Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Влияние низких температур и кадмия на растительный организм 8
1.2. Механизмы адаптации растений к действию низких температур 16
1.3. Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов 27
Глава 2. Объекты и методы исследований 39
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 45
3.1. Реакция растений пшеницы на раздельное и совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия 45
3.1.1. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы 45
3.1.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на холодоустойчивость растений пшеницы 63
3.1.3. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на проницаемость мембран листьев растений пшеницы 66
3.2. Динамика накопления транскриптов генов в листьях пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и сульфата кадмия 71
3.2.1. Гены транскрипционных факторов 71
3.2.2. Гены COR/LEA белков 81
3.2.3. Гены протеолитических ферментов 93
3.3. Роль низкомолекулярных защитных соединений в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и сульфата кадмия 98
3.3.1 Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание непротеиновыхтиолов в листьях пшеницы 98
3.3.2. Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на содержание свободного пролина в листьях пшеницы 110
Заключение 116
Выводы 120
Список литературы 122
- Механизмы адаптации растений к действию низких температур
- Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов
- Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницы
- Гены транскрипционных факторов
Введение к работе
Актуальность. Во многих регионах мира дефицит тепла, обусловленный низкими температурами воздуха и почвы, выступает главным фактором, лимитирующим рост, развитие и продуктивность растений (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Sung et al., 2003; Трунова, 2007; Колупаев, Карпец, 2010; Войников, 2013). В последние годы к неблагоприятным природно-климатическим факторам добавляется возрастающее техногенное воздействие на биосферу, которое обуславливает загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами, в том числе и высокотоксичным для всех живых организмов кадмием (Титов и др., 2007; Лукаткин, Башмаков, 2009). Поэтому сохранение жизнеспособности растений в этих условиях требует мобилизации всех имеющихся у них адаптивных механизмов.
Как показывают исследования, растения обладают целым комплексом адаптационных механизмов, которые реализуются на разных уровнях организации – от молекулярного до организменного, в том числе связанных с индукцией экспрессии большого числа генов и синтеза соответствующих белков (Levitt, 1980; Шакирова, 2001; Чиркова, 2002; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 2006; Ouellet, 2007; Guy et al., 2008; Кошкин, 2010; Theocharis et al., 2012). Некоторые из этих механизмов специфичны в отношении того или иного воздействующего фактора, в то время как другие являются общими (неспецифичными) для разных факторов. Последнее обуславливает способность растений при действии одного неблагоприятного фактора повышать устойчивость к факторам иной природы (явление кросс-адаптации) (Титов и др., 1983; Кузнецов и др., 1990; Gong et al., 2001; Guang, Gong, 2011; Радюкина и др., 2012). Однако, механизмы кросс-адаптации остаются все еще не ясными.
Необходимо отметить, что в большинстве случаев исследователи изучают механизмы адаптации растений к действию одного конкретного неблагоприятного фактора, а работы, посвященные изучению комбинированного (совместного или последовательного) действия факторов разной природы на растения пока единичны (Гармаш, Головко, 2009; Hu et al., 2010; Iqbal, Ashraf, 2010; Grigorova et al., 2011; Al-Issawi et al., 2013). В природных же условиях неблагоприятные факторы действуют на растения, как правило, одновременно, а их ответные реакции на совместное действие факторов, в том числе низких температур и тяжелых металлов, могут заметно отличаться от эффектов, вызываемых действием каждого из них. Однако, работы, направленные на изучение механизмов их совместного действия на растения, в известной нам литературе отсутствуют.
Учитывая это, исследование механизмов адаптации растений (на организменном и клеточном уровне) не только к раздельному, но и совместному действию низкой температуры и тяжелых металлов является весьма актуальным.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании ряда эколого-физиологических механизмов адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить реакцию растений пшеницы на действие низкой температуры, кадмия и их совместное действие по ряду физиолого-биохимических показателей (биометрические показатели, холодоустойчивость, проницаемость мембран).
2. Охарактеризовать динамику накопления транскриптов генов транскрипционных факторов в листьях растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и кадмия.
