Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 15
1.1 Катехоламины в эмбриогенезе рыб 15
1.2 Нейрохимические механизмы стресса 19
1.3 Роль нейрофармакологических воздействий на катехоламинергическую систему в регуляции социального поведения 23
1.4. Катехоламины в групповом поведении территориальных рыб 28
Глава II. Материал и методы исследований 31
2.1 Физиолого-микроскопическая установка для инъекций 31
2.2 Количественное определение уровня веществ катехоламинового ряда 33
2.3 Регистрация двигательных процессов в икре рыб и в ранний постэмбриональный период 35
2.4 Математическая обработка данных регистрации двигательных процессов 37
2.5 Изучение действия катехоламинергических соединений и динамики катехоламинов в эмбриогенезе 38
2.6 Гистохимическая окраска катехоламинергических клеток 40
2.7 Исследование динамики катехоламинов у личинок и мальков в различных поведенческих ситуациях 41
2.8 Исследование роли катехоламинергической системы и динамики катехоламинов в межсамцовых взаимодействиях в нерепродуктивный период 42
2.9 Изучение роли катехоламинергической системы и динамики катехоламинов в процессе борьбы за самку, образования пары и воспитании семьи 43
Глава III. Сравнительный анализ эмбрионального и раннего постэмбрионального развития рыб с различной социальной структурой поведения на взрослых стадиях 45
3.1. Эмбриональная моторика интактных рыб из разных экологических групп 45
3.1.1 Рост эмбриона на стадии асинхронных делений 46
3.1.2 Сократительная активность структур эмбрион 46
3.1.3 Сердечный ритм эмбрионов в процессе развития 48
3.1.4 Движения зародышей в икре, размеры свободных эмбрионов и длительность эмбриогенеза 48
3.1.5 Разделение потомства рыб на две группы по уровню катехоламинов 51
3.1.6 Роль химических взаимодействий икринок в кладке в дифференциации эмбрионов на две фенотипические группы 53
3.2. Развитие катехоламинреактивности в эмбриональный период 56
3.2.1 Нейрофармакология катехоламинергических механизмов эмбриональной моторики 56
3.2.2 Морфологические изменения свободных эмбрионов рыб как результат фармакологического воздействия 61
3.3. Этологические последствия фармакологических воздействий на КА-ергическую систему в эмбриогенезе 63
3.4. Катехоламинергическая регуляция развития первичных поведенческих реакций (плавательной активности) свободных эмбрионов 65
3.4.1. Развитие плавательных движений у предличинок из интактной икры 65
3.4.2. Развитие плавательных движений у предличинок сразу после выхода из икры после ее обработки различными фармакологическими агентами катехоламинергического действия 67
3.4.3. Развитие плавательных движений у предличинок через 12 часов после выхода из икры и их обработки различными фармакологическими агентами 69
3.5. Обсуждение 70
Глава IV. Развитие катехоламинергическои системы у личинок и мальков в связи с развитием поведенческих реакций 83
4.1. Личинки рыб, которым свойственна забота о потомстве 83
4.2. Личинки рыб, без заботы о потомстве 84
4.2.1 Этологические механизмы расселения молоди рыб с мест нереста 84
4.2.2 Динамика катехоламинов у личинок рыб в период их миграции 86
- Роль нейрофармакологических воздействий на катехоламинергическую систему в регуляции социального поведения
- Количественное определение уровня веществ катехоламинового ряда
- Движения зародышей в икре, размеры свободных эмбрионов и длительность эмбриогенеза
- Личинки рыб, без заботы о потомстве
Введение к работе
В течение долгих десятилетий ученых всего мира волнуют вопросы возникновения и развития живых систем. Эти исследования проводятся как на организменном уровне, так и на системном и клеточном. Возникновению новых систем и модификациям на основе одних и тех же химических веществ, образованию новых связей сигнальными молекулами и изменением их функций посвящено огромное количество работ, выполненных практически на всех типах живых организмов. Однако даже у наиболее примитивно устроенных животных неизвестны полностью механизмы регуляции жизнедеятельности и поведения. Сложное взаимовлияние отдельных сигнальных молекул, зависимость ответов организма от концентраций веществ и невозможность идентификации отдельного поведенческого акта и соответствующего изменения в химизме организма - все это в большой мере тормозит исследования роли сигнальных молекул как в онтогенезе, так и в филогенезе. Особую сложность представляют собой исследования, проводимые с позвоночными животными, у которых огромное значение приобретают психические процессы. Происходит резкое усложнение поведения, богатство поведенческих актов не дает часто возможности однозначно трактовать их мотивацию и выявлять внешние и внутренние факторы, вызвавшие ту или иную реакцию.
