Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 8
1.1 Роль инозитол (1,4,5)-трисфосфата(ІпвРз) в передаче внутриклеточного сигнала. 8
1.2 Структура и функции рецептора InsP3 11
1.2.1 Локализация и типы рецептора ІПБРЗ 11
1.2.2 Молекулярная структура InsP3R 12
1.2.3 Функциональные свойства InsP3R 16
1.2.4 Факторы, влияющие на активацию InsPzR. 18
1.3 Рианодиновый рецептор 19
1.4 СаМ- кальций- зависимый белок 23
1.4.1 Структура и функции СаМ 23
1.4.2 Действие СаМ на вход Са2+через потенциал -зависимые Са2+- каналы 24
1.4.3 Действие СаМ на выход Са2+ через рианодиновые рецепторы(РуРз) 25
1.4.4 Действие СаМ на ІПБРЗ -индуцированный вход кальция 25
1.5 Депо-управляемый вход кальция в клетку. 26
1.6 Каналы, активируемые выбросом кальция: CRAC . 27
1.7 Каналы семейства TRP. 29
1.8 Гипотезы о механизме регуляции
депо-зависимых кальциевых каналов. 32
1.9 Конформационное сопряжение. 32
1.10 Низкопроводящие кальциевые каналы Imin 34
1.11 Регистрация внутриклеточной концентрации
кальция с помощью флуоресцентных зондов. 39
2 Материалы и методы 41
2.1 Клетки 41
2.2 Материалы 42
2.3 Получение рекомбинантных бакуловирусов. 43
2.4 Регистрация ионных токов и обработка экспериментальных данные 44
2.5 Экспрессия и очистка рекомбинантного белка InsP3R-N-His 45
2.6 Анализ связывания с [3Н]1пэРз 46
2.7 Анализ связывания с [125I] ShPIP2 47
2.8 Эксперименты на бислойной липидной мембране 47
2.9 Регистрация внутриклеточной концентрации кальция 48
3 Результаты и обсуждение 51
3.1 Специфическое связывание 1ПБРЗ& С ІПБРЗ, аденофостином A (AdА), а также антагонистом InsP3R - водорастворимым PIP2. 51
3.2 Роль лиганд-связывающего домена ІпзРзР. в регуляции активности Im-m каналов . 57
3.3 Роль высоко-аффинного кальций-зависимого сайта связывания с СаМ в регуляторном домене ІпзРзК. 60
3.3.1 Мутация W1577А в InsP3R крысы отменяет кальций-зависимое взаимодействие с СаМ, 62
3.3.2 Модулирование активности рекомбинантного InsP3R цитозольным кальцием. 64
3.3.3 Роль кальмодулина в модулировании активности рекомбинантного InsP3R цитозольным кальцием. 65
3.3.4 Ингибирование InsP3R кальмодулином. 70
Выводы 72
Благодарности 73
Список работ, опубликованных
По теме диссертации 74
Список литературы 75
- Структура и функции рецептора InsP3
- Каналы, активируемые выбросом кальция: CRAC
- Регистрация ионных токов и обработка экспериментальных данные
- Роль лиганд-связывающего домена ІпзРзР. в регуляции активности Im-m каналов
Введение к работе
Общая характеристика работы.
Актуальность проблемы.
Кальций является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке таких, как: секреция, сокращение, пролиферация и генная регуляция. Передача физиологически важных сигналов от рецепторов плазматической мембраны к внутриклеточным структурам осуществляется путём повышения концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме ([Ca2+]j). В невозбудимых клетках рецептор-индуцированные изменения [Ca2+]i обычно включают две составляющие: быстрое, кратковременное высвобождение Са2+ из Са2+-депо (представленных эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или его субкомпартментами) и последующий медленный, но продолжительный вход Са2+ из внеклеточной среды. Рецепторы, сопряженные с G-белками или тирозиновыми киназами, активируют фосфолипазу С (PLC). Активированная PLC гидролизует мембраносвязанный фосфолипид - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (РІРг), в результате чего образуется водорастворимый инозитол-1,4,5-трисфосфат (InsP3) и диацил глицерин (DAG). Связывание InsP3 с рецептором инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP3R), являющимся катионным каналом эндоплазматического ретикулума, приводит к высвобождению Са2+ из внутриклеточных депо. Хотя механизм выброса Са2+ из внутриклеточных депо достаточно хорошо изучен, механизмы, регулирующие связывание іпбРз с рецептором, а также молекулярная организация данного комплекса продолжают вызывать интерес.
