Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы
1.1. Таксономия и физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Enterococcus 9
1.2. Клиническое значение бактерий рода Enterococcus 13
1.3. Роль представителей рода Enterococcus в оценке качества воды 21
1.4. Механизмы адаптации и выживания бактерий рода
Enterococcus в низкотемпературных условиях среды 26
ГЛАВА 2. STRONG Объекты и методы исследования
STRONG 2.1. Физико-географическая характеристика озера Байкал 34
2.2. Объекты исследования 37
2.3. Методы исследования 44
ГЛАВА 3. Распределение бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, его основных притоках и в реке Ангаре
3.1. Пространственное распределение представителей рода Enterococcus в акватории озера Байкал 56
3.2. Распределение бактерий рода Enterococcus в Южном Байкале 62
3.3. Распределение бактерий рода Enterococcus в реке Селенге 65
3.4. Пространственное распределение бактерий рода Enterococcus в
реке Ангаре 69
3.5. Биоразнообразие бактерий рода Enterococcus, выделенных из
вод озера Байкал 74
ГЛАВА 4. Гемолитическая активность и антибиотикоустойчивость бактерий рода Enterococcus, выделенных из озера Байкал
4.1. Анализ гемолитической активности чистых культур бактерий
рода Enterococcus 81
4.2. Антибиотикорезистентность представителей рода Enterococcus 84
ГЛАВА 5. Изучение выживаемости и адаптации условно-патогенных бактерий рода Enterococcus в условиях лабораторного моделирования
5.1. Адаптационные механизмы роста и развития исследуемых бактерий в лимитируемых условиях среды обитания 89
5.2. Изучение влияния химических и физических факторов на выживание энтерококков в воде озера Байкал в экспериментальных условиях 100
Заключение 112
Выводы 115
Список литературы 117
Приложение 134
- Таксономия и физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Enterococcus
- Методы исследования
- Распределение бактерий рода Enterococcus в реке Селенге
- Адаптационные механизмы роста и развития исследуемых бактерий в лимитируемых условиях среды обитания
Введение к работе
Одной из сторон пристального исследования состава и функционирования микробных сообществ водных экосистем является изучение микроорганизмов, определяющих или влияющих на качество воды. Особенно это важно для озера Байкал — участка мирового наследия.
Традиционные методы исследования природной воды по микробиологическим и гигиеническим характеристикам представляют собой предписанные стандартом исследования питьевой воды. Так как разнообразие бактерий, вирусов и простейших, которые могут быть обнаружены в воде, очень велико, специфические тесты на отдельные патогенные организмы не применимы для рутинного анализа микробиологического качества воды. Микробиологическое загрязнение природных вод происходит в большинстве случаев за счет фекальных сточных вод, и поэтому еще в 19 веке в качестве индикатора были предложены колиформные бактерии. Согласно опубликованным данным (Edberg et. al., 1994), Е. coli не является показательным видом по многим характеристикам. В соответствии с нормативными актами Европейского сообщества при оценке качества воды необходимо наряду с другими представителями потенциально-патогенной группы микроорганизмов следует определять и бактерии рода Enterococcus.
Озеро Байкал является источником питьевой воды, и поэтому изучение возможного поступления энтерококков в озеро, их распространения, адаптации и механизма выживания в байкальской воде важно как с научной, так и с практической точки зрения.
В санитарно-биологическом аспекте в озере Байкал изучено пространственное распределение, биоразнообразие представителей семейства Enterobacteriaceae и неферментирующей группы бактерий (Павлова и др., 2003; Drucker et. al., 2006). Исследования бактерий рода Enterococcus, также относящихся к индикаторной потенциально-патогенной группе микроорганизмов, в озере Байкал ранее не проводились.
