Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Гипоксический синдром in vivo и in vitro 9
1.1.1. Классификация гипоксических состояний 9
1.1.2. Тканевая гипоксия 16
1.1.3. Клеточная гипоксия 20
1.1.4. Компенсаторно-приспособительные реакции при гипоксии 25
1.2. Регуляция клеточного метаболизма в условиях гипоксии 26
1.2.1. Регулятор кислородного гомеостаза 27
1.2.2. Кислород-зависимая регуляция HIF-1 29
1.2.3. Кислород-независимая регуляция HIF-1 30
1.2.4. Экспрессия HIF-1 в злокачественных опухолях человека 33
1.3. VEGF и его роль в выживаемости клеток в условиях гипоксии 35
1.3.1. Участие VEGF в регуляции ангиогенеза 35
1.3.2. Факторы роста клеток эндотелия сосудов 37
1.3.3. Фактор роста эндотелия сосудов VEGF-A 39
1.3.4. Изоформы фактора роста VEGF-A 41
1.3.5. Рецепторы, взаимодействующие с фактором роста VEGF-A (VEGFR1 и VEGFR2) 43
1.3.6. Сигнальные пути, в которых участвуют рецепторы семейства VEGFR 47
а) Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR1 48
б) Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR2 49
1.4. Современные представления о механизме адаптации опухолевых клеток к гипоксии 52
1.4.1. Регуляция выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии in vivo и in vitro. Сигнальные пути, активируемые в опухолевых клетках в условиях гипоксии и их значение в адаптации клеток к гипоксии 52
1.4.2. Роль стероидных гормонов в регуляции активности гипоксия-зависимых сигнальных путей 55
ГЛАВА II. Материалы и методы 57
2.1. Культивирование клеток 57
2.2. Окраска клеток на морфологию гематоксилин-эозином 57
2.3. Определение скорости роста клеток 59
2.4. Приготовление клеточных экстрактов и SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 59
2.5. Иммуноблоттинг(вестерн-блоттинг) 60
2.6. Транзиторная трансфекция и определение активности гена-репортера 60
2.7. Иммуноцитохимическое определение экспрессии Flk-І в клеточных линиях опухолей 61
2.8. Выделение РНК из культивируемых клеток 63
2.9. Определение экспрессии гена VEGF-R2 и VEGF-A методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (RT-PCR) 64
Список использованных растворов 69
ГЛАВА III. Результаты 70
3.1. Влияние гипоксии на динамику роста культивируемых in vitro клеток аденокарциномы яичника CaOv 70
3.1.1. Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на динамику роста клеток CaOv 70
3.1.2. Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на уровень внутриклеточного VEGF в клетках CaOv 71
3.2. Развитие адаптации клеток CaOv к гипоксии в условиях длительного воздействия на клетки гипоксических факторов.
Морфофункциональные изменения клеток в процессе адаптации к гипоксии 72
3.2.1. Развитие резистентности к гипоксии in vitro 72
3.2.2. Морфофункциональные изменения клеток в процессе адаптации к гипоксии 73
3.3. Анализ экспрессии фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и Р13К-зависимых белков (STAT3) при адаптации клеток CaOv к гипоксии 74
3.3.1. Влияние гипоксии на синтез РІЗКи STAT3 74
3.4. Влияние трансфекции в клетки РІЗК и 8ТАТЗ-содержащих плазмид на чувствительность клеток к гипоксии. Развитие резистентности клеток CaOv к гипоксии в условиях постоянной
активации PI3K и STAT3 под действием дексаметазона. 75
3.4.1. Трансфекция каталитической субъединицы PI3K приводит к увеличению синтеза VEGF и развитию резистентности клеток к гипоксии 75
3.4.2. Трансфекция в клетки CaOv STAT3-содержащей плазмиды приводит к развитию резистентности клеток к гипоксии 77
3.4.3. Влияние дексаметазона на рост клеток CaOv. Получение гормон-резистентной сублинии клеток 78
3.4.4. Влияние дексаметазона на синтез РІЗК в клетках CaOv. Конститутивное повышение уровня РІЗК и STAT3 в гормон-резистентной сублинии клеток 19
3.4.5. Повышенная устойчивость гормон-резистентной сублинии клеток CaOv к гипоксии. Уровень VEGF в гормон-чувствительной и резистентной линиях клеток 80
3.5. Эффект перекрестной резистентности клеток, устойчивых к гипоксии, к действию гормональных цитостатиков. Значение координированной активации РІЗК и STAT3 в развитии перекрестной резистентности клеток CaOv к гипоксии и дексаметазону 81