Важнейшим свойством ІпєРзРч является бифазная регуляция его активности цитозольным кальцием [Bezprozvanny et a\.r 1991], Именно это свойство рецептора определяет пространственно-временной ход кальциевой волны в клетке. Считается, что одним из способов данной регуляции является взаимодействие InsP3R с кальций-связывающим
5 белком кальмодулином через высоко-аффинный кальций-зависимый сайт расположенный в регуляторном домене InsP3R [Michikawa et al., 1999].
В результате опустошения Са2+-депо (понижения концентрации свободных ионов Са2+ в депо) активируются депо-управляемые катионные (SOC) каналы, обеспечивающие вход Са2+ в клетку. Благодаря входу Са2+ его концентрация в цитоплазме поддерживается длительное время (вплоть до нескольких десятков минут) на высоком уровне, что приводит к запуску Са2+-зависимых сигнальных каскадов, а также к восстановлению запасов Са2+ в депо [Parekh, Реппег, 1997; Putney, Bird, 1993].
Одна из основных моделей активации SOC-каналов подразумевает белок-белковое взаимодействие между InsP3R эндоплазматического ретикулума и SOC-каналами плазматической мембраны [Parekh, Реппег, 1997; Berridge, 1995; Putney et а\., 2002]. Однако до конца остается неясным, каким образом сигнал о понижении концентрации Са2+ в депо передается к каналам плазматической мембраны.
Изучение механизмов кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках требует детального исследования функциональных и биофизических свойств, как самого InsP3R, так и каналов, регуляция активности которых связана с іґібРзИ.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в исследовании особенностей
отдельных этапов передачи кальциевого сигнала в клетке через
рецептор инозитол-1,4,5-трисфосфата (іпбРзИ) мембраны
эндоплазматического ретикулума. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Провести сравнительный анализ специфичности связывания InsP3R с природным агонистом инозитол-1,4,5-трисфосфатом (InsP3), с синтетическим агонистом - аденофостином A (AdA), а также с антагонистом InsP3R - фосфотидилинозитол-4,5-бисфосфатом (Р1Р2).
Определить конкурентоспособность связывания InsP3R с агонистами ІпзРз и AdA и с его антагонистом Р1Р2.
Определить возможность активации кальциевых каналов плазматической мембраны при их взаимодействии с лигандсвязывающим доменом InsP3R.
Определить роль высоко-аффинного кальций-зависимого сайта связывания с кальмодулином (СаМ) регуляторного домена InsPaR в модуляции активности InsPaR.
Основные положения, выносимые на защиту.
Сайты связывания InsP3R с AdA и с Р1Р2, также, как и с InsP3 находятся в лигандсвязывающем домене іпбРзЯ.
Активация каналов Са2+ входа в клетках происходит путём прямого взаимодействия канала с лигандсвязывающим доменом InsPaR.
Высоко- аффинный Са2+-СаМ связывающий сайт в регуляторном домене InsPaR не играет существенной роли в регуляции активности InsP3R цитоплазматическим Са2+.
Научная новизна исследования.
В настоящей работе впервые показано, что сайты связывания іпйРзЯ с AdA и с Р1Р2, так же, как и с ІпєРз находятся в лигандсвязывающем домене InsPsR, что конкурентоспособность РІРг, при связывании с лигандсвязывающим доменом InsP3R такова, что Р1Р2 способен вытеснять ІпбРз при связывании с лигандсвязывающим доменом InsP3R, но InsP3 или AdA не способны полностью вытеснить Р1Р2, связанный с InsP3R. Впервые показано, что высоко-аффинный Са2+-СаМ-связывающий сайт в регуляторном домене InsP3R не играет существенной роли в регуляции активности InsP3R цитоплазматическим Са2+ .
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные результаты важны для понимания механизма регуляции поступления Са2+ в клетку и роли InsPaR в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор-управляемого входа
7 ионов Са2+ в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, поможет решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных функций живой клетки. Полученные данные могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических препаратов.