3. Выявить особенности накопления транскриптов генов, кодирующих COR/LEA белки и протеолитические ферменты, в листьях растений пшеницы при раздельном и совместном действии низкой температуры и кадмия.
4. Оценить роль непротеиновых тиолов (глутатиона и фитохелатинов) в механизмах адаптации растений пшеницы к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.
5. Исследовать роль низкомолекулярного осмопротектора и антиоксиданта – свободного пролина – в процессах адаптации растений к раздельному и совместному действию низкой температуры и кадмия.
Научная новизна работы. Впервые показано, что повышение холодоустойчивости растений пшеницы происходит не только при низкой закаливающей температуре, но и под влиянием кадмия, хотя и в меньшей степени. Впервые обнаружено, что накопление транскриптов генов транскрипционных факторов (CBF1, DREB1, MYB80), АТФ-зависимых протеолитических ферментов (Lon1, ClpP), LEA белков (WCOR15, WRAB15, WRAB18, WDHN13) происходит как при раздельном, так и совместном действии низкой температуры и кадмия. В отличие от этого, аккумуляция мРНК COR гена WCS120 более характерна для реакции растений пшеницы на воздействие низкой температуры. Впервые полученные данные о повышении содержания низкомолекулярных антиоксидантов (глутатиона и свободного пролина) и фитохелатинов, а также о накоплении транскриптов генов, кодирующих ферменты их синтеза (GS1, WP5CS, PCS1) не только при раздельном, но и совместном действии низкой температуры и кадмия в листьях растений пшеницы, указывают на их участие в механизмах адаптации к действию этих неблагоприятных факторов.
Практическая значимость работы. Полученные данные углубляют и расширяют имеющиеся в настоящее время представления об участии генов и белков транскрипционных факторов, COR/LEA белков, протеиназ, ферментов синтеза пролина, глутатиона и его производных в механизмах адаптации растений к раздельному и совместному действию низких температур и кадмия. Полученные сведения могут быть использованы при организации дальнейших физиолого-биохимических и молекулярно-генетических исследований устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды. Результаты исследований могут быть использованы при чтении ряда спецкурсов для студентов экологических, физиологических, биохимических специальностей. Полученные данные включены в учебное пособие "Устойчивость растений к действию тяжелых металлов и экспрессия генов".
Личный вклад автора в получении научных результатов. Автор лично принимал участие в планировании и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов, а также в написании статей, опубликованных по результатам работы.
Связь работы с научными программами. Исследования проводились с 2011 по 2013 гг. в соответствии с планом НИР ИБ КарНЦ РАН, являясь частью плановой темы "Физиолого-биохимические и молекулярно-генетические механизмы реакции растений на действие неблагоприятных температур и тяжелых металлов" (№ гос. рег. 01201166444), при поддержке грантов РФФИ № 10-04-00650-а и ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг. № соглашений 8050 и 14.21.132.1321.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на VII съезде Общества физиологов растений России "Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий" (Нижний Новгород, 2011); V и VI Российском симпозиумах "Белки и пептиды" (Петрозаводск, 2011; Уфа, 2013); VII-ой международной научной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Белоруссия, Минск, 2011); Всероссийском симпозиуме "Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии" (Москва, 2011); XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов–2012" (Москва, 2012); Междисциплинарной научной конференции " Адаптационные стратегии живых систем" (Украина, Новый Свет, 2012); 3-м Международном симпозиуме "Intracellular Signaling and Bioactive Molecules Design" (Украина, Львов, 2012); II (X) Международной ботанической конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); 17-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2013); Всероссийской научной конференции "Инновационные направления современной физиологии растений" (Москва, 2013); XIII съезде Российского ботанического общества (Тольятти, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 5 статей – в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 352 наименований, в том числе 248 на иностранном языке. Работа изложена на 158 страницах, содержит 23 рисунка и 10 таблиц.