3.5.1. Роль гипоксии в развитии гормональной резистентности опухолевых клеток 81
3.5.2. Значение координированной активации PI3K и STAT3 в развитии перекрестной резистентности клеток CaOv к гипоксии и дексаметазону. Роль PI3K в регуляции STAT3 83
3.6. Чувствительность клеток CaOv, CaOv/D и CaOv/H к действию апоптотических агентов 84
3.6.1. Чувствительность родительских и резистентных клеток CaOv к УФ облучению и адриамицину 84
3.6.2. Уровень РКВ, p21WAF1 и р27Кір1 в клетках CaOv, CaOv/D и CaOv/H :... 86
3.7. Роль VEGF-A в аутокринной регуляции роста и выживаемости клеток CaOv в условиях гипоксии 87
3.7.1. Продукция VEGF-A и уровень VEGFR2 в клетках CaOv 87
3.7.2. Роль VEGF-A в регуляции пролиферации клеток CaOv 91
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 93
Заключение 100
Выводы 103
Список использованной литературы
- Классификация гипоксических состояний
- Регуляция выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии in vivo и in vitro. Сигнальные пути, активируемые в опухолевых клетках в условиях гипоксии и их значение в адаптации клеток к гипоксии
- Приготовление клеточных экстрактов и SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
- Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на уровень внутриклеточного VEGF в клетках CaOv
Введение к работе
Как известно, опухолевая трансформация зачастую сопровождается повышением устойчивости клеток к разного рода стрессорным и токсическим воздействиям, в том числе и к гипоксии. Одной из основных проблем в исследовании ответа клеток на гипоксию является установление биохимических путей, ответственных за активацию защитных механизмов опухолевой клетки.
Ключевое значение в регуляции защитных механизмов опухолевой клетки имеют сигнальные пути, контролируемые фосфатидилинозитол-3-киназой (phosphatidylinositol-3kinase, PI3K) - ферментом, фосфорилирующим фосфатидилинозитол (Ptdlns) в 3-ОН положении инозитольного кольца. Установлено, что PI3K играет важную роль в регуляции роста и выживаемости опухолевых клеток, во многом определяя их устойчивость к действию повреждающих факторов. Отдельным вопросом является участие PI3K в ответе опухолевых клеток на гипоксию. Известно, что к ранним проявлениям реакции опухолевых клеток на гипоксию относится активация гипоксия-индуцируемого фактора 1 (hipoxia inducible factor-1, HIF-1), регулирующего экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (vascular edothelial growth factor, VEGF) и некоторых других генов, ответственных за выживание опухоли в условиях гипоксии. Сравнительно недавно было обнаружено, что в активации HIF-1 и VEGF могут принимать участие PI3K и такие эффекторы PI3K как протеинкиназа В (РКВ), обладающая выраженной антиапоптотической активностью. Но во многом схема сигнальных путей инициируемых PI3K и РКВ, до конца не исследована, как остается неясной и роль PI3K-зависимого сигнального пути в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии. Каковы те биохимические механизмы, которые определяют уровень чувствительности опухолевых клеток к гипоксии и
способность клеток адаптироваться к условиям гипоксии - на решение этих вопросов направлена данная работа.
Мы предполагаем, что в условиях длительного воздействия гипоксии на опухолевые клетки и цитотоксических соединений, а именно: в процессе медикаментозной терапии, постоянная активация PI3K и РБК-зависимых транскрипционных факторов может приводить к существенной перестройке внутриклеточной сигнальной сети. В свою очередь это может приводить к конститутивной активации РВК-сигнального пути и увеличению выживаемости клеток при действии как токсических, так и гипоксических факторов.
Цель работы:
Целью работы является исследование механизма адаптации клеток злокачественных опухолей к гипоксии и изучение внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих выживаемость опухолевых клеток при действии гипоксических факторов.