Структура и функции рецептора InsP3
При исследовании связывания рецепторов 1пэРз (InsPsR) с радиоактивным InsP3 наибольшая плотность рецепторов была обнаружена в различных отделах мозга, в особенности, в мозжечке [Worley et al., 1987]. Специфическое связывание радиоактивного InsP3 было также показано при работе с микросомами различных периферических тканей, однако плотность рецепторов оказалась в них в среднем в 100 раз меньше, чем в мозжечке. InsP3R найдены в гладких мышцах [Chadwick et aL, 1990], печени [Pietri et af.f 1990], коре надпочечников [Guillemette et aL, 1990] и ооцитах [Parys, et a!,, 1992]. Многочисленные наблюдения ІпвРз-индуцированного выброса Са2+ из внутриклеточных депо в различных типах клеток позволили расширить этот список еще дальше. Использование метода связывания lnsP3R с радиоактивным ІпзРз в качестве специфического маркера позволило выделить InsP3R в виде индивидуального белка. В настоящее время InsP3R выделен и очищен из клеток мозжечка, гладкомышечных клеток и тромбоцитов. Очищенный рецептор является гликозилированным протеином (гликопротеином). Методами молекулярного клонирования обнаружено три изоформы InsPsR, которые кодируются разными генами. Основное отличие между изоформами InsP3R заключается в их аффинности к InsP3: InsP3R2 InsP3Rl InsP3R3 [Parys et aL, 1996]. На данный момент, наиболее изученным типом InsP3 рецепторов является изоформа 1. InsP3Rl на 62-68% гомологичен InsP3R 2 и 3 изоформе [Yoshida, їтаі, 1997]. Кроме того, изоформа 2 и изоформа 3 InsP3R показывают более ограниченное распределение в тканях, и их экспрессия, в большинстве случаев, находится на более низком уровне, чем экспрессия IP3R1. Поэтому основные характеристики и свойства в дальнейшем будут касаться, преимущественно, InsP3Rl.
Схемы изоформ InsP3R представлены на рис.3. Изоформа 1 рецептора InsP3 состоит из 2749 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 313 кДа. Изоформа 2 состоит из 2701 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 307 кДа, 68% процентов ее последовательности тождественны изоформе 1 InsP3R [Sudhof et aL, 1991]. Изоформа 3 InsP3R состоит из 2670 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 304 кДа, 62% её аминокислотной последовательности тождественны изоформе 1 и 64% изоформе рецептора InsP3 [Yamamoto-Hino et al., 1994]. Лиганд-связывающий домен является наиболее консервативным участком молекулы рецептора, в то время как регуляторный домен является менее консервативным, что и позволяет предполагать различие в регуляции этих трех изоформ InsP3R. Показаны места фосфорилирования, связывания АТР, кальмодулина и кальция. По [Wilcox et al.,1998], с изменениями.
Наибольшая плотность изоформы 1 InsP3R найдена в клетках Пуркинье и поэтому основные молекулярные свойства были изучены на рецепторах, полученных из клеток мозжечка. Кроме того, изоформа 1 была обнаружена в обонятельных нейронах, в коре головного мозга, в некоторых клетках гиппокампа [Furuichi, Simon-Chazottes, 1993], а также в гладкомышечных клетках, тромбоцитах и многих других, но в небольших количествах [Newton et at., 1994]. Изоформа 2 и изоформа 3 рецептора InsP3 имеют гораздо меньшее распространение. Методом иммуноблоттинга было показано, что изоформа 2 экспресс и руется в клетках печени, поджелудочной железы, легкого, селезенки и в небольших количествах в клетках мозга, включая мозжечок. Изоформа 3 экспрессируется в клетках поджелудочной железы, легкого, почек, мозга. Экспрессия ІпзРзК не имеет жёсткой тканевой специфичности, но всё же во многих типах клеток присутствует практически только один его тип [Sugiyama et al., 1994; Wojdkiewicz, 1995] Например, в клетках А431 и астроцитах [Holtzdaw et al., 2002] была обнаружена только 2 изоформа, а для клеток Пуркинье характерно очень высокое содержание изоформы І ІПБРЗЯ [Yamada et al., 1994].
Аминокислотная последовательность InsP3R высоко консервативна, между рецепторами мыши и крысы различие выявлено только в 21 аминокислотном остатке из 2749. Структурно и функционально молекула рецептора делится на три основные части: лиганд связывающий [ЧНг-концевой домен, занимающий примерно 24% молекулы; СООН-концевой участок, формирующий Са2+-канал (16%), и регуляторный домен, расположенный между двумя концевыми участками (около 60%), обеспечивающий сопрягающую и модулирующую функцию рецептора (рис.3) [Mignery, Sudhof, 1990].