Механизмы адаптации растений к действию низких температур
Низкая температура относится к факторам, ограничивающим распределение и продуктивность растений (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Трунова, 2007; Колупаев, Карпец, 2010). Растения ведут прикрепленный образ жизни и являются пойкилотермными организмами, в связи с чем они не могут активно избегать действие неблагоприятных температур. В ходе эволюции растения приобрели целый комплекс адаптивных реакций, проявляющихся на разных уровнях организации (Кузнецов, 2001), включая усиление экспрессии ряда генов, кодирующих протекторные белки (Sung et al., 2003; Chinnusamy et al., 2006, 2007; Gorsuch et al., 2010; Erikson, Webb, 2011; Heidarvand, Maali-Amiri, 2013), изменение ультраструктуры клеток (Мирославов, 1994; Климов и др., 1997), а также перестройку биохимических реакций (Chen, 1994; Трунова, 2007; Zhu et al., 2007; Shulze et al., 2012), что в целом приводит и к изменениям на организменном уровне.
В настоящее время установлены адаптивные изменения ультраструктуры клеток при низкотемпературном воздействии у морозостойких растений – уменьшение объема вакуоли, разрастание цитоплазмы, увеличение мембранных элементов (Kratsch, Wise, 2000; Трунова, 2007). Хлоропласты адаптированных растений характеризуются большим количеством тилакоидов, отсутствием крахмальных зерен и увеличением пластоглобул (Трунова, 2007). Наблюдается и изменение формы митохондрий, образование гантелевидных, чашевидных, с чем может быть связана высокая степень энергетического обмена (Чиркова, 2002).
При действии низких температур происходят значительные биохимические преобразования. Показано, что у морозостойких растений интенсивность фотосинтеза при околонулевых температурах превышает интенсивность дыхания (Климов и др., 2003; Трунова, 2007), это приводит к накоплению сахаров (Hurry et al., 1995; Gusta, Whsniewski, 2012) и других криопр-текторных соединений, таких как пролин, глицинбетаин, многоатомные спирты (Чиркова, 2002; Smallwood, Bowler, 2002; Schulze et al., 2012). У морозоустойчивых растений усиливается синтез крахмала (Чиркова, 2002). Обнаружено, что большая доля растворимых сахаров локализована в цитозоле, вакуоли и ряде органелл (Koster, Lynch, 1992; Трунова, 2007). Сахара обладают полифункциональным действием в клетке, в частности играют важную осморегуляторную, криопротекторную роль, обладают антифризными свойствами (Трунова, 2007). Сахара участвуют в стабилизации клеточных мембран разных органелл клетки, также как и в передаче низкотемпературного сигнала (Чиркова, 2002; Климов и др., 2008).
При адаптации растений к низким температурам происходит общее повышение мембранных липидов, в частности фосфатидилхолинов (Трунова, 2007). Обнаружено, что содержание фосфолипидов увеличивается по отношению к белкам (Новицкая и др., 2000). Важную роль играет повышение концентрации ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов, что повышает текучесть липидного бислоя (Трунова, 2007).
Как отмечалось ранее, воздействие низкой температуры может приводить к накоплению активных форм кислорода, в ответ на это повышается активность антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксид-дисмутазы) и содержания глутатиона (Кошкин, 2010; Xu et al., 2010; Крес-лавский и др., 2012).
Важную роль в механизмах адаптации растений к действию низких температур играют антифризные белки, которые взаимодействуют с кристалами льда, влияя на их морфологию и размер, а также обладают термальным гистерезисом, благодаря чему температуры замерзания и таяния не совпадают (Трунова, 2007). Наряду с повышением содержания антифризных белков наблюдается накопление дегидринов, аквапоринов и белков холодового ответа (Gilmour et al., 1998; Houde et al., 1992; Choi et al., 1999; Аллагурова и др., 2004; Бужко и др., 2004; Hara, 2010). В частности, наблюдается накопление гидрофильных, осмопротекторных белков – дегидринов, принадлежащих к LEA (Late Embryogenesis Abundant) белкам (Hong-Bo et al., 2005; Колесни-ченко, Войников, 2003; Войников, 2013). Они предотвращают агрегацию белков (Goyal et al., 2005) и препятствуют потере воды клеткой, стабилизируя клеточные мембраны при обезвоживании (Danyluk et al., 1998; Колесниченко, Войников, 2003; Tolleter et al., 2007; Войников, 2013). При действии холода происходит также накопление гидрофильного белка холодового ответа – COR15 (Crosatti et al., 1999; Thomashow, 1999; Takumi et al., 2003; Xin, Browse, 2006; Трунова, 2007), который повышает криостабильность мембран (Колесниченко, Войников, 2003; Трунова, 2007; Кузнецов, Дмитриева, 2013), предотвращая переход из ламеллярной в гексагональную фазу (Колесничен-ко, Войников, 2003; Трунова, 2007).