Задачи исследования:
Исследовать влияние гипоксии на динамику роста культивируемых in vitro клеток карциномы яичника линии CaOv и уровень экспрессии VEGF-A.
Исследовать возможный механизм адаптации клеток к гипоксии в условиях длительного воздействия на клетки гипоксических факторов; изучить изменение морфофункционального состояния клеток в процессе их адаптации к гипоксии.
Исследовать влияние гипоксии на синтез PI3K и Р13К-зависимых сигнальных белков в клетках CaOv; провести сравнительный анализ
основных анти-апоптотических путей в исходной популяции клеток и клетках, адаптированных к действию гипоксии.
Провести сравнительный анализ чувствительности родительских клеток и клеток, резистентных к гипоксии, к действию цитостатических и апоптотических соединений.
Исследовать уровень VEGF-A и рецептора VEGF в . клетках, чувствительных и резистентных к гипоксии. Изучить значение VEGF-сигнального пути в аутокринной регуляции роста и выживаемости клеток CaOv.
Научная новизна работы.
Известно, что к ранним проявлениям реакции злокачественных опухолей на гипоксию относится активация гипоксия-индуцируемого фактора 1, регулирующего экспрессию фактора роста эндотелия сосудов и некоторых других генов, ответственных за выживание опухоли в условиях гипоксии. Установлено, что в активации HIF-1 и VEGF могут принимать участие PI3K и ферменты РІЗК-зависимого сигнального пути, в частности -протеинкиназа В, однако их значение в регуляции ответа опухолей на гипоксию остается неясным. В настоящей работе впервые исследовалась роль ферментов фосфатидилинозитольного сигнального пути - PI3K, РКВ, STAT-3 в регуляции ответа клеток на гипоксию и их значение в развитии резистентности опухолевых клеток к гипоксии. В предварительных исследованиях на модели клеток карциномы яичника, отличающихся по чувствительности к гипоксии, нами было продемонстрировано, что активация РІЗК-зависимого сигнального пути может являться одним из факторов, обеспечивающих адаптацию опухолевых клеток к гипоксии in vitro.
Научно-практіеаШ :ШЧШЗШ?.ых сокращений
Исследования носят экспериментальный характер и направлены на изучение природы биохимических путей, поддерживающих рост злокачественных опухолей в условиях гипоксии. Представленные данные демонстрируют возможность адаптации культивируемых in vitro опухолевых клеток к гипоксии, развивающейся на фоне координированной активации PI3K и STAT3, и повышенной продукции клетками VEGF. При этом адаптация клеток к гипоксии не сопровождается увеличением устойчивости опухолевых клеток к действию апоптотических факторов. Взятые вместе, полученные результаты могут послужить основой для развития и совершенствования методов адьювантной терапии опухолей, в том числе комбинированной терапии с использованием антиангиогенных и химиопрепаратов.
Классификация гипоксических состояний
Гипоксия — широко распространенное явление, возникающее как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате разных патологических состояний, связанных с нарушением функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови. В конечном счете во всех случаях происходит снижение доставки кислорода к тканям до уровня, недостаточного для поддержания функции метаболизма и структуры клетки. Это определяет актуальность проблемы в целом и ее значимость для практической и теоретической медицины.
Классификация и механизмы развития гипоксических состояний В зависимости от причин возникновения и механизмов развития выделяются следующие семь типов гипоксии: Экзогенная; респраторная; циркуляторная; гемическая; первично-тканевая; гипоксия нагрузки; гипоксия смешанной этиологии.
Проявления гипоксии существенно зависят от индивидуальной реактивности организма, степени, скорости развития и продолжительности гипоксического состояния, а также от его этиологии. Экзогенная гипоксия возникает вследствие уменьшения содержания кислорода во вдыхаемом воздухе. Выделяют две формы экзогенной гипоксии: нормобарическую и гипобарическую. Нормобарическая гипоксия возникает в тех случаях, когда при нормальном атмрсферном давлении содержание кислорода во вдыхаемом воздухе падает. Подобная ситуация может возникать при длительном пребывании в невентилируемых пространствах малого объема, при работе в колодцах, шахтах. Уменьшение содержания кислорода во вдыхаемом воздухе ведет к недостаточному насыщению гемоглобина кислородом, артериальная гипоксемия часто усугубляется гиперкапнией.