Каналы, активируемые выбросом кальция: CRAC
Наиболее распространенными и тщательно исследованными среди SOC-каналов являются CRAC- ("calcium release-activated calcium") каналы, обладающие очень высокой селективностью для Са2+, по отношению к другим катионам. Впервые токи Са2+ через эти каналы (ICRAC), активирующиеся при опустошении Са2+-хранилищ, были описаны Хосом и Пеннером [Hoth ег а!., 1997]. Благодаря использованию пэтч-кламп техники, им удалось охарактеризовать ICRAC В тучных клетках крысы. Ранее были опубликованы данные о подобных токах Са2+ в тучных клетках крысы (в ответ на увеличение концентрации lnsP3) [Patterson et at., 1999] и в T клетках линии Jurkat (активируемые при высоких концентрациях хелатора Са2+ - ВАРТА, либо при стимуляции митогенным лектином - фитогеммаглитинином) [Lepple-Wienhues, 1996], но не было показано, что они активируются в ответ на опустошение Са2+-хранилищ. Проводимость одиночных каналов, рассчитанная на основе анализа шумов ICRAC, оказалась очень низка, много меньше 1 пСм [Hoth, Реппег, 1992]. Более точные оценки проводимости данных токов для Са2+ через одиночные каналы дают величину 21-24 фСм [Pike et а!., 1998, Zubov et al., 1999]. Это почти на 3 порядка меньше проводимости, типичной для большинства ионных каналов. ICRAC проявляют идентичные свойства независимо от способа опустошения Са2+-хранилищ.
Несмотря на то, что активация ICRAC не зависит от мембранного потенциала, наблюдаемая вольтамперная характеристика данных каналов имеет относительно большие токи при отрицательных потенциалах и потенциал реверсии больше +50 мВ [Hoth et al., 1997; Prakriya et ai., 2002]. При стандартной регистрации ICRAC, когда на мембрану подают напряжение, линейно изменяющееся с -100 мВ до +100 мВ, наблюдается входящее выпрямление в области отрицательных потенциалов. Частично это объясняется ассиметричностью используемой концентрации Са2+ (обычно 10 мМ Са2+ снаружи клетки и 1-100 нМ Са2+ внутри клетки) и Са2+-зависимой инактивацией ICRAC [Parekh et ai., 1997]. Как говорилось выше, CRAC-каналы обладают высокой селективностью для Са2+ (что подтверждается высоким положительным потенциалом реверсии). В присутствии внеклеточного Са2+, изменение концентрации Na+ снаружи клетки практически не влияло на ICRAC [Hoth, Реппег, 1992; Lee et а!., 1996]. Более того, CRAC-каналы в тучных и в RBL (rat basophilic leukemia) клетках, по-видимому, более селективны для Са2+ по отношению к Na+, чем потенциал-управляемые каналы, для которых соотношение Pca/PNa составляет не менее 1000/1 [Hofe et al., 1998; Parekh et al., 1997]. Данные каналы более селективны для Са2+ и по отношению к другим двухвалентным катионам. Так для тучных клеток крысы и для Т лимфоцитов линии Jurkat был показан следующий ряд селективности CRAC каналов: Са2+ Ва2+ Sr2+ [Hoth, Реппег, 1992; Zubov, et ai., 1999].