В настоящее время активно исследуется экспрессия разных групп генов, продукты которых участвуют в адаптации растений к действию низкой температуры. Установлено, что при низких температурах происходит повышение экспрессии генов, кодирующих многие транскрипционные факторы. Транскрипционные факторы играют ключевую роль в сигнальных путях и адаптации растений к действию неблагоприятных факторов среды, за счет наличия специфических ДНК-связывающих доменов они способны регулировать (активировать или подавлять) экспрессию генов (Saleh, Pages, 2003). На основании содержания специфических доменов, факторы транскрипции подразделяются на различные семейства.
Механизмы адаптации растений к действию тяжелых металлов
Тяжелые металлы, по значению для растений подразделяют на необходимые для их жизнедеятельности в незначительных концентрациях, которые становятся токсичными в очень высоких концентрациях (Zn, Cu, Mo и др.), и не участвующие в метаболизме растений, токсичные даже в низких концентрациях (Cd, Pb, Hg и др.) (Титов и др., 2007, Кузнецов, Дмитриева, 2013).
В ответ на действие тяжелых металлов в токсичных для растений концентрациях у них реализуется комплекс адаптивных механизмов на разных уровнях организации – от организменного до молекулярного (Титов и др., 2007). Установлено, что на уровне целого растения проявляется ряд механизмов, направленных на ограничение поступления тяжелых металлов, в том числе задержка их поглощения корнями и транспорта в надземную часть, функционирование барьеров на пути транспорта металлов, а также выведение ионов тяжелых металлов из клеток с участием трихом (Косицин, Алексеева-Попова, 1983; Clemens et al., 2002). В частности, в снижении проникновения тяжелых металлов в растения из почвы важную роль играет выделяемая клетками корня слизь, которая содержит соединения, связывающие ионы токсичных металлов (Marschner, 1995; Manara, 2012). Однако данное ограничение поступления ионов тяжелых металлов не всегда оказывается достаточным и они проникают в клетки растений (Чернобровкина и др., 2012; Вет-чинникова и др., 2013).
Первым барьером на пути поступления ионов тяжелых металлов в клетки корня является клеточная стенка. Предотвращение поступления ионов металлов в растения достигается за счет их иммобилизации в клеточной стенке, торможения транспорта через плазмалемму и выделения в окружающую среду. Иммобилизация тяжелых металлов может достигаться двумя путями: накоплением ионов в свободном пространстве и их связыванием с клеточной стенкой (Феник и др., 1995). Связывание ионов тяжелых металлов с клеточной стенкой корня препятствует их дальнейшему проникновению в цитоплазму (Taylor, 1987; Davies et al., 1991; Серегин, Иванов, 2001). Однако, при высоких концентрациях ионов тяжелого металла может происходить "насыщение" клеточной стенки и она не обеспечивает полного блокирования их поступления (Ernst et al., 1992; Manara, 2012). Следующим барьером на пути их поступления в цитоплазму выступает плазмалемма. Изменение функционирования ионтранспортных систем плазматической мембраны приводит к изменению ионного баланса клетки (Bonaly et al., 1980; Hall, 2002). Предполагается, что транспортные белки плазматической мембраны могут участвовать в механизмах повышения металлоустойчивости, к ним, в частности, относятся АТФазы, NRAMP (natural resistance associated macrophage proteins), ZIP (zinc iron proteins) (Guerinot, 2000; Thomine et al., 2003; Manara, 2012) и др. Важным механизмом повышения устойчивости растений к действию тя-28 желых металлов выступает выведение ионов металлов из клетки (Hartley-Whitaker et al., 2001).