5 В течение многих лет микроорганизмы этого рода рассматривали как клинически малозначимые. Пересмотру оценки патогенетической роли энтерококков способствовало обнаружение у микроорганизмов факторов вирулентности. В последние годы роль микроорганизмов, относящихся к роду Enterococcus, возросла не столько из-за их широкого распространения, сколько из-за приобретения ими устойчивости к подавляющему -большинству доступных антибактериальных препаратов, к высушиванию, свету, низкой температуре, а также к действию физических, химических и биологических факторов (The Enterococci..., 2002). В настоящее время интерес к этим бактериям резко возрос в связи с их ролью в эпидемиологическом отношении. Кроме того, согласно многочисленным исследованиям, патогенные и непатогенные микроорганизмы способны переходить в VBNC состояние («viable but nonculturable state» (жизнеспособное, но некультивируемое состояние)), при котором клетки на питательной среде колоний не образуют, но при этом остаются жизнеспособными (Kell et al., 1998; Oliver, 2005). Возможно, этот механизм позволяет сохраняться в воде Байкала различным группам микроорганизмов, в том числе и потенциально-патогенным. Изучение возможного постоянного поступления потенциально-патогенных бактерий в озеро и сохранения ими своей жизнеспособности в воде, в комплексе с другими группами микроорганизмов, очень важно, прежде всего, с точки зрения оценки качества байкальской воды.
Цель: изучение особенностей распространения и видового состава бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, установление механизма адаптации энтерококков, позволяющего длительное время сохранять жизнеспособное состояние в особых экологических условиях озера.
Задачи исследования;
1. исследовать количественное распределение бактерий группы Enterococcus в воде озера Байкал, его основных притоках и в реке Ангаре;
определить видовой состав микроорганизмов рода Enterococcus, выделенных из воды озера Байкал;
изучить гемолитическую активность и антибиотикорезистентность бактерий рода Enterococcus, выделенных из воды озера Байкал;
4. в лабораторных условиях установить один из возможных механизмов
выживания бактерий рода Enterococcus в байкальской воде;
5. провести модельные эксперименты по влиянию химических и
физических факторов на выживание бактерий рода Enterococcus в воде озера
Байкал.
Научная новизна. Впервые исследовано количественное распределение и видовой состав бактерий рода Enterococcus в различных районах озера Байкал, в его основных притоках и в реке Ангаре. Установлены видовой состав энтерококков, выделенных из акватории озера Байкал, и факторы их патогенности. Впервые в экспериментальных условиях на примере бактерий рода Enterococcus рассмотрены адаптационные возможности выживания грамположительных бактерий в особых экологических условиях Байкала в результате перехода их в некультивируемое состояние. Выяснено, что сохранение жизнеспособности связано с изменением структуры клеточной стенки. Проведены экспериментальные работы по изучению влияния используемых методов дезинфекции на рост и развитие бактерий рода Enterococcus.
Практическая значимость. Полученные данные о распределении и
видовом составе бактерий рода Enterococcus являются индикаторами ?
антропогенного влияния на озеро Байкал и могут быть использованы в качестве
дополнительных показателей при организации комплексного
микробиологического мониторинга. Показано, что антибиотикорезистентность и гемолитическая активность бактерий рода Enterococcus могут служить дополнительными критериями патогенности водных бактерий, которые
7 необходимо учитывать при оценке качества воды озера Байкал. Сформированная коллекция культур бактерий рода Enterococcus, выделенных из различных районов озера Байкал, может быть использована при оценке эффективности процессов дезинфекции, что особенно важно при подготовке питьевой воды, которая должна использоваться с учетом ее безопасности для потребителей.
Основные положения, выносимые на защиту;
В озере Байкал бактерии рода Enterococcus приурочены к литоральным районам озера, прилегающим к населенным пунктам, и его основным притокам. Изолированные штаммы фекального происхождения Е. faecium, Е. avium, Е. faecalis, Е. mundtii, Е. hirae, Е. durans, Е. gallinarum могут рассматриваться как специфические индикаторы санитарно-бактериологического состояния качества воды.
Адаптация и сохранение жизнеспособности бактерий рода Enterococcus в байкальской воде обусловлены переходом их в некультивируемое, но жизнеспособное состояние за счет изменения структуры клеточной стенки.
Устойчивость бактерий рода Enterococcus к воздействию хлора и озона повышается в присутствии органических веществ, что необходимо учитывать при водоподготовке питьевой воды.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: Всероссийской конференции «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), II Международной молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2006); Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); II Международном Байкальском Микробиологическом симпозиуме «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск - п. Листвянка, 2007); III Международной
8 конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция» (Одесса, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 — 2012 годы» (Москва, 2007); Международном симпозиуме «Контроль и реабилитация окружающей среды: КРОС - 2008» (Томск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008); International Symposium (Australia, 2008); IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2008); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы» (Москва, 2008). По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 3 статьи опубликованы, 2 - приняты в печать, 11 тезисов и получено одно свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2009620013.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (152 источника, из них 97 - зарубежных) и приложений. Объем работы составляет 143 страницы машинописного текста, включающего 12 таблиц, 32 рисунка и 2 приложения.