Двухвалентные катионы оказывают на ток Са2+ через CRAC каналы (ICRAC) дозо-зависимый и обратимый ингибиторный эффект в следующей последовательности (для 1 мМ): Ва2+ Sr2+ Ni2+ Mn2+ « Со2+ Ве2+ Cd2+ Zn2+ [Hoth, Penner, 1992]. Для Mg2+ в пределах концентрации 0-12 мМ было показано лишь незначительное влияние на амплитуду ICRAC- В то же время La3+ еще в большей степени, чем Zn2+ способен блокировать ICRAC. Так уже при концентрации La3+ 10 мкМ амплитуда ICRAC уменьшается на 94 ± 3 % [Hoth, Penner, 1992], что также является характерным свойством CRAC каналов. Следует отметить, что более тщательное исследование проницаемости CRAC-каналов для Са2+ и Ва2+ в тучных, RBL клетках и Т лимфоцитах (Jurkat) показало/ что отношение амплитуды токов Ва2+ к токам Са2+ (WIca) зависит от потенциала и от типа клеток [Hofer et af.f 1998]. Более того, при сильно отрицательных потенциалах наблюдается эффект «аномальной мольной доли», при котором изоосмотическая смена ионов Са2+ на ионы Ва2+ вначале (когда в растворе присутствует смесь ионов) приводит к спаду ICRAC, а затем снова к повышению его величины Хотя CRAC каналы и являются высокоселективными каналами для Са2+ по отношению к Na+, они, как и потенциал-управляемые Са2+ каналы, в отсутствии двухвалентных катионов во внеклеточной среде ("divalent-free" (DVF) условия) становятся проницаемыми для Na+. Проводимость каналов CRAC первоначально оценили, как близкую к 1 пСм [Hoth, Penner, 1992]. Каналы, идентичные каналам CRAC, были впоследствии обнаружены в лимфоцитах человека и базофилах крысы. В работе на Т-лимфоцитах, с использованием методики «анализа шума тока» была получена проводимость каналов CRAC близкая к 24 фСм [Zweifach, Lewis, 1993] Поэтому в настоящее время общепринятым является мнение, что регистрация CRAC на уровне одиночных каналов невозможна. В последнее время большой интерес, в плане исследования входа Са2+ в клетку, привлекает TRP-семейство ионных каналов. Считается, что, по крайней мере, некоторые члены этого семейства могут отвечать за депо-управляемый вход Са2+ [Clapham et al., 2002; Gregory et a I., 1999]. Первоначально TRP-каналы были идентифицированы как необходимый компонент системы фотопередачи сигнала в Drosophila melanogaster. Каскад фотопередачи сигнала в фоторецепторных клетках Drosophila основан на входе Са2+ в клетку, вызванном активацией PLC. Активация мембранно-связанного белка родопсина квантами света приводит к запуску сигнального каскада, сопряженного с G-белками. В результате происходит активация PLCp, которая, гидролизуя ,Р1Рг, приводит к активации катион-проницаемых каналов и деполяризации мембраны. Механизм активации этих каналов до сих пор неизвестен. Данные каналы высоко проницаемы для Са2+ и кодируются, по крайней мере, двумя генами - trp и его гомологом trpl, идентичных на 40 % [Gregory et at., 1999; Hardie, 2001; Montei et al,, 2002]. Ген trp кодирует Са2+-селективный ионный канал с проводимостью около 8 пСм и отношением проницаемостей Рса/Риа 100:1, в то время как trpl кодирует неселективный катионный канал с проводимостью 40 пСм и Рса/Риа «4:1 [Rebechi, Pentyala, 2000].
По-видимому, TRP и TRPL, имея 6 трансмембранных спиралей, образуют одну из субъединиц тетрамерного канала, который, вероятно, может быть образован из гомо- или гетеромерных субъединиц [Rebechi, Pentyala, 2000; Voets etat, 2001]. Аналогично большинству Са2+-каналов (в том числе и CRAC-каналам), TRP- и TRPL-каналы подвергаются быстрой Са2+-инактивации, обеспечивающей механизм отрицательной обратной связи. Возможно, в этом принимает участие кальмодулин, т.к. TRP- и TRPL-каналы содержат для него сайты связывания [Gregory et al., 1999]. В клетках млекопитающих было обнаружено около 20 изоформ белков семейства TRP, разделенных на несколько подгрупп [Clapham, 2002; Hardie, Mlnke, 1992]. Они широко распространены в тканях млекопитающих, но их физиологические функции еще неизвестны. Каналы TRP-семейства вовлечены в ответ клетки на температуру, боль, окислительный стресс, изменение осмотического давления, гормоны,
Регистрация ионных токов и обработка экспериментальных данные