Устойчивость растений к тяжелым металлам достигается за счет ограничения проникновения тяжелых металлов в клетку и запуска внутриклеточных механизмов устойчивости (Чиркова, 2002; Hall, 2002). Внутриклеточные механизмы устойчивости к тяжелым металлам включают механизмы их деток-сикации, а также механизмы, позволяющие клетке функционировать в присутствии тяжелых металлов и механизмы репарации повреждений (Титов и др., 2007). Важным механизмом детоксикации является хелатирование (образование комплексных соединений ионов тяжелых металлов с лигандами) в цитозоле (Rauser, 1999; Clemens et al., 2002; Manara 2012). В качестве лиган-дов – соединений, образующих хелатные комплексы с тяжелыми металлами, могут выступать органические кислоты, аминокислоты, металлотионеины и фитохелатины (Rauser, 1999; Cobbett, 2000; Manara 2012). К органическим кислотам, образующим прочные комплексы с ионами металлов, относятся цитрат, малат и оксалат (Wagner, 1993; Rauser, 1999; Титов и др., 2007). В де-токсикации тяжелых металлов также участвует гистидин (Hall, 2002; Cobbett, 2007) и никотинамид (Mari et al., 2006; Haydon, Cobbett, 2007).
Важную роль в детоксикации тяжелых металлов играют металлотионе-ины – низкомолекулярные металлсвязывающие белки с высоким содержанием цистеина (Robinson et al., 1993; Capdevila et al., 2012; Manara 2012). Они обнаружены у животных, растений и грибов (Kumar et al., 2012; Ryvolova et al., 2012). По распределению цистеиновых остатков и количеству ароматических аминокислот металлотионеины у растений подразделяются на 4 типа (МТ 1–4) (Kumar et al., 2012). Образование их комплексов с металлами осуществляется за счет связывания с сульфгидрильными группами цистеина (Zenk, 1996).
Другими важными хелатирующими агентами являются низкомолекулярные пептиды – фитохелатины (Cobbett, 2000; Серегин, 2001; Ogawa et al., 2009; Pal, Rai, 2010). Наличие тиоловых (SH) групп позволяет фитохелатинам связываться с ионами тяжелых металлов и образовывать в цитозоле хелатные комплексы с молекулярным весом 2,5-3,6 кДа (Cobbett, 2000; Серегин, 2009; Gallego et al, 2012). Образовавшиеся низкомолекулярные комплексы транспортируются в вакуоль с помощью Cd/ГҐ антипортеров (Salt, Wagner, 1993) и АТФ-зависимых АВС-транспортеров тонопласта (Salt, Rauser, 1995), включая НМЛ транспортер, обнаруженный у дрожжей (Prvral et al, 2009). При этом фитохелатины участвуют не только в механизмах детоксикации тяжелых металлов (Clemens et al, 1999; Серегин, 2001; Gallego et al, 2012), но и в гомеостазе металлов, необходимых для нормального протекания физиологических процессов, например, цинка и меди (Thumann et al., 1991).
Синтез фитохелатинов индуцируется многими тяжелыми металлами, в том числе Си, Zn, Ag, Аи, Hg и Pb, но в наибольшей степени Cd (Rauser, 1995; Cobbett, 2000; Pal, Rai, 2010). Фитохелатины, в отличие от металлотионеинов, не являются первичными генными продуктами, а синтезируются из глутатиона при участии фермента фитохелатинсинтазы (у-глутамилцистеинтранспептидазы) (Robinson et al., 1993; Rauser, 1995; Clemens et al, 1999; Cobbett, 2000; Серегин, 2001; Capdevila et al, 2012).