Таксономия и физиолого-биохимическая характеристика бактерий рода Enterococcus
Стрептококки впервые были обнаружены Пастером в 1879 г. в тканях человека при рожистом воспалении и раневых инфекциях, септицемиях и гнойных поражениях (Murray, 1990). Название рода «Streptococcus» было предложено Розенбахом Ф. в 1884 г. для описания бактерий, изолированных в чистой культуре из гнойных ран (Медицинская микробиология, 1999). По Murray В. Е. термин «энтерококк» впервые был применен в 1899 г. Тирселином М. Е. во французской статье. Это название было использовано для подтверждения кишечного происхождения нового грамположительного диплококка.
Первая часть двадцатого века характеризовалась значительным развитием технологий, методов исследований, которые имели большое значение в классификации стрептококков и понимании их клинического и экологического значения. По предложению Ленсфилд Р. С. (1934) стрептококки классифицировали по наличию специфических углеводов в клеточной стенке, выделяя 17 серогрупп, обозначаемых заглавными латинскими буквами. Также используют классификацию Брауна, основанную на особенностях роста на агаре с кровью барана. Соответственно выделяют а - дают частичный гемолиз и позеленение среды, J3 - полностью гемолизирующие, у - дающие визуально невидимый гемолиз. В своем обзоре в 1937 г. Шерман Дж. М. подчеркнул, что термин «энтерококк» был использован для установления различий между большим количеством видов, которые ранее определись как S. faecalis, и предложил классификацию стрептококков, основанную на классификации Ленсфилд Р. С. По антигенной структуре род разделили на 4 группы: «pyogenic», «viridans», «lactic» и «enterococcus». Термин «enterococcus» использовался для организмов, которые росли при 10 и 45С в 6.5% NaCl и при рН 9.6, выживали при 60С в течение 30 минут. У них также была отмечена способность к расщеплению эскулина (Sherman, 1937). Многие из этих характеристик стали широко применяться для того, чтобы различать энтерококки и неэнтерококковые стрептококки типа S. bovis. В пределах энтерококковой группы Шерман Дж. М. описал признанные в то время энтерококковыё виды: S. faecalis, S. zymogenes, S. liquefaciens и S. durans. Виды, которые Орла-Дженсен С. в 1919 описал как S. glycerinaceus и S. faecium, считались Шерманом Дж. М. как один вид S. faecalis (Sherman, 1937).
Применение молекулярно-биологического анализа, основанного на сравнении последовательности генов, разъяснило и расширило систему классификации энтерококков. Фэрроу Дж. Э. и др. в 1983 г. представили биохимические данные и данные ДНК гибридизации, согласно которым виды S. faecalis, S. faecium, S. casseliflavus, S. avium, S. durans и S. faecalis var. malodoratus являются отдельными видами (Farrow et. al, 1983).
Реклассифицировать энтерококки в новый род, названный Enterococcus, было предложено Сшлейфером К. и Килппером-Балзом К, P. (Schleifer et. al., 1984). Авторы использовали похожую методологию, показав, что виды, названные как S. avium, S. casseliflavus, S. durans, S. faecalis subsp. malodoratus, и S. gallinarum тесно связаны с представителями рода Enterococcus (Collins et al., 1984; Schleifer et. al, 1984; Farrow et. al., 1983; Collins et al., 1986). Они предложили включить эти виды в род Enterococcus, а по их различию рассматривать как отдельные виды. Были предложены названия: Enterococcus avium, Е. casseliflavus, Е. durans, Е. malodoratus, и Е. gallinarum (Collins et al., 1984).
Вильяме A. M. с соавторами на основе анализа последовательностей 16S рРНК распределил виды рода Enterococcus в состав пяти групп, приведенных в табл. 1 (Williams et al., 1991).