Каждый век уподоблял мозг тому механизму, который был вершиной технической мысли своего времени. Для Декарта то были простейшие механические автоматы. Для Шеррингтона, Павлова, Рамон - и Кохала прообразом стала автоматическая телефонная станция со множеством сложных меняющихся коммутаций. В настоящее время видится аналогия с компьютерами или целыми их системами. Однако возможно ближе всех к истине был Дюбуа Раймон который уже более века тому назад утверждал, что сущность работы мозга мы все-таки до конца никогда не поймем. В дальнейшем в пользу такого
утверждения стала свидетельствовать теорема Геделя. В той или иной степени мозг останется для нас, вероятно, навечно "черным ящиком".
Следует отметить,что все технические аналогии мозга обходят, в частности, одно крайне важное обстоятельство: роль множественности функционирующих в мозгу химических сигналов: синаптических и экстрасинаптических. Почему их много? Почему нельзя было обойтись только одним нейромедиатором для обеспечения функции торможения, которая, по-видимому, не может передаваться электросинаптическим способом? Только ли эволюционные причины определили множественность нейромедиа-торов в ЦНС животных? Казалось бы, в принципе, многие функции мозга мог бы обеспечить любой какой-нибудь один химический сигнал, если бы дело сводилось к структурно детерминированным нейросинаптическим коммутациям. Фактически же имеется немало подтверждений того, что многие сигналы в мозгу распространяются экстрасинаптически в ликворе, а также отчасти и в системе кровотока, адресуясь одновременно многим анатомически не связанным между собой нейронам, объединенным только одним общим свойством: идентичностью по признаку мембранной рецепции. Именно таким образом могут быть одновременно задействованы комплексы нервных элементов, участвующих в управлении поведенческой реакцией, связанной с определенньм эмоциональным настроем организма: состоянием мотивации. Каждому эмоциональному состоянию как то: повышенная пищевая или половая возбудимость, забота о потомстве, социальная агрессия, миграционное поведение и т.д. - свойственней свой специфический гормонально-физиологический фон (Шаляпина, 1976). Это подтверждают опыты, в которых соответствующие формы поведения удавалось вызвать посредством инъекций или даже - введения в водную среду разных нейрогормонов (Baenninger, 1968; Munro, Pitcher, 1985; Munro, 1986). Поразительно, что многие из тех же
форм поведения удается стимулировать и путем электрического раздражения определенных структур мозга через вживленные электроды.
На основании подобных экспериментов у исследователя возникает соблазн представить мозг как совокупность разных функциональных нервных центров работающих по принципу: "афферентные сигналы - центральное возбуждение -эфферентные им пульсации - двигательный ответ, т.е. низвести неимоверно сложную в действительности систему до примитивного уровня Декартовых рефлексов. Фактически, это представление конечно не в большей степени соответствует действительности, чем утверждение, будто появление той или иной информации на дисплее комъютера объясняется простейшей релейной связью между клавиатурой и разверткой изображения на экране.
