Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1 Роль альфа-синуклеина в патофизиологических механизмах болезни Паркинсона 14
1.1.1. Характеристика Болезни Паркинсона и других синуклеопатий 14
1.1.2. Болезнь Паркинсона и мутации в гене aльфа- синуклеина 15
1.1.3. Биохимическая структура альфа-синуклеина 17
1.1.4. Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация 20
1.2 Клеточные механизмы нейровоспаления 24
1.2.1. Отличительные особенности нейровоспаления 24
1.2.2. Микроглия как ключевой участник нейровоспалительного процесса 26
1.2.3. Роль астроглии в нейровоспалении 29
1.2.4. Реакции клеточных элементов гематоэнцефалического барьера на 35 нейровоспаление
1.2.4.1.. Эндотелий 36
1.2.4.2. Перициты 37
1.2.5 Вовлеченность мигрирующих в нервную ткань лимфоцитов в 41
нейровоспалительные процессы
1.2.6. Концепция нейроваскулярной единицы 47
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 50
2.1. Организация исследования 50
2.2. Введение вирусного вектора, А-син и бактериального эндотоксина в 53 черную субстанцию мозга
2.3. Гистологический анализ 53
2.4. Электронномикроскопический анализ 54
2.5. Иммуногистохимический анализ 55
2.6. Подсчет клеток и плотности волокон 56
2.7. Измерение интенсивности флуоресцентного свечения 56
2.8. Биохимический анализ (Вестерн-блоттинг) 56
2.9. Статистический анализ 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1. Перенос рААВ в ДА-эргические нейроны черной субстанции мозга 58
3.2. Межвидовые различия способности гиперэкспрессированного в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы индуцировать нейродегенерацию
3.3. Гиперэкспрессия в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы вызывает образование в нейронах агрегатов А-син
3.4. Векторный перенос в ДА нейроны ЧС крыс гена А-син вызывает рост концентрации А-син и падение тирозингидроксилазы в стриатуме
3.5. Индукция повышенной экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС вызывает провоспалительную активацию м икроглиоцитов
3.6. Изменение фенотипа активированных микроглиоцитов зависит от интенсивности нейродегенерации
3.7. Индукция повышенной экспрессии уровней А-син в 77
дофаминергических нейронах черной субстанции вызывает
гиперэкспрессию глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах
3.8. Индукция повышенной экспрессии А-син в дофаминергических нейронах черной субстанции сопровождается сосудистой реакцией и инфильтрацией лимфоцитов в область введения вектора
3.9. Интраперитонеальное введение кортикостерона снижает интенсивность гибели дофаминергических нейронов, индуцированной введением в дофаминергические нейроны рекомбинантного гена А-син человека, нормализует уровень дофамина в стриатуме, но не влияет на экспрессию А-син А-син альфа-синуклеин
3.10. Унилатеральное введение ЛПС и А-син в ЧС индуцирует в области введения нейровоспаление (активацию микро- и астроглии, сосудистую реакцию и инфильтрацию лимфоцитов), но не вызывает выраженной нейродегенерации
3.11. Унилатеральное введение липополисахарида в ЧС вызывает дисфункцию А-син в ДА нейронах ЧС и дегенерацию синапсов в стриатуме
Заключение 104
Выводы 107
Список литературы
- Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация
- Введение вирусного вектора, А-син и бактериального эндотоксина в 53 черную субстанцию мозга
- Индукция повышенной экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС вызывает провоспалительную активацию м икроглиоцитов
- Индукция повышенной экспрессии А-син в дофаминергических нейронах черной субстанции сопровождается сосудистой реакцией и инфильтрацией лимфоцитов в область введения вектора
Агрегация альфа-синуклеина и нейродегенерация
Болезнь Паркинсона (БП) – это нейродегенеративное заболевание, занимающее второе место по частоте после болезни Альцгеймера. В большинстве популяций мира болезнью Паркинсона страдает не менее 1% всех лиц старше 50 лет [Polymeropoulos M.H. et al., 1996] и 2-4% старше 65 лет [de Rijk M.C. et al., 1997]. Важно отметить, что в последние десятилетия наблюдается рост числа больных БП и снижение возраста дебюта заболевания [Kontakos N., Stokes J., 1999].