Согласно определителю Берджи (1997) в пределах рода Enterococcus выделяют 16 видов, большинство из которых крайне редко встречаются в патологии человека. Среди клинических изолятов 80-90% приходится на Е. faecalis и Е. faecium. Ограниченное значение имеют такие виды, как Е. gallinarum, Е. flavescens, Е. casseliflavus, Е. hirae (Определитель..., 1997).
Согласно современной систематике, отраженной в «Списке бактериальных названий с номенклатурой» List of Bacterial Names with Nomenclature: (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTl род Enterococcus занимает следующее положение: «cellular organisms: Bacteria: Firmicutes: Bacilli: Lactobacillales: Enterococcaceae».
Род Enterococcus состоит из грамположительных, факультативно анаэробных, хемоорганотрофных организмов. Клетки сферические или овальные по форме (0,6-2,0 х 0,6-2,5 мкм), располагаются парами, короткими цепочками, небольшими скоплениями или отдельными клетками (Определитель..., 1997).
Эти микроорганизмы, подобно стрептококкам, не имеют цитохромных ферментов и поэтому каталазоотрицательны, хотя некоторые виды продуцируют псевдокаталазу (Schleifer et. al., 1984; Facklam et. al., 1989). Большинство видов рода Enterococcus обладают характеристиками, определенными Шерманом Дж. М. в 1937 г., такими как способность расти в бульоне с концентрацией 6.5% NaCl и при рН 9.6, гидролизовать эскулин в присутствии 40% желчи, расти при температуре от 10С до 45С (оптимальная температура 37С) и, главным образом, выживать при 60 С в течение 30 минут. Следует отметить, что Е. avium плохо растет, или вообще не растет при 10С. Бактерии рода Enterococcus растут в молоке с 0,1% метиленовым синим (Sherman, 1937; Schleifer et. al., 1984; Facklam et. al., 1989; Определитель..., 1997).
Метаболизм бродильного типа, сбраживают разнообразные углеводы (обычно лактозу) с образованием в основном Ь(+)-молочной кислоты, но не. газа, при этом снижая рН среды до 4.2 - 4.6. Некоторые виды подвижны за счет немногих жгутиков, четких капсул не образуют. На жидких средах дают диффузный рост, а на плотных — мелкие, круглые, выпуклые, блестящие колонии или нежный налет. На средах с молоком или кровью формируют водонерастворимый пигмент белого или лимонно-желтого цвета. На кровяном агаре могут давать а- или р-гемолиз. На плотных питательных средах колонии энтероккоков мелкие, круглые с ровными краями, выпуклые, мутные. При густом посеве сливаются в сплошной нежный налет (Определитель..., 1997).
Энтерококки широко распространены в природе (Murray, 1997; Медицинская микробиология, 1999; The Enterococci..., 2002). Они являются одним из фоновых видов кишечника человека, млекопитающих, птиц (Murray, 1997). Нередко обнаруживаются в составе флоры половых путей, полостей глотки, рта, носа. Долго выживают в почве, пищевых продуктах, в которых при комнатной температуре могут размножаться. Достаточно устойчивы к действию физических, химических и биологических факторов (The Enterococci..., 2002).
Методы исследования
Для выделения колоний и учёта численности бактерий рода Enterococcus по водным образцам использовался метод посева на бактериальных фильтрах с целью концентрирования проб воды (Парфенова, 1984). Объем воды (50 мл) пропускали через фильтр с размером пор 0,45 цт. Затем фильтр помещали на селективную среду Сланеца-Бертли, содержащую 2,3,5-трифенилтетразолийхлорид и азид натрия (NaN3), который подавляет рост грамотрицательных бактерий. Инкубацию посевов проводили при 37С в течение 48 ч. Бактерии рода Enterococcus на этой среде образуют либо красные, либо розовые колонии (рис. 5 а) (Санитарно-микробиологический.., 2005; EN ISO 7899-2: 2000). Для уточнения результата фильтр с выросшими колониями переносили на среду, содержащую желчь, эскулин и железо (III) лимонноаммиачное. Посевы на данной среде инкубировали при 44С в течении двух часов. Фекальные энтерококки обладают способностью гидролизовать эскулин, входящий в состав среды. При гидролизе эскулина образуется конечный продукт - 6,7-дигироксикумарин, который при соединении с ионами железа дает черный пигмент, диффундирующий в среду, что свидетельствует о положительном результате при определении бактерий рода Enterococcus в воде (рис. 5 б) (EN ISO 7899-2: 2000).
