Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение закономерностей оогенеза представляет собой одну из важнейших задач в современных исследованиях по биологии развития. В ряду актуальнейших проблем оогенеза - процессы, происходящие в ооците на заключительных стадиях оогенеза, а так же в период созревания, когда завершивший рост ооцит превращается в зрелое яйцо, способное к оплодотворению и дальнейшему развитию.
Характерной особенностью развития женских гамет разных животных является остановка процесса мейоза на различных фазах мейотических делений. У многих животных организмов развитие ооцитов блокируется на стадии G2/M первого деления мейоза. Возобновление делений мейоза происходит либо при оплодотворении, либо при действии гормона. Большой интерес в связи с этим представляет вопрос о механизме блокирования мейоза, и, тесно связанный с ним, вопрос о снятии этого блока при гормональной стимуляции ооцита.
Несмотря на интенсивные исследования, проводимые во многих лабораториях мира (Dunphy, 1994; Вауаа et al., 2000; Boonyaratankomkit et al., 2001; Byskov et al., 2002; Iwasaki et al., 2002; Harada et al., 2003) рецепторы к мейозиндуцирующим гормонам и ранние внутриклеточные сигнальные пути, активированные при связывании гормона с соответствующим рецептором, точно не установлены ни у одного из исследованных организмов. Удобной экспериментальной моделью для изучения механизмов созревания являются ооциты морских звезд. Это единственные животные, у которых установлен природный гормон созревания (1-метиладенин), что позволяет моделировать процесс индукции созревания в условиях экспериментов in vitro, максимально приближенными к физиологическому созреванию. Несмотря на достижения в области изучения сигнального каскада созревания у этих животных, остается много вопросов, которые
4 требуют ответа. Нет сомнения, что трансдукция сигнала, генерируемого мейоз-индуцирующим гормоном, реализуется через рецептор (Yoshikuni et al., 1988; Tadenuma et al., 1991, 1992), сопряженный с гетеротримерным G-белком (Shilling et al., 1989; Chiba et al., 1992, 1993). При активации G-белок диссоциирует на две активные субъединицы Ga и Gpy комплекс, имеющие разные внутриклеточные мишени. Ведущая роль в снятии профазного блока мейоза отводится GPy-комплексу. В то же время ничего не известно о возможных мишенях "активной" Осс,-субъединицы. Тогда как, специфичность взаимодействия активированного рецептора с определенным G-белком обусловлена конфигурацией а-субъединицы гетеротримера, и диссоциация комплекса GaPy зависит от состояния ГТФ-связывающего центра и ГТФ-азной активности этой субъединицы. В связи с этим, исследования роли Оа,-белка в трансдукции сигнала, модулированного 1-метиладенином и поиск внутриклеточных мишеней с которыми эта субъединица взаимодействует, необходимы не только для расшифровки механизмов снятия профазного блока мейоза у морских звезд, но и для понимания механизмов внутриклеточного сигнализирования с участием гетеротримерных G-белков.
Фундаментальный интерес в рамках сформулированной проблемы представляет исследование формирования гормонокомпетентной аденилатциклазной системы в ооцитах морских звезд. Этот интерес обусловлен первостепенной ролью в передаче гормонального сигнала в клетку, которая отводится продукту биосинтеза аденилатциклазы, универсальному внутриклеточному посреднику - цАМФ. Существуют косвенные данные, указывающие на возможное участие аденилатциклазы в регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд (Meijer et al., 1987, 1989; Tadenuma et al, 1992), однако подробные исследования в этом направлении не проводились.
Изучение механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд дополнит существующие в настоящее время молекулярные модели,
5 описывающие процесс формирования и снятия профазного блока мейоза у беспозвоночных животных. Цель и задачи исследования
Цель работы состояла в выяснении молекулярных механизмов регуляции роста и созревания ооцитов морских звезд и получении доказательств участия аденилатциклазной системы в снятии профазного блока мейоза.
В работе решались следующие задачи:
Исследовать процесс созревания в условиях экспериментов in vitro и in vivo с целью оценки влияния клеток гонады на протекание делений мейоза. Изучить морфологические изменения, происходящие в поверхностном слое ооцита в момент действия 1-метиладенина. Оценить участие актинового цитоскелета в процессе снятия профазного блока мейоза.
Охарактеризовать функциональные свойства аденилатцилазы ооцитов у разных видов морских звезд. Идентифицировать рецепторы, сопряженные с аденилатциклазой, и -изучить особенности их регуляции в растущих и закончивших рост ооцитах.
Исследовать формирование функционально-активной аденилатциклазной системы (гормональных рецепторов, ГТФ-связывающих белков и собственно фермента) в процессе роста ооцитов.
4. Идентифицировать типы регуляторных G-белков, проследить
количественную динамику и локализацию выявленных типов регуляторных
белков в процессе роста и созревания ооцитов. Выделить в чистом виде Gi-
белок с целью сравнения структуры этого белка с аналогичным белком
позвоночных животных.
5. Изучить механизм снижения уровня циклических нуклеотидов и оценить
роль аденилатциклазы при индукции созревания.
