Введение к работе
Актуальность проблемы. В клетках высших эукариот ионы кальция являются универсальным вторичным посредником в сложной цепи передачи сигнала от рецептора на плазматической мембране к внутриклеточным эффекторным структурам. Изменение концентрации свободного цитоплазматического кальция ([Ca"+]i) является сигналом, регулирующим множество жизненно-важных для клетки процессов, таких как возбуждение, сокращение, секреция, активация метаболизма и синтеза ДНК, деление.
Все клетки, в соответствии с функциональным назначением и тканевой специфичностью, имеют в своем распоряжении набор механизмов поступления Са"+ в цитоплазму; при этом строго регулируется количество и скорость поступления ионов, а также распределение Са+ между внутриклеточными структурами. Уровень [Са +h в невозбудимых клетках - результат тонкого динамического равновесия между поступлением Са2<" из внеклеточной среды через плазматическую мембрану и его транспортом из цитоплазмы. Стимуляция клеток агонистами вызывает смещение этого равновесия и в большинстве случаев приводит к увеличению [Са~+];. Рост [Ca2+j; может быть обеспечен как за счет выброса Са2+ из внутриклеточных источников, так и за счет входа Са2+ из внеклеточной среды через плазматическую мембрану (Putney, 1987; Berridge, Irvine, 1989).
Известно, что вход Са2* в электровозбудимых клетках происходит через хорошо изученные потенциал-управляемые Са24 каналы L, Т, N, Р и R типов (Reuter, 1986). L и Т типы кальциевых каналов были обнаружены также в некоторых невозбудимых клетках (Hackshaw, Shi, 1994; Bossu et al., 1992; Nilius et al., 1985).
Однако, исследования последних лет свидетельствуют о том, что поступление Са2+ через плазматическую мембрану в невозбудимых клетках происходит, в основном, за счет рецептор-зависимого входа, осуществляемого семейством каналов, отличных по своим свойствам и механизмам регуляции от потенциал-управляемых ионных каналов. Литературные данные свидетельствуют о возможности участия ГТФ-связывающих белков (G-белков) в процессе рецептор-зависимой модуляции активности ионных каналов плазматической мембраны.
Использование метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) в электрофизиологических исследованиях позволило охарактеризовать большое количество Са2+-проницаемых каналов, участвующих в обеспечении рецептор-зависимого входа Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток. В частности, при исследовании влияния фосфонуклеотидов на мембрану перитонеальных макрофагов была обнаружена Ргг-рецептор-зависимая
активация катионного тока при внеклеточном приложении микромолярных концентраций АТФ (ATP) (Naumov et al., 1992, 1995).
Однако, данные о путях рецептор-зависимого поступления кальция на уровне одиночных каналов косят фрагментарный характер. Дальнейшее детальное исследование рецептор-управляемого входа ионов Са2+ через плазматическую мембрану невозбудимых клеток необходимо для получения целостного представлення о механизмах внутриклеточной сигнализации.
Объектом исследования в настоящей работе были выбраны макрофаги. Неоспоримым преимуществом макрофагов как объекта электрофнзиологических исследований является то, что плазматическая мембрана этих клеток содержит большое число различных рецепторов, а кальциевый сигнал (временное увеличение концентрации свободного цитоплазматического Са2+) в них в значительной степени определяется входом Са'+ из внеклеточной среды (Alonso-Тогте, Trautmann, 1993).
Цель и залачи исследования. Цель данной работы состояла в изучении механизмов активации и регуляции АТФ-икдуцируемых Са +-переносящих ионных каналов плазматической мембраны перитонеальных макрофагов крысы.
Были посташтены следующие экспериментальные задачи;
1. Выяснить возможность участия G-белков в процессе активации рецептор-
зависимого входа Са2+ в ответ на внеклеточное приложение АТФ.
2. Исследовать зависимость активности и проводящих свойств АТФ-
чувствительных Са2+-переносящих каналов плазматической мембраны
макрофагов от наружной и внутриклеточной концентрации кальция.
3. Определить роль подсостояний проводимости в обеспечении рецептор-
индуцнрованного входа ионов Са2+ через плазматическую мембрану
перитонеальных макрофагов крысы.
Научная новиэня подученных результатов. В результате проведенной работы впервые показано участие G-белка в процессе активации Са ^-переносящих каналов при действии АТФ на пуринорецептор Ры типа.
Охарактеризованы подсостояния канала с различными уровнями проводішости. Впервые на уровне измерений тока через одиночные каналы обнаружено ингибирование каналов при повышении [Са +]j в физиологическом диапазоне (10"6 - 10"8 М), что позволяет предположить существование отрицательной обратной связи в процессе рецептор-управляемого входа кальция в клетку. Показано, что уменьшение среднего тока при повышении [Ca2+]i происходит благодаря перераспределению подуровней проводимости: канал начинает функционировать с большей вероятностью на низко проводящих подуровнях.
О существовании подуровней проводимости для некоторых типов ионных каналов сообщалось ранее, однако вьгаодов о физиологаческой роли этого
феномена сделано не было. Данные настоящей работы позволяют заключить, что подсостояння канала могут выступать в роли тонкого регулятора поступления Са+ через плазматическую мембрану во время рецептор-нндуцированного входа Са"+ в клетку.
Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о вовлечении G-белков в процесс активации АТФ-индуцированных Са + - селективных каналов, что подтверждает мнение о том, что G-белки являются универсальными модуляторами активности различных ионных каналов. Обнаружение отрицательной обратной связи в процессе рецептор-управляемого входа кальция в клетку важно для понимания функциональной роли ионных каналов клеточных мембран.
Реализация нескольких проводящих подсостояний - достаточно общий принцип работы Са2+-переносящих каналов в плазматической мембране невозбудимых клеток. Результаты .настоящей работы могут быть использованы при изучении механизмов ионной проницаемости клеточных и модельных липидных мембран.
Полученные данные о функциональных свойствах АТФ-индуцированных ГТФ-зависимых Са +-селективных каналов могут быть использованы при разработке и тестировании фармакологических веществ. Результаты могут быть полезны для понимания механизмов действия и эффектов применения в терапии Са"+-мобнлизующих лекарственных препаратов.
Апробация работы. Материаты диссертации докладывались на: конференции Физиологического Общества Великобритании (Абердин, 1994), симпозиуме "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994), 39 конференции Биофизического общества США (Сан-Франциско, 1995), конференции Европейского Научного Фонда "Молекулярная нейробиолошя", (Италия, 1995), конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические н биофизические механизмы физиологических функций", (С-Петербург, 1995), совместном семинаре лабораторий Физиологии и Молекулярной Биологии Университета г. Леувен (Бельгия, 1996), нескольких международных школах для молодых ученых и научных семинарах Лаборатории Ионных Каналов Клеточных Мембран Института цитологии РАН. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и Методов исследования, Результатов, Обсуждения результатов, Вьшодов и Списка литературы, содержащего публикаций. Работа изложена на страницах машинописного текста и иллюстрирована рисунками.