Результаты анализа даем числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 100 мл воды (Санитарно-микробиологический..., 2005).
Образцы донных осадков обрабатывали согласно следующей методике: , образец исследуемого донного осадка в количестве 1 г стерильно вносили в колбу ёмкостью 300 мл, содержащей 100 мл стерильной дистиллированной воды. В течение 30 мин образец встряхивали на качалках (Laboratory shaker type 3585 «Elpan») со скоростью 150 об/мин при амплитуде 5. После этого суспензии давали отстояться и использовали ее для фильтрования по 50 мл.
Видовую идентификацию культур проводили по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам в соответствии с современными принципами классификации (Мапего, 1999)1 Для этого определяли следующие признаки: посев на косяки для получения суточной культуры и окраска по Грамму, наличие у чистых культур микроорганизмов сахаролитическои и каталазной активностей, способность к редукции теллурита калия, к гидролизу аргенина и эскулина, способность роста при 45С, при 50С, а также определение их гемолитической активности (Определитель бактерий Берджи, 1997; Мапего, 1999; Справочник по микробиологическим..., 1967).
Морфологический анализ. Для идентификации исследуемых бактерий изучали морфологию выделенных штаммов. Суточные чистые культуры окрашивали по Грамму (Родина, 1965) и при обнаружении в мазках грамположительных, как правило, слегка вытянутых с заостренными концами диплококков, давали положительный ответ (Санитарно-микробиологический.., 2005). Препараты анализировали на световом микроскопе CARL ZEISS JENA (Германия).
Физиолого-биохимические тесты. Определение способности роста при 50С определяли на накопительной среде ВШ (Difko). Отсеянную исследуемую культуру инкубировали в термостате при 50С в течение 24 часов. К росту при 50С способны многие Е. faecium и лишь некоторые представители Е. faecalis. Колонии бактерий рода Enterococcus на данной среде круглые, блестящие, кремового цвета, с ровными краями размером до 1 мм.
Для определения редукции теллурита калия использовали ингибиторную среду, на которой растут только штаммы вида Е. faecalis, устойчивые к высоким концентрациям теллурита калия. В процессе роста они восстанавливают теллурит калия, образуя при этом черные колонии, окруженные узким бесцветным ободком. Посевы исследуемых культур инкубировали на среде до 2 суток при 37С, после чего отмечали наличие роста характерных аспидно-чёрных колоний, окружённых бесцветным ободком, что указывает на положительную реакцию (Справочник по микробиологическим..,,. 1967).
Для определения гидролиза аргинина использовали тест-полоски. Полоски фильтровальной бумаги размером 0.5 на 5 см пропитывали раствором аргинина и высушивали. Затем в пробирке со стерильной водой готовилась густая взвесь исследуемой культуры, куда вносили тест-полоску. Исследуемую культуру инкубировали при 37С 2 часа. После инкубации в пробирку добавляли 1-2 капли 0.04% спиртового раствора индикатора бромкрезолового пурпурного. При положительной реакции тест-полоска окрашивается в фиолетовый цвет, при отрицательной - в жёлтый (Справочник по микробиологическим.., 1967) (рис. 6). . Способность к гидролизу аргенина разных штаммов бактерий рода Enterococcus
Распределение бактерий рода Enterococcus в реке Селенге
В качестве источника поступления условно-патогенных бактерий в озеро Байкал является и река Селенга, которая, протекая по территории Монголии и Бурятии, несет со своими водами промышленные и хозяйственно-бытовые стоки городов Улан-Удэ и Селенгинска, а также пос. Кабанска и других относительно небольших поселений. Имея площадь бассейна 447 060 км , она несет в оз. Байкал около 50% всего речного стока. Воды, заполняющие обширный район Селенгинского мелководья, существенно отличаются от «собственно байкальских вод» (Голдырев и др., 1971). Качество воды р. Селенги в основном определяет активная сельскохозяйственная деятельность на территории ее бассейна. Поступление промышленных сточных вод невелико - в основном от Улан-Удэнского промышленного комплекса (Мамонтова, 1998).