Глутатион также способен сам образовывать комплексы с тяжелыми металлами. Глутатион представляет собой трипептид (-глутамилцистеинилглицин), состоящий из остатков трех аминокислот: ци-стеина, глицина и глутамина (Серегин, 2001; Estrella-Gomez et al., 2012; Gallego et al, 2012; Anjum et al, 2012). Глутатион содержит тиоловые группы, посредством которых он способен связываться с ионами металлов и металлоидов (Серегин, 2001; Anjum et al., 2012). Глутатион обнаружен у всех организмов, включая растения, однако он менее эффективно связывает тяжелые металлы, чем фитохелатины.
Влияние раздельного и совместного действия низкой температуры и сульфата кадмия на биометрические показатели растений пшеницыe
Одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, лимитирующих рост, развитие и продуктивность растений, является низкая температура (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Коровин, 1984; Xin, Browse, 2000; Sung et al., 2003; Войников, 2013). Тяжелые металлы, также как низкая температура и другие экстремальные факторы, могут приводить к торможению роста растений, что рассматривают как их неспецифическую ответную реакцию на изменение внешних условий (Чиркова, 2002; Кошкин, 2010). Нами были изучены закономерности изменения роста пшеницы не только при раздельном, но и совместном действии низкой закаливающей температуры и сульфата кадмия.
Проведенное изучение динамики изменения биометрических показателей растений пшеницы (высота, длина и площадь 1-го листа) при действии ряда пониженных температур (4, 8 и 12С) показало, что чем ниже температура, тем больше замедляются ростовые процессы (табл. 2). Так, например, у растений пшеницы контрольного варианта (при 22С) высота побега за 7 сут опыта увеличилась примерно на 70% по сравнению с исходным уровнем (табл. 3). В отличие от этого, уже в начальный период действия (1 сут) температуры 4С происходило практически полное прекращение роста побега пшеницы, через 2–3 сут начиналось частичное его восстановление, в результате к концу эксперимента (на 7-е сут) высота побега превышала исходный уровень лишь примерно на 20%. При действии температур 8 и 12С также наблюдалось торможение роста проростков пшеницы, однако в меньшей степени, чем при температуре 4С, в результате к концу опыта высота побега увеличивалась по сравнению с исходным уровнем на 25 и 35%, соответственно.
Сходный эффект температур 4, 8 и 12С отмечен и в отношении роста 1-го листа пшеницы. Установлено, что воздействие наиболее низкой температуры (4С) оказывало самое сильное отрицательное влияние на линейные размеры 1-го листа (табл. 2, 3). В этом случае длина листа за 7 сут опыта увеличилась лишь на 24%, в то время как при температуре 22С за такой же промежуток времени – на 47% (табл. 3). Замедление роста 1-го листа наблюдали и при температурах 8 и 12С, однако в меньшей степени, чем при температуре 4С (табл. 2, 3). Так, за 7 сут воздействия температуры 8С прирост составил около 30%, а при 12С – 40% (табл. 3).
Аналогичные результаты получены и при изучении изменения площади 1-го листа растений пшеницы при воздействии низких температур. Наибольшее негативное влияние на площадь 1-го листа оказывала температура 4С (табл. 4). Прирост площади листа в этом случае за 7 сут опыта составил около 30%, в то время как в контроле – 53%. Меньшее отрицательное воздействие на площадь листа проявлялось при температурах 8 и 12С: ее прирост по отношению к исходному уровню составил 38 и 45%, соответственно.
Таким образом, выявлена прямая зависимость изменения роста растений пшеницы от воздействия на них температуры: чем ниже температура, тем более выражено ее негативное влияние на ростовые процессы. Полученные данные также показали, что хотя при действии температур 4, 8 и 12С происходит торможение роста пшеницы, однако полного его ингибирования не обнаружено. Отрицательное воздействие низких температур на ростовые процессы растений связано с их влиянием на процессы деления и растяжения клеток (Родченко и др., 1988; Кошкин, 2010). Для ряда видов растений были установлены пороговые температуры, при которых возможно медленное митоти-ческое деление или происходит полное его прекращение (Гриф, 1981). Однако отмечено, что низкая температура вызывает не столько торможение, сколько изменение характера роста у растений пшеницы, что может быть обусловлено сокращением числа делений, и одновременной стимуляцией образования митохондрий в клетках (Кислюк, 1985). Наряду с влиянием низких температур на деление клеток, воздействие на рост растений связано с изменением ряда физиолого-биохимических процессов, в том числе реакций фотосинтеза (Pocock et al., 2001; Theocharis et al., 2012), а также ультраструктуры клеток (Климов и др., 1997; Трунова, 2007).