По мере развития методологии исследований, появления новых вопросов, возникающих в процессе эксперимента, возникали новые научные дисциплины, каждая из которых пыталась осветить эволюционные и онтогенетические аспекты развития химических связей организма с точки зрения собственных методов и взглядов. Так возникла психонейроэндокринология, нейрофармакология и др. Особое место заняли исследования на границе нескольких научных дисциплин. Использование методов классической этологии, биохимии, физиологии и эмбриологии позволило подойти к вопросу о роли гормональных и нейромедиаторных систем с новых позиций: появилась возможность исследовать появление отдельных специализированных элементов системы, их развитие и становление в единое целое; изучить динамику отдельных веществ в онтогенезе; выделить специфические ответы при прямом воздействии на данную систему в целом или ее составляющие; проследить гистохимическими методами связи отдельных специализированных клеток и т.д. Таким образом, бьши созданы предпосылки для синтеза
имеющихся данных и проведения комплексных работ по изучению роли отдельных систем в онтогенезе и изменениях в их функционировании в филогенезе.
Наша работа продолжает эти исследования и посвящена катехоламинергической системе, ее гормональному и медиаторному звеньям в поведении рыб, для которых характерны внутривидовые антагонистические взаимодействия, основанные на территориальном поведении или в результате модификации поведения в условиях ограниченного пространства. Наш интерес к катехоламинам был вызван тем, что именно этого типа неиромедиаторы через посредство рецепторов в плазмалемме и на внутриклеточных мембранах, ионных каналов и вторичных мессенджеров - циклических мононуклеотидов, фосфоинозитидов и др., управляют одновременно многообразными функциями: от субклеточных до организменных. В частности, необычайно велика роль катехоламинов в регуляции и поддержании эмоционального статуса животных, мотиваций поведения, в особенности таких поведенческих реакций, как агрессия, стрессогенная активность (гормоны "защиты или бегства") и другие формы социального взаимодействия.
Говоря о катехоламинах, мы имеем в виду полифункциональный комплекс молекул, различных по своему биологическому эффекту и типам рецепции, но объединенных общностью происхождения в цепи метаболических превращений: тирозин - дофамин - норадреналин - адреналин. В наших экспериментах мы по-отдельности рассматривали динамику и действие каждого соединения, его агонистов и антагонистов.
Уже давно ученых разных специальностей, философов, медиков, биологов, психологов, интересует круг вопросов, связанных с управлением поведением животных и человека, со стрессом, который является неотрывной составной частью жизни организма, с агрессивностью, истоки которой искали еще древние философы. Конечно, основную значимость эти проблемы проибретали применительно к человеку. Но по мере развития
научной мысли стало понятно, что большую часть ответов можно найти изучая животных, т.к. процессы управляющие поведением схожи, химизм этих процессов зачастую одинаков у самых низших и самых высших представителей позвоночных, ответы на одни и те же раздражители одинаковы, а эволюция шла по пути усложнения отдельных систем, но, отнюдь, не по пути создания на каждом этапе новых.
В 1912 году было показано, что определенные вещества, названные катехоламинами, принимают непосредственное участие в процессах стресса и адаптации. Причем их роль велика не только при физическом или химическом стрессе, но и социальном, который может проявляться не только в грубых индивидуально направленных антагонистических актах, но и иметь тонкие визуально не наблюдаемые психологические механизмы. Именно на изучение становления и развития данной стрессогенной системы у рыб, которым генетически свойственна внутривидовая агрессия, охрана территории и постоянно сопутствующий этому социальный стресс были направлены наши эксперименты.
В данной работе мы попытались исследовать возникновение в онтогенезе элементов функций катехоламинергической системы, ее свойства на разных этапах развития организма, свойства отдельных веществ, составляющих ее, и изменение спектра функций в онтогенезе,. Мы сделали попытку понять, на каком этапе онтогенеза данная система и поведенческая стратегия находятся под жестким генетическим контролем и когда индивидуальная психология животного и его эмоциональное состояние может оказывать влияние на состояние медиаторного и гормонального звеньев катехоламинергической системы.