Гипобарическая гипоксия развивается при снижении атмосферного давления. Наиболее часто она наблюдается во время высокогорных восхождений. Ведущим патогенетическим фактором ее возникновения также является гипоксемия, но в отличие от нормобарической гипоксии дополнительным отрицательным фактором служит гипокапния. Гипокапния и газовый алкалоз формируются за счет хеморефлекторной, компенсаторной гипервентиляции легких, избыточного выведения углекислого газа. Снижению парциального напряжения углекислого газа в крови легочных капилляров частично препятствует эффект Халдейна: снижение парциального давления кислорода в альвеолярном воздухе уменьшает интенсивность выведения СО2. однако наиболее мощные контуры регуляции связаны с влиянием СОг на дыхательный центр продолговатого мозга.
Известно, что СО2 легко диффундирует через гематоэнцефалический барьер и, попадая в ликвор, образует угольную кислоту, которая диссоциирует на Ґ" и НСОз" . Локальное содержание количества протонов воспринимается хеморецепторами вентральной поверхности продолговатого мозга и в конечном итоге влияет на деятельность дыхательного центра. Увеличение содержания СОг в крови и соответственно снижение рН цереброспинальной жидкости стимулирует дыхание; гипокапния и уменьшение содержания протонов в цереброспинальной жидкости, напротив, угнетают дыхательный центр. Однако при гипоксемии резко повышается чувствительность дыхательного центра к рСОг в крови, поэтому при подъеме в горы гипервентиляция сохраняется даже в случае значительного снижения содержания С02 в крови.
Респираторная гипоксия возникает вследствие нарушения функций внешнего дыхания. Она формируется при недостаточности альвеолярной вентиляции, нарушениях диффузионой способности легких, изменениях вентилляционно-перфузионных отношений.
Альвеолярная гиповентиляция наблюдается при рестриктивных и обструктивньтх формах нарушения дыхания, центральных расстройствах дыхательного ритма. Рестриктивные заболевания легких сопряжены с ограничением их подвижности, способности расправляться при вдохе и могут возникать при врожденных и приобретенных аномалиях строения грудной клетки, миодистрофиях и воспалительных процессах в дыхательных мышцах, нарушениях нервно-мышечной передачи различного генеза.
Нейрогенные миопатии могут быть связаны с дегенерацией мотонейронов (боковой амиотрофический склероз), их вирусной инфекцией и воспалением (полиомиелит), токсикозом (столбняк, ботулизм). При перечисленных заболеваниях поражается широкий спектр периферических мотонейронов, включая иннервирующие наружные межреберные мышцы и диафрагму. Структурно-функциональные нарушения именно этих мотонейронов ограничивают расширение грудной клетки при вдохе, давление в плевральной полости становится менее отрицательным и в альвеолы поступает меньше воздуха. Рестриктивные расстройства дыхания и респираторная гипоксия возникают при первичном и травматическом пневмотораксе, ожирении. При ожирении податливость грудной клетки, жизненная емкость легких и резервный объем выдоха уменьшаются , альвеолярная гиповентиляция ведет к тяжелой гипоксемии, полицитемии и легочной гипертензии.
Регуляция выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии in vivo и in vitro. Сигнальные пути, активируемые в опухолевых клетках в условиях гипоксии и их значение в адаптации клеток к гипоксии
Показано также, что в клетках HUVEC VEGFR2 был конститутивно связан с р85 субъединицей PI3K и эта взаимосвязь не зависела от стимуляции VEGF-A [Thakker G.D. et al, 1999]. РІЗК представляет собой гетеродимер, состоящий из адапторной субъединицы 85 кДа (р85) и каталитической субъединицы ПО кДа (рПО). Субъединица р85 содержит два 8Н2-домена, связывающиеся с фосфорилированными по тирозину рецепторами, а также БНЗ-домен. Область, расположенная между двумя 8Н2-доменами р85, ответственна за связывание с субъединицей рПО, необходимое для проявления ее каталитической активности.