В ходе нашей работы полное прекращение роста листа проростков озимой пшеницы наблюдали только в течение первых суток действия температур 4 и 8С. В дальнейшем отмечен медленный рост листа, и в результате к концу опыта (через 7 сут) его линейные размеры превышали исходный уровень в зависимости от температуры примерно на 25 – 40%. Эти данные подтверждают точку зрения, согласно которой поддержание активной работы фотосинтетического аппарата у озимых злаков и повышение их устойчивости в период действия пониженных температур осуществляется на фоне торможения ростовых процессов (Hurry et al., 1995; Климов, 2003; Венжик и др., 2012). Такое торможение роста можно рассматривать как защитно-приспособительную реакцию растений, поскольку при действии низких температур происходит перестройка метаболизма в целом и сдвиг энергетического баланса в сторону усиления синтеза резервных, энергетических и протекторных соединений, таких как углеводы, необходимых растению для увеличения устойчивости к холоду (Чиркова, 2002; Smallwood, Bowles, 2002; Климов, 2009; Wenifield et al., 2010).
Результатом подобного рода изменения является преобладание донор-ной функции (фотосинтеза) над акцепторной (рост) (Климов и др., 1997; Трунова, 2007; Климов, 2008). Более того, считается, что торможение роста является необходимым условием повышения морозоустойчивости растений, однако только этого не достаточно, необходимы и перестройки метаболизма в целом (Туманов, 1979; Родченко и др., 1988; Войников, 2011).
Как отмечалось ранее, торможение роста является общим проявлением ответной реакции растений и на токсическое действие тяжелых металлов (Нестерова, 1989; Гуральчук, 1994; Vassilev, Iordanov, 1997; Чиркова, 2002; Титов и др., 2007 и др.). Установлено, что существует достаточно хорошо выраженная дозовая зависимость между концентрацией тяжелого металла, продолжительностью его воздействия и ростовыми показателями (Алексеева-Попова, 1991; Maksymiec, 1997; Таланова и др., 2001а; Shi, Cai, 2009; Клаус и др., 2013).
Гены транскрипционных факторов
В ответ на внешнее воздействие в клетке запускается каскадный механизм передачи сигнала, в котором ключевую роль играют ДНК-связывающие белки – транскрипционные факторы (Udvardi et al., 2007). Транскрипционные факторы, как правило, характеризуются наличием специфического ДНК-связывающего домена, сайта олигомеризации, домена регуляции транскрипции и сигнал-распознающего домена, однако в структуре некоторых из них отсутствует специфический ДНК-связывающий домен или домен регуляции транскрипции (Goff et al., 1992; Doebley, Lukens, 1998). За счет наличия специфических ДНК-связывающих доменов они способны регулировать (активировать или подавлять) экспрессию различных групп генов, в том числе кодирующих белки, индуцируемые неблагоприятными воздействиями (Saleh, Pages, 2003). По содержанию специфических ДНК-связывающих доменов транскрипционные факторы подразделяются на различные семейства, такие как AP2/ERF (APETALA2/ethylene response factor), WRKY, NAC (NAM, ATAF1,2, CUP2), bHLH (basic helix-loop-helix), bZIP (basic leucine zipper), MYB (Myeloblastosis) (Yamaguchi-Shinozaki, Yamaguchi., 2006; Медведев, Шарова, 2010; Martin et al., 2010; Wenfield et al., 2010; Medina et al., 2011; Licausi et al., 2013). Отметим, что в настоящее время идентифицировано довольно много транскрипционных факторов, в частности 29 классов у араби-допсиса, 16 из которых специфичны для растений (Riechmann et al., 2000).