Основное внимание при изучении распределения потенциально-патогенной группы Enterococcus было направлено на их распространение в водной толще реки Селенги как района с высокой антропогенной нагрузкой на озеро (рис. 14 и 15). Были проведены подробные исследования этого района в июле 2006 г. и июле 2008 г.
Результаты обнаружения энтерококков микробиологическими методами в дельте р. Селенги, июль 2006:
А- КОЕ/ 100 мл, отобранных с поверхности; - КОЕ / 100 мл, придонная вода
Максимальное количество представителей рода Enterococcus в 2006 г. выявлено в протоке Шаманка - 102 КОЕ/ 100 мл воды (рис. 14). Высокие значения численности исследуемых бактерий были установлены в р. Селенге у пос. Кабанск - 44 КОЕ/ 100 мл и в оз. Заверняеха - 32 КОЕ/ 100 мл, а также в протоках Колпинная и Северная, 50 и 45 КОЕ/ 100 мл соответственно. Заметное количество энтерококков также было выявлено в пробах воды, отобранных и в других протоках, таких как Левобережная, Средняя и Галутай, где количество колеблется от 16 до 28 КОЕ/ 100 мл. Отмечены также высокие значения численности культивируемых энтерококков в Мурзино и в заливе Сор Черкалов, где их количество составляло 31 и 28 КОЕ/ 100 мл. Все районы дельты отличаются наиболее благоприятными условиями для прогрева вод, накоплению и трансформации органического вещества и, как следствие, развития микроорганизмов.
Результаты обнаружения энтерококков микробиологическими методами в дельте р. Селенги, июль 2008: А - КОЕ/ 100 мл, отобранных с поверхности; т- КОЕ / 100 мл, придонная вода
В летний период 2008 г. были проведены повторные исследования этого района. В это время численность бактерий рода Enterococcus в дельте была намного выше по сравнению с их численностью в 2006 г. и практически в большинстве случаев превышала предельно допустимые значения. Наибольшее количество энтерококков было обнаружено в зал. Черкалов Сор и у пос. Кабанск, где составляло 122 КОЕ/ 100 мл и 126 КОЕ/ 100 мл соответственно (рис. 15). Высокие значения выявлены, как и в 2006 г., в протоках Шаманка - 88 КОЕ/ 100 мл и Левобережная - 84 КОЕ/ 100 мл, а также на ст. Мурзино - 86 КОЕ/ 100 мл. Заметное количество было установлено и в протоках Средняя, Колпинная, в устьях Галуты и Харауз. Здесь численность бактерий колебалась от 14 до 54 КОЕ/ 100 мл. Минимальное значение энтерококков, 2 КОЕ/ 100 мл, было обнаружено в оз. Заверняеха.
В результате проведенных исследований отмечено, что повышенное содержание представителей рода Enterococcus обнаруживаются только в пробах, отобранных непосредственно в водной толще реки Селенги. В это же время на выходе из проток в озеро количество бактерий рода Enterococcus в водных образцах заметно снижается. Чем дальше от дельты в озеро, тем меньше исследуемых микроорганизмов обнаруживали в пробах воды. В исследованиях, проведенных в 2006 и 2008 гг., численность энтерококков в Байкале на расстоянии 1 км от устья протоки Харауз составляла 5 КОЕ/ 100мл и 18 КОЕ/ 100 мл соответственно, а на расстоянии 3 км, 5 км и 7 км они вовсе не были обнаружены (рис. 14, 15). Это говорит о том, что даже отрицательное влияние реки Селенги, которая несет сточные воды с территорий г. Улан-Удэ и Монголии, компенсируется особыми условиями Байкала.
Таким образом, проведенные исследования показали, что повышенное содержание исследуемых потенциально-патогенных микроорганизмов рода Enterococcus постоянно наблюдается в придельтовом районе озера, подверженном значительному влиянию р. Селенги. Поэтому этот район требует постоянного наблюдения за его неблагополучной санитарно-гигиенической и экологической обстановкой. В среднем численность энтерококков в реке ближе к устью и в самой дельте увеличивается, что, вероятно, может быть связано с поступлением промышленных, сельскохозяйственных и коммунально-бытовых стоков по всей длине реки. По данным Сороковиковой Л. М. с соавторами (2005), увеличение санитарно-бактериологических показателей в осеннее 69 летний период в пределах дельты р. Селенги также может быть обусловлено массовым обитанием птиц, отмеченным по берегам, выпасом скота, расположением охотничьих и рыболовных стоянок. В открытом же Байкале по нашим данным снижается не только численность потенциально-патогенных бактерий, но и происходит смена аллохтонного микробного сообщества на автохтонное, где доминирующее место занимают олиготрофные и психрофильные микроорганизмы.