Стимуляция клеток HUVEC фактором роста VEGF-A приводила к фосфорилированию субъединицы р85, повышению активности РІЗК и МАР-киназы с последующей активацией c-fos и стимуляцией перехода клеток в S-фазу. Все эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие рецептора VEGFR2 с РІЗК вносит важный вклад в регуляцию Ras-MAP-киназного сигнального пути. Отдельным вопросом является участие РІЗК в ответе опухолевых клеток на гипоксию. Известно, что к ранним проявлениям реакции опухолевых клеток на гипоксию относится активация гипоксии-индуцируемого фактора 1 (hypoxia incible factor-1, HIF-1), регулирующего экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) и некоторых других генов, ответственных за выживание опухоли в условиях гипоксии [Klippel A.at al, 1997; Franke T.F.at al, 1997]. Сравнительно недавно было обнаружено, что в активации HIF-1 и VEGF могут принимать участие РІЗК и такие эффекторы РІЗК как протеинкиназа В [Alessi D.at al, 1997; Vanhaesebroeck В. at al, 2000].
Но во многом схема сигнальных путей, инициируемых РІЗК и РКВ, до конца не исследована, как остается неясной и роль РІЗК-зависимого сигнального пути в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии. Помимо стимуляции пролиферации и дифференцировки клеток эндотелия, фактор роста VEGF-A в условиях in vivo индуцирует также повышение проницаемости сосудов. Было показано, что в реализации этого эффекта играют важную роль некоторые киназы семейства Src (SFK) [Eliceiri В.Р. et al, 1999]. VEGF-A не повышал проницаемость сосудов у гомозиготных мышей с поврежденными генами src " и yes 1 , в то время как мыши с поврежденным геном fyri1 оставались чувствительными к этому воздействию. Причем отсутствие белков pp60c"src и pp62c"yes блокировало лишь VEGF-A-зависимую индукцию повышения проницаемости сосудов, так как реакция мышей src на действие аллил-изотиоцианата, вызывающего воспалительную реакцию, не изменилась. Авторы делают вывод о том, что сигнальные пути, регулирующие индукцию повышенной проницаемости сосудов при воспалении и при действии VEGF-A, различны.
Интересно, что ангиогенез у мышей, дефицитных по белкам pp60c"src и pp62c"yes, не нарушен: эти мыши жизнеспособны и у них развивается нормальная капиллярная сеть. Однако, мыши, у которых отсутствует комбинация белков src, yes и fyn, погибают на 9,5 день эмбрионального развития. Эти факты свидетельствуют о том, что в клетках существует механизм, позволяющий компенсировать отсутствие отдельных SFK.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие ростовых факторов семейства VEGF со своими рецепторами приводит к активации таких известных сигнальных путей как PI3K-, PLCy-PKC-, Ras-МАРК- и JNK-зависимые пути, регулирующие размножение и миграцию клеток.
Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные дают возможность выделить рецепторы VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (Flkl/KDR) в отдельную подгруппу семейства РТК на основании сходства их структуры и особенностей функционирования в клетке, обусловленных их преимущественной локализацией на клетках эндотелия сосудов и взаимодействием с ростовыми факторами семейства VEGF. Сигнальные пути, в функционирование которых включены эти рецепторы, контролируют такие жизненно важные для нормальной и опухолевой ткани процессы как возникновение и развитие кровеносной и лимфатической систем. Исследование механизмов, регулирующих активность этих сигнальных путей, может дать возможность стимулировать рост сосудов в тех случаях, когда это необходимо, либо блокировать их развитие при опухолевом росте.
Приготовление клеточных экстрактов и SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
Обнаруженная корреляция между уровнем PI3K и устойчивостью клеток к гипоксии свидетельствовала о том, что активация РІЗК-зависимого сигнального пути может играть важную роль в регуляции выживаемости клеток в условиях гипоксии.