Заболевание имеет неуклонно прогрессирующее течение и характеризуется классической тетрадой симптомов – низкочастотным тремором в состоянии покоя, ригидностью скелетных мышц конечностей и лица (пластический гипертонус), пониженной двигательной активностью (брадикинезией) и постуральной неустойчивостью [Fahn S., Sulzer D., 2004]. Нарастающая симптоматика приводит к полной обездвиженности пациентов. Нейродегенеративные изменения наблюдаются в дофаминэргических нейронах компактной части черной субстанции и, в меньшей степени, базальных ядрах, покрышке среднего мозга, голубом ядре. На более поздних стадиях развития заболевания процессы дегенерации распространяются на кору больших полушарий [Forno L.S., 1996]. По мере прогрессирования болезни патологические изменения этих структур вызывают манифестацию вторичных симптомов, таких как депрессия, деменция, различные вегетативные и сенсорные дисфункции.
Независимо от этиологии, моторные симптомы БП коррелируют с гибелью дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции среднего мозга, ведущей к резкому снижению концентрации дофамина в стриатуме (полосатом теле), и появлением в цитоплазме нейронов черной субстанции, гипоталамуса, гиппокампа, подкорковых ганглиев эозинофильных включений (телец Леви). Гибель нейронов черной субстанции, а так же присутствие в них телец Леви – это патоморфологические признаки, отличающие болезнь Паркинсона от других нейродегенеративных заболеваний.
Основная часть случаев БП, за исключением семейных форм, относится к категории спорадических, мультифакторных нейродегенеративных заболеваний. Семейная форма болезни Паркинсона впервые была описана в начале двадцатого века. В настоящее время положительный семейный анамнез наблюдается у 10-15% больных [Nussbaum R.L., Polymeropoulos M.H., 1997]. Выявлено около 12 генов, мутации которых вызывают развитие признаков БП [Литвиненко И.В., 2010]. Различают аутосомно-доминантный (АД) и аутосомно-рецессивный (АР) типы наследования моногенных форм БП.
Аутосомно-рецессивная ювенильная форма паркинсонизма обусловлена дефектами гена паркина (локус PARK2) на шестой хромосоме человека в позиции 6q25.2-q27 [Matsumine H. et al., 1997]. Аутосомно-рецессивная форма паркинсонизма вызывается дефектами гена DJ-1 (локус PARK7 на 1 хромосоме человека в позиции 1p36) [Van Duijn C.M. et al., 2001].
Аутосомно-доминантная форма паркинсонизма обусловлена точечной мутацией в 93 кодоне (ile-met) в гене убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1) [Leroy E. et al, 1998; Lincoln S. еt al., 1999], которая является компонентом телец Леви. Данный фермент участвует в протеолизе белков, а мутация, нарушая этот процесс, приводит к агрегации протеинов.
В 1997 г были публикованы результаты молекулярно-генетического исследования нескольких семей со специфической аутосомно-доминантной наследуемой формой болезни Паркинсона, характеризующейся появлением клинических симптомов в относительно раннем возрасте (от 33-58 лет) [Polymeropoulos M.H. et al., 1997]. Предыдущий медико-генетический анализ этих семей показал высокую степень пенетрантности (около 85%), что свидетельствовало о вероятном моногенном характере наследуемого дефекта. Был выявлен генетический маркер в области 4q21-q23, сегрегирующий с фенотипическим проявлением заболевания [Nussbaum R.L., Polymeropoulos M.H., 1997]. Еще более детальный анализ рекомбинаций дополнительных генетических маркеров в одной из итальянских семей позволил сузить вероятный локус БП до 6 сМ. YAC-клоны, перекрывающие данный локус, содержали в том числе и ген, кодирующий альфа-синуклеин (А-син).
Анализ первичной структуры этого гена у страдающих БП и здоровых членов итальянской семьи показал миссенс-мутацию – точечную нуклеотидную замену в четвертом экзоне (G209A), приводящую к замене аланина на треонин в положении 53 кодируемого белка (A53T). Мутация G209A была обнаружена еще в трех греческих семьях с наследуемой "ранней" формой PD и вновь только у больных индивидуумов. Ни среди больных спонтанной, ненаследуемой формой БП, ни среди здоровых людей из тех же средиземноморских популяций, что и исследованные семьи, такая мутация не обнаружена. Было показано, что мутантный аллель транскрипционно активен, что предполагает продукцию мутантного А53Т А-син в нейронах больных данной формой PD [Polymeropoulos M.H. et al, 1997]. Таким образом, впервые и чрезвычайно убедительно была показана связь точечной мутации определенного белка с одним из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний.