Река Ангара имеет длину 1853 км и общую площадь бассейна 468000 км . Территория бассейна характеризуется выраженной континентальностью климата и длительным холодным периодом. Данные 50-х годов о гидрохимическом режиме р. Ангары свидетельствуют о высокой степени чистоты речной воды полвека назад. Однако за последние десятилетия в связи с интенсивным промышленным развитием р. Ангара значительно изменилась. Ее воды на расстоянии 2 км ниже очистных сооружений г. Иркутска оцениваются как грязные, а участки в районе городов Иркутск и Ангарск определяются как умеренно грязные (Мамонтова, 1998). Кроме того, в р. Ангару ниже Усть-Илимского водохранилища поступает большое количество биогенных элементов и органического вещества. Под их влиянием происходит заметное увеличение концентрации растворенных веществ в воде от створа Усть-Илимской до Богучанской ГЭС (Земская, 1986). В настоящий период содержание микроорганизмов, в том числе условно-патогенных, в р. Ангаре ниже Усть-Илимской ГЭС зависит от стока их из вышерасположенного водохранилища. Нами в августе 2006 г. были проведены исследования по обнаружению бактерий рода Enterococcus в р. Ангаре ниже Усть-Илимской ГЭС до места впадения реки в Енисей. Микробиологические исследования нижнего течения р. Ангары показали, что распределение исследуемых бактерий носит неравномерный характер, обусловленный приуроченностью к местам более интенсивного поступления органического вещества. Высокие значения микроорганизмов так же, как и в предыдущие годы (Земская, 1986), отмечены ниже устьев рек, питающих р. Ангару. Здесь численность энтерококков колебалась от 1 до 6 КОЕ/ 100 мл (рис. 16).
Адаптационные механизмы роста и развития исследуемых бактерий в лимитируемых условиях среды обитания
Исследования способности выживания энтерококков в окружающей среде представляют наибольший интерес в свете проблем сохранения чистоты природных вод и использования их в качестве питьевой воды без нанесения ущерба здоровья потребителям. На основе анализа литературных данных и проведенных собственных исследований было сделано предположение, что обнаружение энтерококков в воде молекулярно-биологическими методами, а не методами культивирования, связано с переходом их в некультивируемое, но жизнеспособное состояние. Многие бактерии могут входить в некультивируемое состояние при неблагоприятных условиях окружающей среды (Barer et. al., 1993; Oliver, 1993; Satta et. al., 1994). Влияние температуры и концентрации питательных веществ является одним из доминирующих факторов, определяющих выживание и наличие бактерий, в водных экосистемах, в том числе и бактерий рода Enterococcus. Согласно работам Оливера Дж., Барцины И. с соавторами (2005, 1997), олиготрофность - главный из абиотических факторов, который вызывает переход микроорганизма в жизнеспособное, но некультивируемое состояние. В этом состоянии бактерии теряют способность культивироваться на питательной среде, но остаются жизнеспособными и проявляют метаболическую активность (Roszak et. al., 1984; Byrd et. al., 1991). Эта стратегия выживания была описана для многих грамотрицательных бактерий (Kell et al., 1998; Oliver et al., 2005), но только недавно было доказано, что грамположительные виды, такие как Enterococcus faecalis, могут также входить в VBNC состояние. В этом состоянии энтерококковые клетки являются метаболически активными и могут возобновлять активный рост, когда восстановлены нормальные условия роста (Lleo et. al., 1998; Signoretto, 2000).
В результате проведенных экспериментальных исследований по изучению механизма адаптации в байкальской воде, на примере одного из видов бактерий рода Enterococcus, был установлен один из возможных механизмов выживания и сохранения жизнеспособности этого микроорганизма в лимитирующих условиях среды. В байкальской воде энтерококки встречаются как с условиями низкой температуры, так и с условиями низких концентраций питательных веществ. Поэтому наибольший интерес представляет изучение сочетания действий основных абиотических факторов - температурного и трофического на самый распространенный в воде озера вид - Enterococcus faecium.