В работе использовали метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в конфигурации inside-out - фрагмент мембраны, ограниченный плотным контактом с микропипеткой, изолируется от клеточной поверхности, что открывает доступ к внутриклеточной поверхности плазматической мембраны. Потенциал внеклеточного раствора принимали за нулевой. Микропипетки изготавливали из мягкого молибденового стекла и покрывали силиконовой резиной Sylgard (Dow Corning, США). Электрическое сопротивление заполненных раствором пипеток составляло 8-20 МОм. Микропипетки заполняли раствором 105 мМ ВаС12, 10 мМ Tris-HCI. Присутствие ионов Ва2+ способствовало предотвращению активации Са-зависимых и блокированию потенциал-зависимых калиевых каналов [Mozhayeva, Naumov, Kuryshev, 1989]. Использование Ва2+ как носителя заряда призвано также было исключить возможную Са-зависимую инактивацию входящего тока. В начале эксперимента стёкла с прикреплёнными клетками помещали в экспериментальную камеру, заполненную стандартным внеклеточным раствором (140 мМ NaCI, 5 мМ KCI, 10 мМ HEPES/KOH, 2 мМ СаСЬ). При регистрации ионных каналов на изолированном фрагменте мембраны раствор заменяли на «внутриклеточный» (140 мМ глутамат К, 5 мМ NaCI, 1 мМ МдСЬ, 10 мМ HEPES/KOH, 1,13 мМ СаС12, 2 мМ EGTA, рН 7,4), в котором изолировали фрагмент мембраны и проводили регистрацию токов. Подачу свежеприготовленных растворов производили путем перфузии камеры 3-5-кратным объемом, что обеспечивало полную смену раствора менее чем за 300 мс. Токи регистрировали при помощи ира И-с1атр"-усилителя с сопротивлением обратной связи 10 ГОм, фильтровали б-полюсным фильтром Бесселя с частотой среза 0.3 кГц и вводили в ЭВМ через аналого-цифровой преобразователь (частота считывания 1-2 кГц). Обработку результатов производили при помощи пакета программ, позволяющих производить цифровую фильтрацию записей, графическое представление токов, фиксирование событий с использованием критерия 50% порога амплитуды, определение амплитуд токов, вероятностей открывания и кинетических параметров каналов.
Для количественной оценки степени активности каналов (конфигурации cell-attached, inside-out) использовали величину NPo/ т.е. произведение количества проводящих единиц (N) в данном фрагменте записи на величину вероятности пребывания проводящей единицы в открытом состоянии (Ро). NPo определялась из следующего уравнения: NPo=I/b где I - среднее значение тока через мембранный фрагмент на данном временном интервале, і - амплитуда тока через одиночный канал. Для сравнительного анализа использовали Ро, измеренную в течение 30 секундного интервала, когда активность каналов была максимальна (mNPo). Для оцифровки и анализа записей использовали программное обеспечение, написанное сотрудником лаборатории (Алексеенко Б.А.) и пакеты программ PCIamp 6.0.4, Microcal Origin 6.0, Microsoft Excel. Приведенные в тексте данные представлены средними арифметическими значениями и их среднеквадратичными отклонениями, приведённые в работе доверительные интервалы соответствуют доверительной вероятности 0.95. Белок GST-InsP3R-N-His экспрессировали в 1 литре 2xYT среды 18 часов при комнатной температуре в штамме Е. coli - BL21,отличающемся устойчивостью к протеазам. Индукцию проводили добавлением 0.7 мМ IPTG. Клеточную суспензию охлаждали на льду, центрифугировали 10 минут при 5000 об/мин (Beckman JA-10), осадок ресуспендировали в 50 мл имидазольного буфера (50 мМ имидазол рН 6.8, 100 мМ NaCI, 10 мМ EDTA, 1 мМ DTT) с добавлением 1 мг/мл лизоцима и протеазных ингибиторов (1 мг/мл леопептина, 200 мкг/мл апротинина, 1 мМ PMSF). Далее клетки разрушали ультразвуком на приборе Branson Ultrasonics (5 30 сек, 0С) при 80% мощности. Полученный лизат центрифугировали 30 минут при 15000 об/мин, 4С, затем концентрировали в атмосфере азота через фильтры Amicon YM50. Концентрированный лизат наносили на гель-фильтрационную колонку Sephadex-200 (Pharmacia), предварительно уравновешенную имидазольным буфером. Фракции, содержащие GST-InsP3R-i\bHis белок, были собраны (60-100 мл) и проинкубированы с глютадионовыми агарозными гранулами (1 мл) в течение 12 часов при 4С. Агарозные гранулы осаждали в микроцентрифуге 3 минуты при 2500 об/мин, трижды промывали низкосолевым буфером (20 мМ имидазола рН6.8, 100 мМ NaCI, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT), один раз высокосолевым буфером (20 мМ имидазола рН 6.8, 1 М NaCI, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT) и один раз фосфатным буфером (PBS). Отмытые агарозные гранулы ресуспендировали в 5 мл PBS и инкубировали с 20 единицами тромбина в течение 5-6 часов в "переворотном" шейкере.