Позднее в гене А-син были обнаружены еще две миссенс мутации - А30Р в семье из Германии [Krger R. et al, 1998] и E46K в испанской семье [Zarranz J.J. et al., 2004]. Но в целом, точечные мутации в гене А-син, как причина болезни Пакинсона, встречаются крайне редко (в настоящее время описано не более 15 семей с БП, ассоциированной с точечными мутациями SNCA), и в ряде исследований скрининг большого числа больных с ранней семейной формой болезни Паркинсона не выявил патогенетически значимых мутаций [Chance P.F. et al., 1998; Parsian A. et al., 1998; Warner T.T., Schapira A.H., 1998; Vaughan J. et al., 1998].
Введение вирусного вектора, А-син и бактериального эндотоксина в 53 черную субстанцию мозга
Крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, освобождали поверхность черепа от мягких тканей и при помощи бормашины высверливали отверстие по координатам: 5,2 мм каудальней брегмы и 2 мм латеральней осевого шва (справа). При помощи стереотаксического аппарата вводили стеклянную микроканюлю с диаметром кончика 100 мкм на глубину 7,2 мм вентральней уровня твердой мозговой оболочки. Медленно инъецировали 2 мкл раствора вектора, А-син (Sigma, USA) в концентрации 15 нгр/мл и липополисахарида Escherichia Coli (Sigma, USA) в концентрации 0,01мкг/мкл, стерильного физиологического раствора, оставляли канюлю во введенном положении еще на пять минут, после чего медленно извлекали ее из мозга.
В работе использовались векторы, сконструированные в лаборатории молекулярной и клеточной терапии Университета Флориды, любезно предоставленные для проведения наших экспериментов: рААВ А-син крысы (1,4х1012 МЕ/мл), рААВ А-син человека (1,4х1012 МЕ/мл), рААВ ЗФБ (1,4х1012 МЕ/мл). Конструктивной особенностью использованных векторов было включение в них промотера бета-актина курицы в сочетании с энхансером цитомегаловирусного промотера [Xu et al., 2001].
Крысы дополнительной группы после введения рААВ А-син в область ЧС получали на протяжении восьми недель интраперитонеальные инъекции ацетата кортикостерона-21 (Sigma, USA; 2 мг /100 г веса тела) , разведенно г о в 1 мл стерильного физраствора с интервалом в три дня. Для гистологического и биохимического анализа мозг животных отбирали через 4 и 8 недель после введения векторов и через 8 недель после введения А-син или ЛПС.
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 4% парафармальдегидом, приготовленном на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) (рН 7,2-7,4). Извлекали мозг, постфиксировали в том же фиксирующем растворе в течение ночи, отмывали в ЗФР, дегидратировали в батарее спиртов восходящей концентрации, выдерживали в термостате при 56С в растворе хлороформ-парафин, трех сменах парафина (Гистомикс 200) и заливали в парафиновые блоки. Срезы, полученные на микротоме (Reinchart, Ger) толщиной 7 мкм наклеивали на предметные стекла, покрытые желатиной, и окрашивали 1% раствором крезилового фиолетового.
Анализ изображений, полученных в совмещенной с микроскопом Nikon Eclipse E200 фотоприставке Nikon PowerShut 600, проводили при помощи морфометрических программ ImagePro Plus 6.0 и ImagePro Insight (Media Cybernetics, USA) c учетом рекомендаций по оптимизации подсчета клеток [Хаиндрова В.Г, и др., 2010]. Коррекция цветопередачи и нанесение пояснительных надписей для используемых в тексте диссертации иллюстраций проводили при помощи программы Photoshop 6.0 (Adobe, USA).
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 2,5% раствором глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4). Извлекали мозг, изготавливали срезы, содержащие стриатум толщиной 1 мм, постфиксировали в том же фиксирующем растворе в течение двух часов и далее после отмывки в ЗФР выдерживали в 2 % р-ре OsO4 на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) в течение 12 часов при +4С. После дегидратации в спиртах восходящей концентрации и абсолютном ацетоне заливали в три смены смеси эпоксидных смол в ацетоне (Аралдит М + DDSA) с нарастающим содержанием смол. Финальная заливка осуществлялась с добавлением в смолы катализатора DMP-30. Полимеризацию образцов проводили при 60С в течение трех суток. Затачивали блоки на центральную область стриатума, получали полутонкие и ультратонкие срезы на ультрамикротоме (Сумы), монтировали срезы на сеточки, которые затем контрастировали в уранилацетате и цитрате свинца по Рейнольдсу. Изучали изображения и получали фотографические снимки в электронном микроскопе. После оцифровывания фотографий проводили подсчет дегенерированных синапсов на стандартной площадке (1280 мкм2) в программе ImagePro Insight (Media Cybernetics, USA).