Транскрипционные факторы являются важными регуляторными белками, контролирующими процессы роста и развития растений, и участвующими в процессах их адаптации к неблагоприятным факторам среды, играя ключевую роль в сигнальных путях (Медведев, Шарова, 2010). Усиление экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы, отмечено при воздействии на растения разных абиотических факторов, таких как обезвоживание, засоление, низкие и высокие температуры и др. (Saleh, Pages, 2003; Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 2006; Mishra et al., 2009; Morran et al., 2011; Licausi et al., 2013).
В связи с этим представляет интерес изучение экспрессии генов, кодирующих различные транскрипционные факторы, для выяснения их роли в механизмах устойчивости растений к абиотическим факторам. Одним из самых многочисленных семейств транскрипционных факторов у растений являются MYB, обнаруженные у всех эукариот (Медведев, Шарова, 2010; Du et al., 2012; Ambawat et al., 2013). Представители этого семейства содержат консервативный ДНК-связывающий домен – MYB (Feller et al., 2011; Prouse, Campbell, 2013). Основываясь на количестве MYB доменов, семейство подразделяется на 4 класса 1R-, R2R3-, 3R и 4R MYB белков (Feller et al., 2011; Ambawat et al., 2013, Liu et al., 2013). В отличие от животных растения преимущественно содержат R2R3-тип MYB белков (Ambawat et al., 2013). Эти факторы транскрипции мультифункциональны и контролируют процессы роста, развития, включая пролиферацию клеток, развитие корня, образование корневых волосков и трихом, регуляцию клеточного цикла и циркадные ритмы, передачу фитохромного сигнала, метаболизма фенилпро-паноида и биосинтез антоцианина, участвуют в гормональном сигналинге и в ответных реакциях растений на действие абиотических и биотических факторов (Martin, Paz-Ares, 1997; Медведев, Шарова, 2010; Dubos et al., 2010; Feller et al., 2011; Mao et al., 2011; Zhang et al., 2012; Prouse, Campbell, 2013). Белки MYB обнаружены и охарактеризованы у многих видов растений, в том числе и пшеницы (Chen et al., 2005; Rahaie et al., 2010; Zhang et al., 2012).
Нами было проанализировано накопление транскриптов гена MYB80, кодирующего транскрипционные факторы MYB, в листьях пшеницы. Установлено, что накопление мРНК гена MYB80 происходит уже в начальный период (15 мин –1 ч) действия низкой температуры (рис. 6). При более длительных экспозициях (1–3 сут) содержание транскриптов этого гена снижалось, однако на 5 сут вновь возрастало и сохранялось на достигнутом уровне до конца эксперимента. Под влиянием сульфата кадмия значительное накопление мРНК также происходило через 15 мин от начала его воздействия, в дальнейшем содержание транскриптов поддерживалось на высоком уровне в течение 2 сут, а затем снижалось, но даже на 6–7 сут превышало исходные значения. Совместное действие низкой температуры и сульфата кадмия также приводило к быстрой индукции накопления транскриптов гена MYB80 в начальный его период (15 мин – 5 ч). На 1–3 сут отмечено некоторое снижение содержания мРНК MYB80, однако при более длительных экспозициях (5–7 сут) – вновь значительное его повышение.
В настоящее время известно, что гены, кодирующие транскрипционные факторы MYB, участвуют в повышении устойчивости растений к различным абиотическим факторам. В частности, засоление индуцировало повышение экспрессии гена AtMYB73 у арабидопсиса (Kim et al., 2012) и гена TaMYB1 у пшеницы (Lee et al., 2007). Повышение устойчивости растений к засухе наблюдалось при сверхэкспрессии гена AtMYB15 у арабидопсиса (Zhang et al., 2012), OsMYB55 у риса (Ambawat et al., 2013) и StMYB1R1 у картофеля (Shin et al., 2010). Кроме того, экспрессия гена TaMYB33 и TaMYB2a пшеницы у трансгенных растений арабидопсиса (Mao et al., 2011; Qin et al., 2012) и гена AtMYB44 арабидопсиса у сои (Seo et al., 2012) приводила к повышению их устойчивости к засухе и засолению.