После полного тромбинового расщепления шарики осаждали в микроцентрифуге, а супернатант смешивали с гистидиновыми (Ніз)-агарозньіми гранулами (0,5 мл) и инкубировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCI, рН 7.9, 5 мМ имидазола, 0.5 М NaCI в течение 30 минут в "переворотном" шейкере. His-агарозные гранулы осаждали в микроцентрифуге, промывали тем же буфером. InsP3R-IM-His белок элюировали 10 мл буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCI, рН 7.9, 500 мМ имидазола, 0.5 М NaCI. Элюат диализировали (14000 MWCO, Spectrum) против 2 л PBS в течение 12 часов при 4С. Полученный белок хранился при 4С. Специфическое связывание с радиоактивным [3H]InsPs выполняли согласно ранее описанной методике [Lupu et a!.f 1998]. Для этого: 10-20 мкг выделенного белка Insp3R-N-His. инкубировали 10 мин на льду в связывающем буфере (50 мМ Tris-HCI, рН 8.3, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 100 мМ NaCI) с различными количествами гидрофильного ShPIP2, lnsP3, AdA. После чего, добавляли 10 мкМ [3H]InsP3, преципитировали с 12% пол и этилен гликоля (PEG) и 1.2 мг у-глобулина и осаждали при 14000д.
Роль лиганд-связывающего домена ІпзРзР. в регуляции активности Im-m каналов
Как уже говорилось ранее, в кальциевом ответе клетки на внешний стимул выделяют две фазы: вслед за опустошением внутриклеточных кальциевых депо вследствие связывания ЇПБРЗ С InsP3R, следует вторая фаза кальциевого сигнала - вход ионов кальция из внеклеточной среды в клетку через депо-управляемые каналы. В клетках А431 депо-управляемый вход Са2+ опосредуется двумя типами каналов - ICRAC И Imin [Gusev, Glouchankova et al., 2003]. Поскольку проводимость ICRAC каналов чрезвычайно мала, в опытах на изолированных фрагментах плазматической мембраны клеток А431 в условиях опустошения депо возможна регистрация только Imjn каналов. Ранее было показано, что активность Imin каналов в плазматической мембране регулируется прямым взаимодействием с InsP3R, расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума, и это происходит лишь в том случае, когда InsP3R связан с ІПБРЗ [Zubov et. al., 1999]. Основываясь на необходимости связи ІпєРз с рецептором, мы предположили, что именно лиганд-связывающий домен InsP3R играет определяющую роль в активации Imin каналов.
Для проверки этого предположения мы использовали также как и в предыдущей части работы, экспрессированный в бактериях E.coli, очищенный рекомбинантный белок - фрагмент рецептора 1ПБРЗГ включающий в себя со 2 по 604 аминокислоты (InsP3R-N), являющийся участком, ответственным за связывание рецептора со своим лигандом. Для контрольных экспериментов был также сконструирован и экспрессирован в бактериях белок InsP3R-N, в котором аминокислота лизин в позиции 508 заменена на аргинин (InsP3R-N-K508R), поскольку лизин в позиции 508 играет критическую роль для связывания InsP3 [Yoshikawa et al., 1996.; Bosanac et al., 2002]. Оказалось, что при экспрессии в бактериях оба белка образуют нерастворимые конгломераты. Поэтому, для возможности проведения функциональных экспериментов мы выделяли эту фракцию, растворяли в концентрированной мочевине (8 М) и затем проводили рефолдинг белка быстрым добавлением большого объема буфера. Затем белок концентрировали и диализировали против PBS. Белок в таком виде использовали в электрофизиологических и биохимических экспериментах. Оба рекомбинантных белка были проверены на связывание с [3H]InsP3. Только InsP3R-N связывал ІПБРЗ с теми же параметрами, что и полноразмерный InsP3R {данные не показаны). Для исследования функциональной роли этих белков использовали следующий протокол экспериментов. Если после изоляции мембранного фрагмента при переходе в inside-out конфигурацию метода patch-clamp, добавление InsP3 в искусственный внутриклеточный раствор, вызывало большую активность Ітіп каналов, то сменой раствора добивались ее прекращения, если же активность каналов либо была мала, либо не наблюдалась, то продолжали эксперимент без дополнительных смен. В 70% экспериментов добавление InsP3R-N во внутриклеточный раствор, содержащий InsP3, вызывало появление или усиление активности Imin каналов (рис. 16).
