокирует переход клеток из Gi в чувствительную к этому агенту S-фазу (Sinclair, 1967). Период полужизни ОМ в сыворотке крови после внутрибрюшинного введения составляет 13-48 минут (Fabricius, Rajewsky, 1971; Hodgson et al., 1975), а концентрация ОМ, влияющая на КОЕ-С, уменьшается до неэффективного уровня через 3-4 часа (Hodgson et al., 1975). Таким образом, клетки, убитые после одной инъекции ОМ, представляют долю клеток, находящихся в S-фазе в момент введения препарата. Наряду с 3Н-тимидином, ОМ использует для определения в популяции числа клеток в цикле в данный момент времени, а также для определения продолжительности клеточного цикла (Vassort et al., 1971; Hodgson et al., 1975; Necas, Hauser, 1982; Lord, Woolford, 1993).
После введения 5-ФУ доля LT-KCK (Lin"Sca+Thy-l.llowc-kit+-ioieTOK) в S/G2/M прогрессивно нарастает уже в первые сутки и достигает максимума (50%) к 5 суткам (Randall, Wiessman, 1997). По данным оксимочевинового самоубийства большинство LT-KCK так же вступает в пролиферацию между 3-5 сутками после введения препарата, и только незначительная их доля была в S-периоде в более ранние и поздние сроки (Harrison, Lerner, 1991; D Hondt et al., 2002). Сходное изменение пролиферативной активности было отмечено и в популяции тестируемых in vitro колониеобразующих клеток с высоким пролифе-ративным потенциалом (ВПП-КОК), большинство из которых, как показывает Н-тимидиновое самоубийство, вступают в цикл на 6-8 сутки (D Hondt et al., 2001).
Вступившие в пролиферацию после введения 5-ФУ КСК характеризуются пониженной репопуляционной способностью, что было показано в длительной конкурентной репопуляции клеток костного мозга, маркированных по гемоглобину и глицерофосфат-изомеразе или Y-хромосоме (Harrison, Lerner, 1991; Stewart et al., 1993; D Hondt et al., 2002). Этот показатель возвращался к контрольному уровню к 35 дню после введения 5-0 y(Ramshaw et al., 1995).
Сходная кинетика вступления c-kit+Thy-l.lIowLin"/IowSca-l+-ioieTOK (KTLS) в цикл наблюдается и при непрерывном введении ОМ. Исследование пролиферативного статуса KTLS, окрашенных Hoechst oM, выявило увеличение в костном мозге, как общего числа KTLS-клеток, так и их доли в S-фазе (Uchida et al., 1997). Наиболее активная пролиферация наблюдается через 3-е суток, по сравнению с 1 и 5 сутками. Несмотря на длительное введение ОМ, KTLS-клетки сохраняют свою биологическую активность (репопуляцион-ную способность). Субпопуляции Go/Gj- и S/G2/M-KTLS-ioieTOK, разделенные по степени окрашивания родамином-123, эффективно восстанавливают все линии кроветворной дифференцировки в организме облученных реципиентов. Однако LT-KCK содержатся в большем количестве во фракции GQ/GI Rhl23Iow , чем во фракции S/G2/M Rhl23m,d -клеток.
Мультипотентные (родоначальные) кроветворные клетки реагируют на однократное введение ОМ синхронным вступлением в пролиферативный цикл: повторное введение ОМ показывает, что уже через 9-10 часов после первого введения препарата в S-фазе находится около 80% КОЕ-С (Necas, Neuwirt, 1977; Necas, Hauser, 1982). Однако чувствительность КОЕ-С к ОМ меняется по мере прохождения через S-фазу. Она постепенно уменьшается до минимума в средней и снова увеличивается в поздней S-фазе, что может приводить к недооценке доли клеток в фазе синтеза ДНК, определяемых с помощью ОМ. Вступление в пролиферацию инициируется также винбластином, цитозинарабинозидом и циклофосфамидом (Smith et al., 1968; Boggs, Boggs, 1973; Dewys et al., 1970; Dunn, Constable, 1973). Скорость вступления КОЕ-С в S-период после введения цитотоксических препаратов может колебаться от 2-3 суток (Dewys et al., 1970) до 7-9 часов (Hodgson et al., 1975; Necas, Hauser, 1982).Помимо циторедуктивных препаратов быструю (в течение 10-20 минут) стимуляцию пролиферативной активности вызывает сублетальное облучение (Lahiri, van Putten, 1972) и трансплантация облученному реципиенту.Таким образом, совокупность рассмотренных данных свидетельствует о высокой чувствительности кроветворной системы к изменениям стационарного состояния и способности стволовых и родоначальных кроветворных клеток отвечать на утрату клеток-предшественников инициацией пролиферации.