Научная новизна и теоретическое значение работы
Впервые установлено, что после разрушения мембраны зародышевого пузырька развитие ооцитов повторно блокируется в гонаде на стадии
6 метафазы первого деления мейоза под действием факторов выделяемых клетками гонады.
Впервые в ооцитах морских звезд, кроме Gs и G„ идентифицированы еще два типа регуляторных белков, Gq и Gi2. Белок типа G)2 локализован в цитоплазме ооцита, a Gq связан с мембраной. Синтез а-субъединиц белков всех типов начинается на ранних стадиях оогенеза. По мере роста ооцитов меняется количественное соотношение белков Gs И G;.
Доказано наличие двух механизмов гормональной регуляции аденилатциклазы в ооцитах морских звезд: а) стимулирующего аденилатциклазную систему варианта, характерного для эффекта медиаторов моноаминергической системы и включающего идентифицированный $-адренорецептор, Gj-белок и аденилатциклазу; б) ингибирующего варианта с участием 1-метиладенинового рецептора, G.-белка и аденилатциклазы.
Впервые установлено, что падение уровня цАМФ при индукции созревания происходит в результате ингибирования аденилатциклазы. Механизм действия 1-метиладенина описывается следующей схемой: рецептор <=> С-белок => Оо^-ГТФ-субъединица => аденилатциклаза i1^ цАМФІ.
Впервые в ооцитах морских звезд выявлен спектриноподобный белок. Установлено, что изменения распределения актина и спектрина в процессе созревания ооцитов коррелирует со структурными перестройками ооцита, в частности, с изменением характера поверхности ооцитов и деполимеризацией цитоскелета, поддерживающего аппарат микроворсинок. Выявлена ко-локализация актина, спектрина и активированной а-субъединицы G, белка, что может свидетельствовать о вовлечении этого белка в процесс перестройки актинового цитоскелета.
На основании собственных и литературных данных предложена пшотетическая схема ранних событий, происходящих в ооците в момент снятия профазного блока мейоза. Практическое значение работы
7 В связи с проблемами искусственного воспроизводства исчезающих и редких видов животных организмов информация, касающаяся механизмов гормональной регуляции роста и созревания, имеет важное прикладное значение. Известно, что система «гормон - механизм реализации его действия в клетке» возникла рано в ходе эволюции, и молекулярные механизмы ее функционирования сравнительно мало и медленно меняются, а наиболее общие из них отличаются исключительной консервативностью. В связи с этим, ооциты иглокожих могут служить модельным объектом для исследований действия разных биологически активных веществ на процесс мейоза. Познание этих процессов открывает перспективы для поиска природных факторов, контролирующих клеточный цикл и открытие новых аигимитотических компонентов. Ооциты и гонады морских звезд могут служить источником для получения препаратов, обладающих антимитотическими и пролиферативными свойствами. Основные положения работы, выносимые на защиту
1. В процессе роста,ооцитов морских звезд в поверхностной мембране
происходит формирование функционально-активной аденилатциклазной
системы двух типов. Аденилатциклаза стимулирующего типа осуществляет
моноаминергическую регуляцию роста ооцитов, а аденилатциклаза
ингибирующего типа принимает участие в процессе индукции созревания.
Основные типы гетеротримерных ГТФ-связывающих регуляторных белков (G-белков) синтезируются на ранних стадиях оогенеза. Существует специфичность взаимодействия рецепторов 1-метиладенина и 0-адренорецепторов с G-белками.
Развитие ооцитов морских звезд повторно блокируется в гонаде на стадии метафазы первого деления мейоза.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Советско-финском симпозиуме по биологии развития «Сигнальные молекулы и клеточная дифференцировка» (Суздаль, 1991), на Международной конференции «Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий» (Санкт-
g Петербург, 1992), на Международной конференции по иглокожим (Дижон, Франция, 1993), на Международном конгрессе по репродукции беспозвоночных животных (Санта-Круз, США, 1995), на 1-ом Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Кроме того, результаты диссертации обсуждались на межлабораторных семинарах и отчетных годовых сессиях Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН. Публикации результатов работы
По теме диссертации опубликовано 16 статей, из них 5 статей в зарубежных и 11 статей в рецензированных отечественных научных журналах.
Работа выполнена в Лаборатории фармакологии Института биологии моря им. Жирмунского ДВО РАН. Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии. Отдельные этапы работы выполнялись в соавторстве с сотрудниками ряда лабораторий Института биологии моря и сотрудниками Лаборатории биохимии мембранных рецепторов Института физиологии Чешской академии наук. Структура и объем работы
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения и выводов. Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и включает 11 таблиц и 46 рисунков. Список литературы содержит 341 источник, из них 24 отечественных и 317 иностранных.
Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией фармакологии Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН д.б.н. Ю.С. Хотимченко за инициацию данных исследований, моральную поддержку и всестороннюю помощь. Автор благодарит за участие в работе всех соавторов.
9 Часть работы выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 96-04-50061, 96-04-48284, 01-04-49440), гранта ДВО (К2003-РЗ-ГрА-СО6-ИБМ) и гранта ДВО-РФФИ (№ 06-04-96039), а также Комитета по молекулярной и клеточной биологии ЮНЕСКО (грант 204/98/0474).