Параллельно исследовали транскрипционный фактор STAT3 (signal transducers and activators of transcription-3), являющийся одним из позитивных регуляторов PI3K. Клетки CaOv и CaOv/H инкубировали в течение 5 сут. Определение экспрессии этого белка проводили методом Вестерн-блоттинга. Анализ уровня экспрессии STAT3 также показал значительное повышение уровня этого белка в клетках CaOv/H по сравнению с родительской культурой (рис. 6). Определение экспрессии STAT3 в клетках чувствительных и резистентных к гипоксии. Клетки CaOv родительской линии (1) и резистентной к гипоксии (2) культивировали в течение 5 суток. Вестерн-блоттинг проводили с использованием антител к STAT3.
Влияние трансфекции в клетки PI3K и STAT3-содержащих плазмид на чувствительность клеток к гипоксии. Развитие резистентности клеток CaOv к гипоксии в условиях постоянной активации PI3K и STAT3 под действием дексаметазона. Трансфекция каталитической субъединицы PI3K приводит к увеличению синтеза VEGF и развитию резистентности клеток к гипоксии.
Для дальнейшего исследования участия РГЗК в развитии реакции клеток на гипоксию была проведена транзиторная трансфекция клеток родительской линии CaOv плазмидой, содержащей ген каталитической pi 10 субъединицы PI3K. Клетки CaOv после трансфекции культивировали в присутствии 200 мкМ СоСЬ в течение пяти суток. Потом клетки снимали с чашек, лизировали, проводили электрофорез белков и перенос на нитроцеллюлозные мембраны. Методом Вестерн-блоттинга проводилось определение количества VEGF в клетках. Определение уровня внутриклеточного VEGF выявило значительное повышение его концентрации в клетках, трансфицированных pi 10-плазмидой (рис. 7).
Клетки после контрольной трансфекции (рНО-) и трансфекции pi 10-содержащей плазмиды (р110+) культивировали без CoCh и вприсутствии 200 мкМ СоСІг в течение 5 суток. Содержание внутриклеточного VEGF определяли методом Вестерн-блоттинга.
Для анализа динамики роста клетки, трансфецированные контрольной или pi 10-содержащей плазмидами культивировали без C0CI2 и в присутствие 200 мкМ CoCL2 в течение пяти суток. Затем определяли количество выживших клеток с использованием МТТ-теста. В трех независимых экспериментах было установлено, что трансфекция рПО-плазмиды заметно увеличивает устойчивость клеток к действию СоС12, что свидетельствует о прямом участии PI3K в регуляции выживания опухолевых клеток в условиях гипоксии (рис. 8).
Клетки, трансфецированные контрольной плазмидой (CaOv/K), и pi 10-содержащей плазмидой (CaOv/pl 10) культивировали без СоС12 и в присутствии 200 мкМ CoCh в течение 5 суток. Количество живых клеток определяли с использованием МТТ-теста. 3.4.2. Трансфекция в клетки CaOv БТАТЗ-содержащей пг""шиды приводит к развитию резистентности клеток к гипоксии.
Мы уже отмечали, что формирование гипоксия-резистентной популяции CaOv в процессе длительного культивирования клеток в присутствии 100 мкМ СоСЬ сопровождается значительным увеличением уровня PI3K, которое сохраняется после отмены действия индуктора. Позитивным регулятором PI3K является STAT3. Какова роль STAT3 в формировании субпопуляции клеток, резистентных к действию гипоксии? Для ответа на этот вопрос была проведена транзиторная трансфекция клеток родительской линии CaOv плазмидой, содержащей ген STAT3. Для анализа динамики роста клетки, трансфецированные контрольной плазмидой и STAT3-содержащей плазмидой, культивировали без СоС12 и в присутствие 200 мкМ СоСЬ в течение трех суток. Количество выживших клеток определяли с использованием МТТ-теста. Было установлено, что трансфекция STAT3 -содержащей плазмиды резко увеличивает устойчивость клеток к действию СоСЬ, что свидетельствует об участии STAT в регуляции выживания опухолевых клеток в условиях гипоксии (рис. 9).
Влияние индуктора гипоксии СоСЬ на уровень внутриклеточного VEGF в клетках CaOv
Прямые доказательства непосредственного участия РІЗК-сигнального пути в регуляции устойчивости клеток к гипоксии были получены при исследовании чувствительности к СоС12 клеток, трансфицированных рПО-плазмидой. Так, оказалось, что трансфекция в клетки родительской линии CaOv плазмиды, кодирующей рПО каталитическую субъединицу PI3K приводит к резкому усилению синтеза VEGF и повышению устойчивости клеток к гипоксии. К аналогичному эффекту приводит трансфекция в клетки плазмиды, содержащей кДНК STAT3. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что активация РІЗК-зависимого сигнального пути может являться одним из факторов, обеспечивающих низкую чувствительность опухолевых клеток к гипоксии.
