Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одним из первичных и общих для всех типов клеток ответов на внеклеточную стимуляцию является повышение концентрации ионов Са2+ в цитозоле, реализующееся как высокоорганизованный в пространстве и времени кальциевый сигнал, наименее ясным звеном которого остается рецептор-индуцировашплй вход ионов Са21", сопровождающий выброс кальция из внутриклеточных депо.
Известно, что выброс Са + из депо осуществляется после связывания (1,4,5)-трифосфата (1Рз) с рецептором (ТРзЮ. расположенным в мембране эндоплазматического ретикулума. П?з мобилизует Са2+ из ретикулума, увеличивая концентрацию свободного внутриклеточного Са2+ в цитозоле ([Ca2+]j) как за счет опустошения кальциевых депо, так и за счет последующей активации входа Са2+ из наружной среды в клетку. Существуют экспериментальные данные о том, что 1Рз-зависимый вход Са2+ опосредуется особым типом высокоселективных Са2+-каналов низкой проводимости, активация которых регулируется состоянием Са2+-депо, которые по мере их опустошения от кальция посылают сигнал к плазматической мембране клеток и запускают его вход внутрь клетки («емкостная модель» входа Са2+) [Putney 1990; Putney, Bird 1993]. В пользу этой модели свидетельствуют данные о регистрации кальциевых токов (/вас) в условиях принудительного опустошения внутриклеточных кальциевых хранилищ [Hoth., Penner 1993; LuckhofT, Clapham 1994]. Природа сигнала, поставляющего к мембране сведения о степени заполнения депо Са2+, неизвестна и остается предметом дискуссий. В качестве возможных причин рассматриваются как формирование некоего водорастворимого мессенджера (CBF) [Parekh, Terlau 1993], так и передача сигнала благодаря конформациошшм изменениям IP3R и прямому взаимодействию его с кальциевыми каналами, расположенными в плазматической мембране (coupling model) [Berridge, 1995]. Свойства мембранных каналов, активируемых выбросом кальция - «Са2+ release-activated current» - CRAC [Hoth and Penner, 1992] в значительной степени охарактеризованы: они высокоселективны для Са2+, активируются при гиперполяризащш мембраны, инактиви-
руїотся внутриклеточным Са и обладают уникально низкой проводимостью (от фСм до 1 пСм), вследствие чего их идентификация на уровне измерений токов через одиночные каналы признана невозможной. Основным аргументом "депо-зависимости" CRAC-каналов являются данные о том, что их активация возможна при опустошении депо путем ингибирования эндосомальных АТФаз, без повышения концентрации 1Рз. С другой стороны появляются новые дшшые о способности ГРз непосредственно активировать Са2+-псреносящие каналы в плазматической мембране со свойствами подобными CRAC-каналам [Kiselyov et al., 1997]. Свойства CRAC-каналов, связь между процессами опустошения Са2+ депо и запуском Са2+ входа, участие в этом процессе активации рецептора 1Р3, взаимодействие IP3R и кальций-переносящих каналов - это основные, проблемы кальциевой сигнализации. Исследование функциональных характеристик ПУ чувствительных кальциевых каналов в плазматической мембране и механизмов их регуляции позволит решить вопрос о ключевых звеньях в формировании кальциевого ответа клетки на стимуляцию рецепторов кальций-мобилизующими агентами (гормонами, ростовыми факторами и пр.).
Цели и задачи исследования. Цель данной работы состояла в исследовании участия в кальциевом сигнале Са2+-переносявтих ионных каналов, способных непосредственно активироваться инозитол (1,4,5)-трифосфатом (ГР3) и обеспечивать вход Са2+ во время ответа клетки на рецепторный стимул. Были поставлены следующие задачи:
-
Изучить возможность ЕР3 -зависимой активации кальций-переносящих каналов в клетках перитонеальных макрофагов мыши.
-
Определить основные биофизические характеристики 1Р3-чувствительных каналов: проводимость, селективность по отношению к двухвалентным и одновалентным катионам, зависимость от мембранного потенциала.
-
Исследовать зависимость активности каналов от концентрации П"3.
-
Исследовать влияние на активность ГР3-чувствительных кальциевых каналов блокаторов 1Р3-рецепторов эндоплазматического ретикулума - гепарина и ара-хидоновой кислоты.
5. Определить механизмы активации и регуляции исследуемых каналов.
Научная новизна исследования. Впервые описаны кальциевые каналы в мембране перитонеальных макрофагов мыши, активирующиеся непосредственно инозитол (1,4,5)- трифосфатом (1Р3) с циггоплазматической поверхности мембранного фрагмента.
Установлено, что исследуемые каналы высоко селективны для Са2+, имеют уникально низкую проводимость; характеризуются повышением активности при гиперполяризации мембраны. Эти свойства сближают идентифицированные в плазматической мембране макрофагов каналы с каналами, чувствительными к опустошению внутриклеточных Са21 депо (CRAC-каналами). Определены ре-цепторные характеристики этих каналов; дозо-завясимость эффекта [Р3, ГРэ-зазясимачг десенситизашга рецептора, ингибирование гепарином, ингибирующее влияние арахидоновой кислоты. Сходства рецепторных характеристик исследуемых каналов с известными свойствами рецептора IP? эндоплазматического ретикулума позволяют предполагать возмошгость регуляции обнаруженных каналов через активацию этого рецептора..
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты важны для понимания сложного механизма регуляции поступления Са^+ а клетку и роли инозитоя (1,4,5) --пшфосфата в этом процессе. Анализ полученных результатов свидетельствует в пользу справедливости конформационной модели передачи сигнала при запуске рецептор- управляемого входа ионов Са""' в невозбудимых клетках. Выяснение биохимических и биофизических механизмов рецептор-зависимой передачи кальциевого сигнала, запускающего основные физиологические функции, приведет к решению таких проблем как нарушение дифференцировки, пролиферации, секреции и других жизненно важных фуіік-ций живой клетки.
Апробация работы.
Основные положеіпія работы доложены и обсуждены на: симпозиуме «Мембранный транспорт и функции клетки» (Санкт-Петербург, 1994), 41 Съезде Биофизического общества США (Новый Орлеан, 1997), Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), 33 Интернациональном Конгрессе фи-
экологических наук (Санкт-Петербург, 1997), заседании общегородского семинара «Молекулярные подходы к изучению физиологических процессов» (Санкт-Петербург, 1998).
Объем и структура диссертации.