Чтобы изучить развитие исследуемых бактерий в байкальской воде в условиях разных температур и низкого содержания питательных веществ, были проведены серии модельных экспериментов и построены кривые их роста. Результаты проведенных опытов по изучению механизма адаптации бактерий рода Enterococcus в байкальской воде представлены на рис. 22 и 24.
На графике 22 видно, что в течение 36 часов происходит небольшое увеличение числа бактерий, культивируемых в байкальской воде при 4С и 24С, а затем происходит резкое снижение культивируемой части микроорганизмов. На 12 сутки бактерии перестают культивироваться в байкальской воде (рис. 22, 23 А), но при добавлении питательных веществ (среды ВШ) бактерии оживали и переходили из некультивируемого состояния в культивируемое (рис. 23 Б). Исключение составили бактерии, культивируемые при 37С, где сразу шло снижение численности клеток и, в конце концов, наступала их гибель. Рост не возобновлялся даже при внесении питательных веществ, после прекращения культивирования.
. А. Энтерококки в байкальской воде на 12 день культивирования при 4С. Б. Рост и развитие энтерококков после добавления питательных веществ к байкальской воде
Было проведено пять серий экспериментов, и во всех случаях итог был одним и тем же: исследуемые бактерии культивировались в байкальской воде при 4С и 24С, после переходили в жизнеспособное, но некультивируемое состояние, а при оживлении вновь начинали культивироваться. Отличались только периоды времени, когда клетки энтерококков переходили в это VBNC состояние, что зависело от концентрации посевного материала, взятого в эксперимент. Чем больше в начале опыта вносили материала в колбу, тем дольше клетки культивировались, и наоборот, чем меньше была концентрация энтерококков, тем быстрее клетки переставали культивироваться. При 37С клетки штамма Ent. 8 погибали в этих трофических условиях независимо от количества вносимого материала. Это можно объяснить тем, что штамм Ent. 8, выделенный из воды озера Байкал, приспособлен к низким положительным температурам озера, а 37С является экстремальным для его развития.
В результате проведенных исследований на примере культивирования штамма S 11 в байкальской воде были получены данные, представленные на рис. 24, которые показали, что для штамма, выделенного из реки Селенги, температура 37С не является критической, но при этой температуре энтерококки без увеличения численности быстрее впадают в некультивируемое состояние. Уже на 6 сутки клетки Е. faecium перестают культивироваться на питательной среде, но при добавлении питания вновь начинают культивироваться. Вероятно, это связано с тем, что вода в реке прогревается до более высоких температур, чем в самом озере, и поэтому клетки штамма S 11 легче адаптируются к разным температурным условиям.
При культивировании штамма S 11 в байкальской воде при 4С и 24С результаты оказались такими же, как при культивировании штамма Ent. 8 при тех же температурах. В этих условиях энтерококки культивировались гораздо более длительный период времени, чем при температуре 37С, и с понижением температуры увеличивалась выживаемость энтерококков, что находит подтверждение в литературе (Алтон, 1980; Филимонова, 1983; Bunker et al., 2004). Из данных, представленных на графике 24, видно, что при неуклонном уменьшении в числе КОЕ исследуемые бактерии, культивируемые при 24С, теряли способность развития колоний на среде на 13 сутки, а при температуре 4С - только на 23 сутки. При добавлении питания клетки вновь переходили в стадию культивированного состояния.
Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению механизма адаптации энтерококков, выделенных из разных районов озера Байкал, выявлена неоднозначная реакция штаммов Ent. 8 и S 11 на условия окружающей среды. Важной особенностью является способность исследуемых бактерий продолжительное время существовать и адаптироваться в условиях низких температур и минимального питания, а также их способность переходить в жизнеспособное, но некультивируемое состояние и при появлении питательных веществ вновь образовывать культивируемые формы.
Дальнейшие исследования VBNC состояния при помощи электронной микроскопии показали, что происходят изменения размеров самой клетки и клеточной стенки. Это, по-видимому, способствует выживанию исследуемых бактерий, как при низких температурных условиях, так и при недостаточном для их жизнедеятельности количестве органического вещества.