Под эфирным наркозом животных перфузировали через восходящую аорту физиологическим раствором на фосфатном буфере (ЗФР), затем 4% парафармальдегидом, приготовленном на ЗФР. Извлеченный мозг постфиксировали в том же фиксирующем растворе в течение 2-х часов, переносили на сутки в 25% раствор сахарозы и замораживали на сухом льду. При помощи криотома (Shandon Cryotom E; Eng) получали серийные срезы мозга толщиной 14 мкм и монтировали их на предметных стеклах Superfrost Plus (Fisher Scientific, USA). Для иммуногистохимического окрашивания использовали антитела против тирозингидроксилазы (мышиные IgG, 1:1000; Millipore), везикулярного моноаминового транспортера-2 (VMAT-2) (кроличьи IgG, 1:5000; Chemicon), альфа-синуклеина человека (мышиные IgG, 1:2000; Sigma), нейронального ядерного маркера (NeuN) (мышиные IgG, 1:2000; Sigma), белка главного комплекса гистосовместимости второго типа (МНСII) (мышиные IgG, 1:1000; Abcam), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (мышиные IgG, 1:1000; Abcam), кластера дифференцировки лимфоцитов (CD3) (мышиные IgG, 1:1000; Abcam), транскрипционного фактора FoxP3 (мышиные IgG, 1:1000; Abcam). Срезы отмывались в ЗФР трижды после каждого этапа инкубации. Все инкубационные растворы содержали 0,25% Triton X-100. Перед окрашиванием срезы выдерживались в течение 10 минут в смеси 3% H2O2/10% метанол. После отмывки в ЗФР срезы инкубировали 2 часа в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина, затем в первичных антителах в течение суток при комнатной температуре. Для визуализации первых антител, связавшихся с тканевыми антигенами, использовали вторые антитела, конъюгированные либо с пероксидазой хрена, либо с люминесцентным красителем. В первом случае срезы инкубировали в течение часа при комнатной температуре в растворах биотинилированных антимышинных антител осла (в разведении 1:200) (BA2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA) и в течение 20-ти минут в растворе, содержащем авидин-биотин-пероксидазный комплекс (ABC Elite; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Для двойной и тройной флуоресцентной иммуногистохимической окраски в качестве вторых антител использовали антитела, коньюгированные с FITC, Alexa Fluor 488, 555 и 647 (1:500; Invitrogen). В ряде случаев докрашивали срезы люминесцентными ядерными красителями DAPI или пропидий йодидом, растворенными в с р е д е д л я заключения временных препаратов (Vectashield, CA).
Индукция повышенной экспрессии А-син в ДА нейронах ЧС вызывает провоспалительную активацию м икроглиоцитов
Последовательные срезы среднего мозга на уровне ЧС, меченные антителами к А-син (а; красное окрашивание), нейрональному ядерному маркеру NeuN (а; зеленое окроашивание) и тирозингидроксилазе (б) через 8 недель после унилатерального введения в ЧС рААВ А-син человека. ВТО – вентральная тегментальная область; ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Стрелками обозначена сторона введения вирусного вектора. Длина линии = 800 мкм.
Унилатеральное стереотаксическое введение рААВ вектора, содержащего рекомбинантный ген альфа-синуклеина (вне зависимости от видовой принадлежности), вызывало гиперэкспрессию иммунореактивного белка альфа-синуклеина в нейронах и нейрональных отростках ЧС, а также в волокнах, образующих широкий тракт, восходящий от ЧС в дорзо-латеральном направлении в той стороне мозга, куда производилось введение вектора (Рис.2а) на всех исследованных нами сроках эксперимента (4 и 8 недель). Вектор-индуцированная гиперэкспрессия А-син вызывала целый ряд морфологических изменений в области введения, вплоть до выраженной гибели дофаминергических нейронов (рис.2б).