Использование ОМ дало важную информацию о кинетике пролиферации костномозговых КСК после их трансплантации. Введение ОМ реципиенту клеток костного мозга показало, что трансплантированная популяция пролиферирует синхронно: более 50% КСК вступают в цикле через 12 часов после трансплантации, в то время как через 6 или 15 часов практически все клетки были вне цикла (Nilsson et al., 1997). Спустя 6 недель после элиминации пролиферирующих клеток в костном мозге реципиентов значительно уменьшается число кариоцитов и колониеобразующих клеток с высоким пролиферативным потенциалом (КОК-ВПП), аналогов КСК in vitro, а в крови - содержание миелоидных и лим-фоидных клеток-предшественников донорского происхождения. Следует заметить, что эти результаты получены на модели трансплантации маркированных по Y-хромосоме клеток костного мозга необлученному реципиенту, у которого предварительное облучение не являлось фактором, стимулирующим вступление в цикл. Очевидно, однако, что в данной работе охарактеризованы ST-KCK, поскольку репопуляция кроветворной ткани реципиентов была исследована в достаточно ранние сроки после трансплантации, а именно 6 недель.
Напротив, наиболее примитивные LT-KCK, в отличие от ST-KCK, не делятся в течение 48 часов после трансплантации (Landzkron et al., 1999 a, b). Методом проточной элютриации ST- и LT-KCK были разделены и помечены мембранным красителем РКН26. Дополнительным маркером служила Y-хромосома. Присутствие ярко окрашенных клеток из двух фракций было прослежено в ранние сроки после трансплантации в костном мозге и селезенке облученных реципиентов. Оказалось, что в костном мозге значительно больший % РКН+ клеток фракции LT-KCK по сравнению с фракцией ST-KCK сохранял яркость свечения через 48 часов после трансплантации, т.е. эти клетки не делились, и, судя по интенсивности окрашивания пропидиум-йодидом, находились в Go/Gi-фазе. Затем с помощью клеточного сортера РКН+ клетки извлекали из кроветворной ткани и ретранс-плантировали вторичным реципиентам-самкам. Гибридизация in situ выявила донорские клетки, происходящие из фракции ярко окрашенных LT-KCK, в течение всего срока ис
Фенотипическая характеристика КОЕ-С
Стратегия выделения КОЕ-С основана на тех же приемах, что и выделение стволовых кроветворных клеток (см. Глава 1). Традиционные методы повышения содержания в кроветворной ткани КОЕ-С с помощью физиологических воздействий сочетают с последующим центрифугированием в градиенте плотности и обогащением методами проточной флюорометрии и клеточного сортинга. В градиенте плотности бычьего сывороточного альбумина или мегризамина КОЕ-С из костного мозга попадают во фракции низкой плотности (меньше 1,080 г/мл"1) (Nijhof, Wierenga, 1984). Далее клетки коньюгируют с агглютинином зародыша пшеницы (АЗП), митогеном лаконоса, меченными флюоресцеином изотиоционатом (ФИТЦ) антителами или суправитальными красителями (Hoechst 33342, родамином 123). Затем их разделяют по интенсивности флюоресценции и характеристикам светорассеяния (Bains et al., 1983; van Bekkum et al., 1985; Bertoncello et al., 1985; Engh et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Metcalf et al., 1983; Pallavicini et al., 1985; Visser et al., 1984). Комбинация центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности и последующая сортировка с помощью FACS позволяет повысить концентрацию КОЕ-С в получаемых фракциях в 100 и более раз (van Bekkum, et al, 1985; Visser et al., 1984).
Фенотипически КОЕ-С не отличаются от других клоногенных клеток, доступных для анализа в ранние сроки. В частности, КОЕ-С-12 сходны по плавучей плотности, скорости седиментации, адгезии на пластик, связыванию АЗП, экспрессии Н-2К, CD45, АА4.1, термостабильному антигену (HSA), CD71 и Sca-І с мультипотентными колоние-образующими клетками в культуре (КОК), мультипотентными пре-КОК, а также Эр/Мег-КОК и ГМ-КОК. От LT-KCK, однако, КОЕ-С отличаются большей скоростью седиментации, меньшей адгезивностью, большей экспрессией АЗП, более ярким окрашиванием родамином 123 и меньшей экспрессией Sea-1-антигена (Trevisan, Iscove, 1995). По размеру и плотности КОЕ-С занимают промежуточное положение между КОЕ-ГМ и полюрипотент-ными КСК (Jones et al., 1990). КОЕ-С экспрессируют c-kit и при разделении КСК на сортере, в отличие от более примитивных и потентных c-kit КСК, попадают во фракцию с-kit + клеток, обладающих радиопротекцией (Ortiz et al., 1999). При фракционировании костного мозга КОЕ-С, как и КСК, обнаруживаются среди Thy-l.ll0Lin"/l0Sca-l+ клеток (Uchidaetal., 1996).На клеточной мембране КОЕ-С обнаружены Pgp-І и Т-200 антигены, свойственные гранулоцитам и Т-клеткам (Engh et al. ,1983; Зотин, 1985). Для КОЕ-С крысы характерна очень высокая экспрессия Thy-1 (van Bekkum et al., 1983). КОЕ-С мыши также экспрессируют Thy-1 (Berman, Basch, 1985), хотя по некоторым данным и в меньших количествах (Muller-Sieburg et al., 1986). КОЕ-С характеризует высокая плотность антигенов тканевой совместимости (Н-2К), что отличает их от зрелых гранулоцитов и макрофагов (Engh etal, 1983).