Учитывая конститутивную активацию STAT3 и РІЗК, обнаруженные в гипоксия-резистентных клетках, мы предположили, что такие клетки возможно будут менее чувствительны к действию экзогенных регуляторов пролиферации, в том числе и гормональной природы. Действительно, эксперименты, проведенные на клетках CaOv, исходно чувствительных к рост-стимулирующему действию 17(3-эстрадиола и рост-ингибирующему действию дексаметазона, показали, что гипоксия-резистентная сублиния CaOv/H практически полностью теряет чувствительность к 17(3-эстрадиолу. Также в этих клетках снижена чувствительность и к дексаметазону. Параллельно из родительских клеток CaOv путем длительного культивирования с дексаметазоном была получена сублиния клеток, CaOv/D, устойчивая к анти-пролиферативному действию дексаметазона. Как и в случае гипоксия-резистентной сублинии, клетки, резистентные к дексаметазону, характеризовались высоким уровнем экспрессии STAT3 и РБК. Было установлено, что гормон-резистентные клетки CaOv/D обладают повышенной устойчивостью к гипоксии, индуцированной СоС12, причем уровень индукции PI3K и VEGF в присутствии СоСЬ существенно выше в резистентных-клетках по сравнению с клетками родительской линии.
Полученные результаты свидетельствуют, что в основе снижения гормональной зависимости опухолевых клеток могут лежать комплексные изменения антиапоптотических и митогенных сигнальных путей, в той или иной степени ассоциированных с РБК, что и обеспечивает автономный, гормон-независимый рост опухолевых клеток. Тот факт, что длительное культивирование в условиях гипоксии приводит к снижению гормональной зависимости клеток, указывает на то, что развитие гормональной резистентности опухолей не обязательно связано с продолжительным воздействием на опухоль гормональных препаратов, но может являться результатом адаптации клеток к действию иных повреждающих факторов, в нашем случае - гипоксии.
Накопление РБК в клетках, резистентных к повреждающим агентам, в нашем случае к гормональным цитостатикам, вероятно, во многом определяет устойчивость таких клеток к гипоксии. Увеличение содержания РБК в гормон-резистентных клетках CaOv носит необратимый характер и сохраняется в течение длительного времени и после прекращения действия гормона. Мы предположили, что в условиях длительного воздействия на клетки гормонов-цитостатиков постоянная активация РБК и РБК-зависимых транскрипционных факторов может приводить к существенной перестройке внутриклеточной сигнальной сети и, в итоге - к конститутивной активации РІЗК-сигнального пути и увеличению выживаемости клеток. Для проверки этой гипотезы в родительской и гормон-резистентной линиях CaOv исследовалась активность транскрипционного фактора STAT3, являющегося одним из позитивных регуляторов PI3K. Представителей семейства STAT относят к белкам с двойной активностью, функционирующим в клетках не только как транскрипционные факторы, но и в качестве собственно сигнальных мессенджеров. Именно в качестве последнего STAT3 участвует в образовании мембрано-связанных комплексов с JAK (Janus protein tyrosine kinase) и регуляторной субъединицей PI3K, приводя в итоге к повышению активности PI3K в клетках [Rosa Santos S.C. et al, 2000; Migone T.S. et al, 1998]. В свою очередь, регуляция активности STAT3 основана на фосфорилировании этого белка по тирозину киназами семейства JAK, и присутствие в комплексе регуляторной субъединицы PI3K вызывает дополнительную активацию STAT3 [Pfeffer L.M. et al, 1997]. Результаты наших экспериметов показали, что длительное культивирование клеток CaOv с дексаметазоном приводит к выраженной стимуляции фосфорилирования по тирозину STAT3, причем в гормон-резистентной сублинии повышенный уровень фосфорилирования STAT3 сохраняется и после прекращения действия гормона.