Вышеописанные результаты свидетельствуют об эффективном переносе гена альфа-синуклеина при помощи выбранного серотипа аденоассоциированного вируса. Метод введения рекомбинантных векторов на основе аденоассоциированного вируса (рААВ) был разработан для переноса генов в различные ткани взрослых животных, в том числе и нейроны [Kaplitt M.G. et al., 1994; McCown T.J. et al., 1996; Flannery J.G. et al., 1997; Xiao X., et al., 1997].
В экспериментальной практике рААВ векторы используются для гиперэкспрессии генов [Kirik D. et al., 2002; Kirik D. et al., 2003], «нокдауна» генной экспрессии индукцией синтеза рибозимов, антисмысловых и малых РНК [Lewin A.S. et al., 1998; Elbashir S.M. et al., 2001; Fritz J.J. et al., 2002; Haberman R.P. et al., 2003; Tomar R.S. et al., 2003]. Это делает рААВ векторы удобным средством для экспериментального моделирования той или иной болезни [Qi X. et al., 2003] и генной терапии [Flotte T.R. et al., 2003; Flotte T.R. et al., 2004].
Для конструкции рААВ вектора нами был выбран второй серотип аденоассоциированного вируса (рААВ2), который обладает преимущественным тропизмом к нервным клеткам. Описано множество областей мозга, в нейроны которых осуществлен успешный перенос генов посредством рААВ2 [Kaplitt M.G. et al., 1994; McCown T.J. et al., 1996; Klein R.L. et al., 1998; Glatzel M. et al., 2000]. Вместе с тем отмечается, что иногда возможен перенос гена и в не нейрональные клетки [Davidson B.L. et al., 2000; Cucchiarini M. et al., 2003]. Кроме того, обнаружено, что рААВ2 не трансдуцируется в нейроны определенного фенотипа. Так, нейроны CA1–CA3 пирамидных слоев гиппокампа оказываются устойчивыми к заражению ААВ2 [Kaspar B.K. et al., 2002; Passini M.A. et al., 2002; Passini M.A. et al., 2003].
Визуальный анализ полученных нами срезов, не обнаруживших иных клеток кроме нейронов, экспрессирующих А-син, а также выявление значительного количества ДА-эргических нейронов, в которых был индуцирован синтез этого белка, свидетельствовал об успешности экспериментального переноса генов, основанного на эффективном подборе титра и серотипа вирусного вектора.
Даже функциональный недостаток векторов, сконструированных на основе рААВ, – относительно небольшой объем нервной ткани, подвергающейся заражению (для борьбы с которым исследователи вынуждены проводить множественные инъекции или дополнительно инъецировать маннитол или гепарин) [Ghodsi A. et al., 1999; Nguyen J.B. et al., 2001; Mastakov M.Y., et al., 2002], в нашем случае оказывается выигрышным. Низкая диффузия вирусного вектора в нервную ткань ограничивают его областью черной субстанции, имеющей сравнительно небольшие объемы, что позволяет говорить о локальной и специфической гиперпродукции А-син именно в нейронах ЧС.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об эффективности проводимой нами рААВ А-син трансфекции, точности попадания инъецируемого раствора в ЧС, об ограниченной диффузии вируса в нервную ткань, окружающую место введения, и выраженном нейротропизме используемого вектора.
Межвидовые различия способности гиперэкспрессированного в ДА-эргических нейронах А-син человека и крысы индуцировать нейродегенерацию
Через 4 и 8 недель после вирусной инъекции трансгена А-син человека и крысы в область ЧС в нигростриарной системе наблюдался целый ряд паталогических изменений. Подсчет ТГ-иммунопозитивных клеток через 4 недели после введения вектора несущего рекомбинантный ген А-син человека или крысы не обнаружил нейродегенерации ДА-эргических нейронов в группе животных, экспрессирующих А-син крысы, в отличие от группы, экспрессирующей А-син человека, где наблюдалось достоверное уменьшение количества нейронов в области введения вируса (62,3±13,2% относительно контрольной стороны) (Р 0,01). Через 8 недель после введения в нейроны ЧС крыс гена А-син человека количество
Индукция повышенной экспрессии А-син в дофаминергических нейронах черной субстанции сопровождается сосудистой реакцией и инфильтрацией лимфоцитов в область введения вектора
Интенсивное свечение иммунореактивного глиального фибриллярного кислого белка в отростках астроцитов, контактирующих с кровеносными сосудами, в ЧС через 8 недель после введения рААВ А-син человека (а), сочетаемое с накоплением в кровеносных сосудах и периваскулярных инфильтратах клеток с лимфоцитарным фенотипом (выделены стрелками) на серийных срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым (б). Звездочкой обозначен просвет сосуда. Длина линии= 100 мкм.