Свойства каналов, вызванных аппликацией InsP3R-N и InsP3, полностью совпадали со свойствами Imin, описанными ранее \Zubov et al., 1999; Kaznacheyeva et at., 2000]. Проводимость каналов равнялась 1,5 пСм при использовании 105 мМ Ва2+ в качестве проникающего катиона (рис. 16). Активность каналов наблюдалась только в присутствии InsP3. Так добавление в раствор InsP3R-N без ІПБРЗ НИ В ОДНОМ эксперименте не вызывал активности каналов (рис. 17А). То есть, присутствие InsP3 необходимо для ІпБРзРх-ІМ-зависимой активации 1тщ. Однако, действительно ли связывание InsP3 с InsP3R-N важно для наблюдаемого эффекта? Для решения этого вопроса был использован белок InsP3R-N-K508R. Таким образом можно утверждать, что активация каналов Са2+ входа происходит путем взаимодействия молекулы канала в ПМ и молекулы рецептора InsP3 эндоплазматического ретикулума через ІЛБРЗ-связывающий домен 1пэРзЯ и это происходит лишь в том случае, когда рецептор связан с ІПБРЗ. Наши данные согласуются с результатами, полученными для каналов TRPC3. Для данных каналов было показано прямое взаимодействие молекулы канала в плазматической мембране и молекулы рецептора 1пэРз эндоплазматического ретикулума через лиганд-связывающий домен InsP3R [Kiselyov et aL, 1999b]
Одной из важнейших функций ионов кальция в клетке является регуляция активности рецептора инозитол (1,4,5)-трисфосфата (InsP3R). Однако механизмы и факторы, отвечающие за эту регуляцию, остаются до конца неизученными. Процесс активации InsPsR происходит в присутствии ІпзРз при непосредственном взаимодействии ионов кальция с Са2+-чувствительными участками рецептора [Miyakawa et at., 2001]. Предполагалось, что СаМ, связываясь с InsP3R играет роль сенсора кальция и ответственен за зависимость активности рецептора от концентрации кальция в цитозоле [Michikawa eta!., 1999]. Тот факт, что экзогенное приложение СаМ ингибирует активность ІПБРЗЯ, показан многими авторами [Sipma et al., 1999; Pate! et al., 1997; Cardy et a\., 1998]. Известно также, что в регуляторном домене InsP3R находится высоко-аффинный кальций-зависимый сайт связывания с СаМ, существование которого было показано в биохимических экспериментах [Yamada et al., 1995]. Логично было предположить, что данный высокоаффинный кальций-зависимый сайт связывания с Сам в регуляторном домене InsP3R непосредственно связан с бифазным регулированием активности ІпзРзК ионами кальция и с ингибированием этой активности кальмодулином. Следующей задачей, поставленной в настоящей работе, было изучение роли данного сайта в модулировании активности InsP3R. Для решения поставленной задачи, мы использовали рекомбинантные белки так называемого "дикого типа" InsPsR крысы, относящегося к изоформе 1 рецептора, и мутированную форму этого рецептора, в которой триптофан в позиции 1577 заменён на аланин (W1577A). Известно, что данная замена в регуляторном домене рецептора отменяет Са2+-зависимое связывание InsP3R изоформы 1 мыши с кальмодулином [Yamada et al., 1995]. В экспериментах мы сравнили зависимость активности InsPsR и его мутированной формы W1577A от концентрации Са2+ ([Са2+]0. Также оценили изменения этой зависимости в присутствие экзогенного СаМ и его антагониста - N-(6-аминогексил)-5-хлоро-1-нафтален-сульфонамид (W7). Общая схема этой части работы состояла в следующем: белки InsP3R либо W1577A экспрессировали в клетках насекомых (Sf-9) при помощи рекомбинантных бакуловирусов. Из инфицированных клеток выделяли микросомы, содержащие большое количество исследуемых белков. Микросомы использовали как в биохимических экспериментах,