Полученные нами данные - свидетельство закономерного изменения в онтогенезе как концентрации разных нейрогормонов в структурах развивающегося эмбриона, так и гормонокомпетентности этих структур. Вся совокупность данных, полученных разными
методами, подтверждает, что в раннем эмбриогенезе из всех катехоламинов физиологически активны только субстрат - предшественник L-ДОФА и дофамин, несколько позже, - норадреналин, а адреналин, конечный продукт в цепочке ферментативных превращений катехоламинов, начинает действовать и появляется в уловимых количествах позже трех прочих соединений (Нечаев, Лабас, 1990; Нечаев и др., 1991). Подобная же картина наблюдалась и в эмбриональном развитии кур (Перцева, 1989).
Складывается впечатление, что полученные нами и другими авторами данные по динамике концентраций и физиологической активности разных гормонов в онтогенезе страдают одним общим недостатком: рассматривается лишь временная динамика и, в результате методических трудностей гистохимического выявления очень малых концентраций, отсутствуют данные о пространственной (Valinsky, Loomis, 1984). Между тем, представляется вполне вероятным, что пространственная динамика имеет прямое отношение к процессу развития сперва - общего плана строения организма, а, затем, цитоархитектоники его мозговых структур, их биохимической и функциональной мозаичности.
В последнее время появились первые сообщения о весьма сложном механизме развития пространственно упорядоченных структур в эмбриогенезе (Ingham, Nakano, 1989; Goodwin, Kauffman, 1990). Этот процесс, по-видимому, имеет немало системных аналогий с работой мозга и, соответственно, вычислительной машины. Исследователи же еще совсем недавно исходили в своих представлениях о процессах индивидуального развития из упрощенных реакционно-диффузионых (Gierer, Meinhardt, 1972; Meinhardt, 1986; Harrison, 1987) и других моделей типа тех, которые когда-то постулировались и для мозга рефлексологическими школами, хотя, разумеется, один существенный шаг вперед был сделан. По аналогии с нервными механизмами управления движениями и
техническими устройствами и химическими автоколебательными системами (Gierer, Meinhardt, 1972) индивидуальное развитие тоже начали рассматривать как процесс самоорганизации, в котором всеобъемлющую роль играют обратные связи. Переход к следующему шагу: анализу алгоритмов развития только-только начался после открытия гомео-боксов и других регуляторных генов, ответственных за временные и пространственные паттерны развивающихся структур эмбриона (Harrison, Tun, 1988; Ingham, Nakano, 1989; Knust, Kampos-Ortega, 1989; Zaraisky et al, 1992) . При этом с эволюционной точки зрения существенно, что процессы эмбриогенеза реализуются с участием ряда нейротрансмиттеров и нейрогормонов. Морфогенетические функции этих веществ - эволюционная предпосылка их дальнейшего превращения в регуляторы нервной деятельности, поведенческих реакций.
Исходя из всего вышесказанного целью нашей работы являлось: установление закономерности развития функциональной активности и последовательность расширения спектра функций нейромедиаторного и гормонального звеньев катехоламинергической системы в онтогенезе рыб, которым свойственно агонистическое поведение в естественных условиях. Основные задачи работы:
1. Эмбриональное и раннее постэмбриональное развитие рыб. Сравнительный анализ роли катехоламинов в икре и у личинок рыб с разным типом поведения.
Провести сравнительное исследование развития физиологических реакций у эмбрионов рыб с разным типом поведения.
Исследовать динамику веществ катехоламинового ряда в эмбриогенезе у рыб с различной социальной структурой.
Исследовать последовательность появления реакций (морфологических, развития двигательных процессов, длительность эмбриогенеза) на катехоламинергические (КА-
ергические) препараты, нарушения в развитии зародыша под их влиянием и, как следствие, возможные модификации поведения взрослых рыб.
Провести сравнительный анализ развития поведенческих реакций и сопровождающих
их изменений в функционировании КА-ергической системы в раннем
постэмбриональном онтогенезе у рыб с различной социальной структурой.
2. Развитие социальной структуры в группах рыб и катехоламинергические механизмы,
поддерживающие и определяющие взаимодействия особей на различных этапах
онтогенеза.
Исследовать изменения в функционировании КА-ергической системы в период становления социальных отношений и роль отдельных катехоламинов в приобретении рыбами определенного социального статуса в группах с разным числом рыб.
