Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность к направленному передвижению и поддержанию поляризованной формы является фундаментальным свойством животных клеток. На движении клеток основаны многие процессы в организме: морфогенетические миграции во время эмбрионального развития, передвижение нервных клеток при формировании нервной системы, хемотаксические перемещения клеток крови и иммунной системы и движение фибробластов в процессе заживления раны (Lauffenburger and Horwitz, 1996; Hangan et al., 1997; Montell, 1999).
Движущаяся клетка обладает поляризованной формой - у нее выделяют передний (ведущий) край, выдвигающийся вперед в направлении движения клетки, стабильные боковые края и задний край (хвост), втягивающийся при движении клетки (Abercrombie, 1978; Cramer et al., 1997). Процесс движения клетки довольно долго изучался и изучается в различных лабораториях. Эти исследования позволили установить, что способность клетки к передвижению и поддержанию поляризации обеспечивается ее цитоскелетом - системами актиновых филаментов и микротрубочек (Васильев и др., 1973; Vasiliev, 1991; Mitchison and Cramer, 1995; Mogilner and Oster, 1996; Cramer et al., 1997; Pollard et al., 2000; Pantaloni et al., 2001).
В процессе движения клетки выделяют несколько фаз. Сначала в направлении движения клетки происходит выдвижение ламеллы - клетка удлиняется. Затем к новому положению ведущего края подтягивается тело клетки с ядром, и происходит вытягивание хвоста. Цикл завершается втягиванием хвоста (Wen-Tien Chen, 1981, Lauffenburger and Horwitz, 1996). Выдвижение ламеллы, инициирующее движение большинства клеток, происходит за счет полимеризации актиновых филаментов, и этот процесс регулируется рядом белков. Большинству типов клеток для направленного движения наряду с актиновой системой необходимы микротрубочки. Однако роль системы микротрубочек в этом процессе до конца не определена -считается, что при формировании ведущего края микротрубочки полимеризуются в направлении полимеризации актиновых филаментов, однако до сих пор не ясна их роль в процессе подтягивания тела клетки и втягивания хвоста. Относительно роли микротрубочек в движении клетки известно, что они участвуют в поддержании поляризованной формы фибробласта, организуют внутриклеточный транспорт, направляя перемещение органелл и везикул по ламелле к переднему краю клетки
(Rodionov et al, 1993; Bershadsky and Futerman, 1994; Wacker et al, 1997). При подавлении транспорта полярность клетки нарушается, и фибробласт перестает ползти (Rodionov et al, 1993).
Анализ литературных данных показал, что локомоция клеток изучалась в основном на фиксированных препаратах или с помощью цейтраферной съемки с существенными интервалами между кадрами, что не позволяет заметить всех изменений на ведущем крае. Так же известно, что системы микротрубочек и актиновых филаментов тесно взаимосвязаны для выполнения такой функции в клетке, как выдвижение ламеллоподии и дальнейшее движение, однако исследованию этой взаимосвязи на живых клетках уделялось очень небольшое внимание. В связи с этим, целью данной работы было прижизненное исследование динамических характеристик ведущего края фибробластов. А так же выяснить, какие элементы цитоскелета (системы микротрубочек и актиновых филаментов) и как влияют на динамические процессы, происходящие на ведущем крае. В работе были поставлены следующие задачи:
Проанализировать прижизненное поведение ведущего края фибробластов во времени.
Описать изменения морфологии клеток, систем микротрубочек и пучков микрофиламентов при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае с помощью BDM (2,3-бутандионмоноксим).
Изучить в динамике поведение ведущего края фибробластов при замедлении полимеризации актиновых филаментов.
Изучить динамические изменения поведения ведущего края фибробластов при деполимеризации микротрубочек.
Исследовать изменение поведения фибробластов под воздействием BDM при уже разрушенных микрофиламентах.
Изучить поведение клеток в ответ на действие BDM при деполимеризации микротрубочек и их восстановлении.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые было показано, что структура ведущего края фибробластов неоднородна. В его составе можно выделить активные области, на которых происходит выдвижение
ламеллоподий и их втягивание, и спокойные области. Втягивающаяся область может выдвигаться снова, а может стать спокойной областью. Спокойная область плоская, на ней не происходит ни втягивания, ни выдвижения края. Граница между активной и спокойной областями остается постоянной в секундной шкале времени. Стабильный край, в отличие от спокойной области на ведущем крае - всегда вогнутый, не имеет распластанной ламеллы и остается таковым в часовой шкале времени. Эти характеристики, по-видимому, универсальны для фибробластов. Они изменяются при различных цитостатических воздействиях.
Также впервые было показано, что без системы микротрубочек в клетке не происходит втягивание активного края.
Было проанализировано восстановление систем актиновых филаментов и микротрубочек в различных условиях. Показано постепенное перераспределение гипертрофированных актиновых пучков в цитоплазме клетки при снятии воздействия нокодазола в системы пучков (стресс-фибрилл) и ламеллярную сеть.
Полученные данные могут быть использованы в лекционных курсах, предназначенных для студентов и аспирантов, специализирующихся в области клеточной биологии.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии 19 октября 2006 года. Результаты работы были представлены на научных конференциях: Всероссийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Россия, 2000; "40th American Society for Cell Biology Annual Meeting", San Francisco, USA, 2000; 17th European Cvtoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, August 31- September 4, 2002; "1-й Съезд Общества клеточной биологии", Санкт-Петербург, Россия, 2003; Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре», 17-19 октября. Санкт-Петербург, Россия. 2006
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Структура работы