Очищенные фракции клеток костного мозга содержат КОЕ-С, образующие как ранние, так и поздние колонии в селезенке. Однако сортировка клеток, связавших АЗП или антитела против Н-2К-антигена, по-видимому, более селективна в отношении КОЕ-С-12, чем КОЕ-С-8 (van Bekkum et al., 1985; Lord, Spooncer, 1986; Visser et al., 1984). Характерно, что аналоги KOE-C in vitro - КОЕ-микс - также значительно концентрируются при выделении, причем содержание клоногенных клеток, образующих 11-дневные колонии, увеличивается в большей степени, чем таковых, образующих 7-дневные колонии. Концентрация КОЕ-ГМ и КОЕ-М также увеличивается при сортировке, но менее значительно, чем КОЕ-С и КОЕ-микс (Lord, Spooncer, 1986).По данным светооптического исследования выделенные клетки относятся к категории неидентифицируемых, бластных клеток. При электронно-микроскопическом анализе обнаружено присутствие морфологически отличных клеток, находящихся, по-видимому, в Go и Gi-периодах (Visser et al., 1984; van Bekkum et al., 1985). Диплоидное содержание ДНК в выделенных на сортере клетках и связывание Hoechst 33342 свидетельствует впользу этого предположения (Visser, Eliason, 1983; van Bekkum et al., 1985). Клетки в Go и Gi отождествляют с КОЕ-С, образующими соответственно ранние и поздние селезеночные колонии (Bains, Visser, 1983; Visser et al., 1984; van Bekkum et al., 1985).
Исследование свойств КОЕ-С костного мозга, выделенных с помощью сортера, показало, что они функционально нормальны и обеспечивают такой же уровень радиопротекции, что и интактные клетки. Доля КОЕ-С, оседающих в селезенке и костном мозге также не отличается и составляет для селезенки 4-9%, для костного мозга около 1% (Visser, Eliason, 1983; Lord, Spooncer, 1986). Время удвоения числа дочерних КОЕ-С в селезенке, определенное между 4 и 11 днями после трансплантации облученному реципиенту, также сходно и составляет 16,5 и 18,6 часов соответственно для интактных и прошедших процедуру обогащения КОЕ-С.С другой стороны, в костном мозге восстановление численности КОЕ-С происходит значительно медленнее, чем в норме (Eliason et al., 1984; Visser, Eliason, 1983). В системе in vitro КОЕ-С, в высокой степени очищенные от стромальных и зрелых кроветворных клеток, хотя и колонизировали подслой, но дифференцировались только в гранулоци-тарно-макрофагальном направлении и формировали в нем очаги кроветворения с ограниченным потенциалом пролиферации, которые вскоре исчезали, и кроветворение, таким образом, прекращалось (Spooncer Е., et al., 1985).
Ухудшение репликации КОЕ-С, скорее всего, связано с удалением при сортировке клеток Т-лимфоцитарной природы, поскольку добавление клеток тимуса во фракцию очищенных КОЕ-С восстанавливало их воспроизведение до нормального уровня (Eliason, 1984; Eliason et al., 1984). На возможность удаления клеток Т-ряда указывает и задержка репопуляции тимуса, отмеченная после введения облученному животному клеточных взвесей с высоким содержанием КОЕ-С (Mulder et al., 1985).Таким образом, обогащенные фракции КОЕ-С в функциональном отношении идентичны КОЕ-С из исходной клеточной суспензии костного мозга. Однако в процессе выделения, по-видимому, утрачиваются вспомогательные клеточные элементы, что нарушает кооперативные клеточные взаимодействия и ухудшает способность КОЕ-С к репликации.
С точки зрения генерационно-возрастной гипотезы КОЕ-С, образующие колонии в более поздние сроки и способные давать вторичные КОЕ-С, представляют более «примитивные», молодые, тогда как КОЕ-С, образующие ранние транзиторные колонии и неспособные к самоподдержанию, - как более «старые», близкие по свойствам к популяцииБОЕ-Э (Rosendaal et al., 1976, 1979; Harris et al., 1984; Magli et al., 1982; Shibagiki et al., 1986; Wright et al., 1985; Wright, Lorimore, 1987).Согласно стохастической модели дифференцировки - популяция КОЕ-С однородна, а выявление колоний в разные сроки связано с неодинаковой вероятностью к самоподдержанию (Blackett et al., 1986). КОЕ-С, характеризующиеся низкой вероятностью самоподдержания, проходят до коммитирования меньшее число делений и, следовательно, образуют кроветворные колонии раньше, чем КОЕ-С, у которых вероятность самоподдержания больше.
Многочисленные данные, однако, свидетельствуют о принадлежности КОЕ-С, ответственных за формирование ранних и поздних селезеночных колоний, к разным субпопуляциям клеток-предшественников, которые изначально присутствуют в кроветворной ткани и отличаются по ряду характеристик: антигенам, числу митохондрий, пролифера-тивной активности, дифференцировочным и репликативным потенциям.