Определить роль КА-ергической системы в образовании брачной пары, и исследовать динамику катехоламинов в репродуктивный период.
3. Провести теоретический анализ процесса становления функций катехоламинов в
индивидуальном развитии, его особенностей у рыб, а также обсудить роль отдельных
веществ катехоламинергической системы в поведении.
Было исследовано ряд видов рыб с характерным иерархическим поведением в условиях ограниченного пространства. Эксперименты проводили в лабораторных условиях в аквариумах, что позволяло вести наблюдения как за отдельными особями, так и за образованием и развитием общей системы иерархических отношений. Также, лабораторные исследования позволили нам унифицировать условия содержания рыб и методологию проведения экспериментов, что является крайне важным фактором при изучении процессов, связанных с психикой животных. Не меньшую роль играет стабильность условий и при изучении динамики катехоламинов, уровень которых легко
варьирует при малейшем изменении внешних условий, а, значит, и реакции на них организма. Часть исследований была проведена в естественных условиях обитания рыб.
Было выделено четыре основных периода в жизни организма: эмбриональное развитие; раннее постэмбриональное, когда происходит быстрый рост животного и становление его поведенческой стратегии, определяющей его поведение в течение остальной жизни; период появления и развития социальных отношений; репродуктивный период. Именно в течение этих периодов мы определяли время появления специализированных элементов катехоламинергической системы, динамику веществ, специфические физиологические и поведенческие ответы на введенные катехоламинергические препараты и роль раннеэмбриональных воздействий на изучаемую систему и поведение взрослых рыб.
Автор выражает благодарность Д.С. Павлову за многолетнее общее руководство исследованиями, М.Н. Перцевой и И.А. Баранниковой за ряд ценных советов, как при проведении экспериментов, так и при обсуждении результатов работы, Д.А. Павлову и В.В. Махотину за доскональное обсуждение полученных нами результатов в эмбриологической части работы, В.М. Ольшанскому за помощь в создании цифровой фотометрической установке и подготовки компьютерной программы для нее, В.В. Костину за плодотворную совместную работу и помощь в математической обработке данных.
Роль нейрофармакологических воздействий на катехоламинергическую систему в регуляции социального поведения
Катехоламины - гормоны, мобилизующие адаптивные возможности организма. Обильные литературные данные позволяют полагать, что функция катехоламинов ограничивается регуляцией социального поведения в пределах того типа, который был исходно свойственней данному виду на данной стадии развития (Анохин, 1979; Вальдман, Пошивалов, 1984; Нечаев, Мусатов, 1991). Переходы же от одного типа социальных взаимодействий к другому осуществляются под контролем целых групп гормонов (Крушинский, 1960; Колпаков, 1978; Анохин, 1979). Большую роль при этом играют тиреотропный и адренокортикотропный гормоны гипофиза. Вместе с тем, нельзя исключить и то, что действие тироксина, гипофизарных гормонов и т.д. может опосредоваться влияниями на биосинтетическую деятельность клеток хромаффиновой ткани, а также на состояние катехоламинчувствительных нейронов и т.д.
Однако нельзя отрицать и того, что в индивидуальном поведении животных, той или иной форме реализации поведенческой стратегии катехоламины могут играть на только корректирующую, но и определяющую роль (Пошивалов, 1986; Нечаев, Мусатов, 1991; Munro, 1986; Nechaev, 1991).