Это наблюдение может свидетельствовать о значительных функциональных изменениях гематоэнцефалического барьера в описываемых экспериментальных условиях. Примечательно, что окраска последующих серийных срезов мозга крезиловым фиолетовым продемонстрировала значительные морфологические изменения в таких сосудах. Они отличались увеличенным диаметром, накоплением в просвете и в непосредственной близости от стенки небольших клеток с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы, фенотип которых был схож с лимфоцитарным (рис.16б). Ранее исследователями было показано, что микроглиальная активация в повреждаемых областях мозга ведет к локальному повышению пропускной способности ГЭБ и инфильтрации в эти области лимфоцитов [Racke M.K. et al., 2000]. Значительная лимфоцитарная инфильтрация в ЧС наблюдается и при гиперэкспрессии в нейронах этой области А-син на стадии, предваряющей нейродегенерацию [Theodore S. et al., 2008]. Недавние исследования показали, что инфильтрирующие нервную ткань T-клетки оказывают повреждающее действие на нейроны посредством экспрессии FasL [Brochard V. et al., 2009]. Основываясь на результатах, показывающих, что FasL запускает продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами [Park D.R. et al., 2003], авторы полагают, что CD4+ Th FasL-опосредованная активация микроглиоцитов может участвовать в усилении нейровоспаления и нейродегенерации при БП [Brochard V. et al., 2009].
Подводя итог описанию морфофункциональных изменений черной субстанции, можно сделать вывод, что используемая модель векториндуцированной дегенерации нейронов, более полно и точно воспроизводит молекулярные механизмы этого заболевания по сравнению с известными на сегодняшний день [Козина Е.А. и др., 2010].
Интраперитонеальное введение кортикостерона снижает интенсивность гибели дофаминергических нейронов, индуцированной введением в дофаминергические нейроны рекомбинантного гена А-син человека.
Подсчет ДА-нейронов в группе животных с трансфецированным геном А-син человека, получавших регулярные инъекции кортикостерона, продемонстрировал его выраженный нейропротективный эффект (рис.17): количество выживших нейронов через 8 недель после переноса увеличивалось от 12,6±8,2% (у не получавших гормон) до 48,9±12,6% (P 0,01).
ТГ-иммунопозитивные нейроны в ЧС крыс через 8 недель после инъекции в ЧС рААВ ЗФР (а), рААВ А-син человека (б) и рААВ А-син человека с интраперитонеальным введением кортикостерона (в). ВТО – вентральная тегментальная область; ЧСк - компактная часть черной субстанции; ЧСр – ретикулярная часть черной субстанции. Длина линии=500 мкм.
Гормональная терапия животных с введением в ЧС рААВ А-син человека через 8 недель эксперимента не приводила к изменению концентрации А-син в пробах ипсилатерального стриатума по сравнению с животными, не получавшими инъекции кортикостерона, но вызывала достоверное снижение падения в них уровня ТГ (рис.6).
Полученные результаты свидетельствуют о нейропротективном эффекте вводимого глюкокортикоида. Это наблюдение согласуется с результатами экспериментов, установивших, что кортикостерон оказывает выраженный нейропротективный эффект, который опосредуется ингибированием активности микроглиальных клеток [Sugama S. et al., 2009; Sugama S. et al., 2013] за счет подавления экспрессии ими провоспалительных цитокинов [Sapolsky R.M. et al., 2000].
Вместе с тем, нельзя отрицать возможности того, что действие кортикостерона может быть как прямым, в виде непосредственного ингибирования провоспалительной активности микроглиоцитов, так и опосредованным через ингибирование клеточного и гуморального ответа иммунной системы и/или снижении реактивных изменений клеток стенки кровеносных сосудов.
Унилатеральное введение ЛПС и А-син в ЧС индуцирует в области введения нейровоспаление (активацию микроглиоцитов и астроцитов, сосудистую реакцию и инфильтрацию лимфоцитов), но не вызывает выраженной нейродегенерации