Торможение синтеза катехоламинов (Х-метилпара- тирозином снижает различные эффекты агрессии типа "нападение" и мало влияет на поведение защиты и побега. Альфаметилпаратирозин резко угнетал атаки у грызунов, понижал агрессию у кошек и макаков (Miczek, De Bold, 1983). Действие ингибиторов тирозингидроксилазы на агрессивное поведение (а -1-метилпаратирозина) зависит от исходной скорости синтеза, обмена и освобождения норадреналина и дофамина в мозге. Показано, что сильное истощение катехоламинов 6-гидроксидофамином усиливает общую реактивность и "агрессивность". Кошки и крысы становятся более возбудимыми и реактивными после 6-гидроксидофамина. Защитные позы и укусы у крыс при электроболевой стимуляции также возникают чаще. У агрессивных и неагрессивных животных эффекты 6-гидроксидофамина были различными, агрессивные атаки на партнера у мышей мало изменялись (Krsiak et al, 1981), как и атаки на партнера после гипоталамической стимуляции у кошек. Повышение гиперреактивности после 6-гидроксидофамина наблюдалось у крыс изолянтов, но не у сгруппированных животных. Видимо, временное истощение катехоламинов после 6-гидроксидофамина провоцирует "синдром норадреналин - гиперчувствительности" у крыс, так что эффекты изоляции и нейро-токсического воздействия потенцируются. Торможение катехоламинергических систем при использовании антагонистов норадреналиновых и дофаминовых рецепторов приводит к резкому снижению различных форм агрессивного внутривидового поведения у самых разнообразных видов животных. Следует отметить, что антиагрессивное действие антагонистов норадреналиновых и дофаминовых рецепторов, как показывает этологический анализ, не является высокоизбирательным и сопровождается угнетением как индивидуального, так и внутривидового поведения (Пошивалов, 1974). Похожий эффект достигается и при торможении выброса из терминалей серотонина (Perreault et al., 2003).
Использование агонистов и прекурсоров катехоламинергических систем также показывает важную роль этих систем в интеграции агонистического поведения. Высокие уровни атак наблюдали у мышей, которые содержались на диете с добавлением прекурсоров катехоламинов L-тирозина и L-фенилаланина. Малые дозы L-ДОФА вызывали усиление видотипической агрессии у лабораторных грызунов (Подольский, 1977; Пошивалов, 1986), а более высокие дозы понижали атаки, но акцентировали проявления защиты (Miczek, De Bold, 1983).
Прямой агонист дофаминовых рецепторов апоморфин (0,2 мг/кг) вызывал агрессивное поведение у "тревожных" изолированных мышей, однако в более высоких дозах апоморфин и другие агонисты понижают атаки и угрозы у агрессивных мышей (Krsiak et alio, 1981). Известно, что апоморфин стимулирует у крыс защитные поведенческие реакции, вызванные электроболевой стимуляцией, защитную гиперреактивность, возникающую в результате лишения морфина, а также в результате резкой отмены галоперидола или инъекций 6-гидроксидофамина. Сходными эффектами на защитное поведение обладает амантадин.
Моноаминергические трансмиттеры, такие как дофамин, не могут в целом преодолеть гематоэнцефалический барьер. Так быстрый поведенческий эффект апоморфина вызывается скорее воздействием на центральную нервную систему, чем влиянием на секреторную активность гипофиза. Апоморфин ингибирует спонтанную (социальную) агрессию (Пошивалов, 1974; Подольский, 1977; Miczek, DeBold, 1983), также как хищническую реакцию у крыс, что может быть связано с уменьшением "пищевой активности", наблюдаемой в случае высоких доз.
Также как апоморфин, амфетамин (Подольский, 1977) уменьшает агрессию, воздействуя скорее на дофаминергическую систему, чем на норадренергическую. Внутричерепная инъекция норадренергических Р-антагонистов (пропранолол, практолол) и агонистов (изопреналин) не оказывает сколько-нибудь значимого воздействия на агрессивность.
Характерное увеличение скорости плавания у рыб при воздействии и апоморфина, и амфетамина согласуется с аналогичными поведенческими реакциями у млекопитающих. Соотношение между плавательной активностью и агрессивностью, однако, не подтверждаются достаточно достоверными данными. Хлорпромазин снижает агрессивность поведения. Поведенческие реакции "голова вниз" возрастают. Конфликтная поведенческая реакция, отражающая внутреннюю борьбу, стремление к атаке и избеганию раздражителя, также возрастает при действии хлорпромазина. Итак, и дофаминовые агонисты в больших дозах и антагонисты редуцируют агрессивное поведение как качественно, так и количественно (Winberg, Nilsson, 1992; Winberg et al., 1997; Francis et al., 1997; Anichtchik et al., 2004). Это свидетельствует о том, что изменения активности центральных дофаминергических систем важны в регуляции агрессивности.
Повышенная чувствительность у изолированных агрессивных животных норадреналинового и дофаминергического рецепторного аппарата может быть связана с относительной адаптацией к пониженному содержанию катехоламинов, вызванному истощением в условиях длительной изоляции и стресса внутривидовой конфронтации. Известно, что эффекты многих нейротрансмиттеров, включая норадреналин и дофамин, могут опосредоваться циклическим аденозинмонофосфатом (ц-АМФ). В связи с этим предпринимались попытки продемонстрировать зависимость между эндогенными уровнями ц-АМФ и ц-ГМФ и агрессивным поведением грызунов (Пошивалов, 1986). До сих пор неясно, насколько скоротечны указанные процессы. Вполне вероятно, что изменения в уровне ц-АМФ могут исчезать сразу после прекращения агрессивного поведения. Тем не менее, низкие уровни ц-АМФ в мозге ассоциируются с низкими уровнями аффективной агрессии.
Количественное определение уровня веществ катехоламинового ряда
Проводили количественное определение соединений катехоламинового (КА) ряда: тирозингидроксилазу (ТН), дигидроксифенил аланин (ДОФА), дофамин (ДА), 3, 4 диоксифенилуксусную кислоту (ДОФУК), гамма-ванильную кислоту (ГВК), норадрена-лин (НА) и адреналин (Адр).
Для количественного определения катехоламинов применяли спектрофлуориметрические методы (Maikel et all, 1968, Манухин и др., 1975) и методы жидкостной хроматографии (Jaequot et all, 1986, Magnusson et al, 1980) с использованием спектрофлуориметрического и электрохимического детекторов.
Модифицированный метод Майкеля основан на флуоресценции продукта окисления НА. При количественном определении катехоламинов ткани и органы рыб гомогенизировали в 0,1 н НС1, насыщенной NaCl. Гомогенат центрифугировали после добавления 3 мл кислого бутанола. Бутанольную фазу перемешивали в пробирках с 5 мл гептана и 0,4 мл 0,1 N НС1. Все дальнейшие операции основаны на методе Майкеля. Максимумы спектров флуоресценции и возбуждения L-ДОФА измеряли при длине волны возбужденного света 335 нм и флуоресценции 385 нм, ДА - при 330 нм и 375 нм, НА - при 390 нм и 485 нм, Адр - при 420 нм и 495 нм, соответственно. Спектрофлуориметрические определения выполнены на флуоресцентном спектрофотометре MPF-4 "Hitachi".
При использовании универсального триоксииндольного метода количественного определения моноаминов, разработанного в лаборатории Б.Н. Манухина (Институт билогии развития им. Н.К.Кольцова РАН), идентификацию КА проводили путем сравнения спектров возбуждения флуоресценции веществ, выделенных из тканей экстрактов с соответствующими спектрами стандартных растворов L-ДОФА, ДА, НА и Адр. Интенсивность флуоресценции L-ДОФА измеряли при длине волны возбужденного света 335 нм и флуоресценции 385 нм, ДА - при 330 нм и 375 нм, НА - при 390 нм и 485 нм, Адр - при 420 нм и 495 нм, соответственно.
Определение ДОФУК проводили хроматографическим методом Магнусона и других (Magnusson et al, 1980). Метод основан на электрохимической детекции раствора гомогената ткани. Использовали колонки Nucleosil С18, 5 мм; мобильной фазой являлся цитратный буфер рН 4,25 с добавлением метанола (8%) и гексил сульфат (1,7 х 10-5 М). Потенциал детектора составлял 0,60 V.
Наркотизацию рыб во всех экспериментах проводили при помощи электрического тока. Математическую обработку данных, полученных при количественном определении КА, проводили с применением непараметрического критерия достоверности отличий между выборками Уайта (Т); полученных при кариометрическом и это логическом анализе данных - с применением критерия Стьюдента.
Для регистрации эмбриональной моторики зародышей рыб была создана уникальная цифровая физиологическая установка на основе метода, предложенного Ю.А. Лабасом (Лабас и др., 1968) и модифицированная Нечаевым И.В. и Ольшанским В.М. Созданная цифровая установка имеет технические параметры, позволяющие регистрировать двигательные процессы любой интенсивности - от клеточных пульсаций до движений организма (рис.2).
В процессе эксперимента регистрировали следующие параметры: 1. Частоту пульсаций отдельных бластомеров. 2. Скорость обрастания желточного мешка перидермой (определяли по уменьшению светового поля (в mV) в окне диафрагмы). 3. Скорость роста эмбриона (определяли по уменьшению светового поля (в mV) в окне диафрагмы). 4. Частоту сокращений сомитов и миотомов по мере их возникновения от туловищного отдела к хвостовому. 5. Частоту сердечных сокращений. 6. Частоту генерализонванных сокращений эмбриона (движения «поеживания» по П.Н.Резниченко, 1982) 7. Частоту боковых флексий эмбриона, движений перевертывания (вылупления). 8. Частоту биений хвостовой частью свободного эмбриона (плавательных движений по С. Richards & E.D. Pollack, 1987).
Икринка, предличинка и личинка помещались в специальную камеру, освещаемую сфокусированным лучом света, который далее через диафрагму попадал на высокочувствительную фотоматрицу. Прибор преобразовывал изменения освещенности поля зрения микроскопа проходящим светом, создаваемые движением исследуемого объекта в малом отверстии раздвижной окулярной диафрагмы при увеличении 8x10, в электрические сигналы. В установке использовали микроскоп с горизонтальным тубусом. Икру помещали в проточную камеру из органического стекла, скрепленную с препаратоводителем на вертикально ориентированном предметном столике микроскопа. Устройство камеры обеспечивало нормальное развитие икры на протяжении всего эмбриогенеза.
Сигнал с фотоматрицы усиливался и подавался на вход 24-разрядного АЦП (ADC -analogo-digital converter) AD7714 фирмы Analog Device. АЦП контролировалась микроконтроллером АТ89С51 фирмы Atmel. Микроконтроллер передавал на СОМ-порт компьютера messages 40 раз в секунду. Специально написанная программа для компьютера позволяла отображать динамику сигнала в интерактивном режиме. High dynamic range and relatively high sample rate по сравнению с характерными временами исследуемых процессов обеспечивали широкие возможности для анализа относительно небольших колебаний на фоне больших изменений размеров икринки и относительно быстрые осцилляции на фоне медленных ритмов. Программа предусматривала экспорт данных в таблицу в ASCII-виде.
Движения зародышей в икре, размеры свободных эмбрионов и длительность эмбриогенеза
Мы не обнаружили принципиальных различий в физиологическом развитии зародышей у рыб с разным типом поведения на взрослых стадиях, однако, уже в конце эмбриогенеза была обнаружена дифференциация потомства на две фенотипические группы по степени двигательной активности эмбрионов и срокам вылупления личинок. По-видимому, все обнаруженные нами межвидовые различия в эмбриогенезе связаны исключительно с экологическими условиями обитания рыб и их видоспецифичностью.
Результаты экспериментов показали, что различия в интенсивности двигательной активности эмбрионов в разных группах из одной кладки в основном определяются длительностью фазы покоя между сменой разнонаправленных флексий (Табл. 5) и, как следствие, наблюдается различие в частоте «движений вылупления» (рис.6).
Поведенческие реакции личинок сразу после вылупления исследовали в группах с разной длительностью эмбриогенеза, в связи с уровнем их двигательной активности в икре. У всех исследованных видов рыб вылупление происходило не одновременно. Первые свободные эмбрионы опускались на дно аквариума или оставались около кладки. Для них было характерно отсутствие плавательной активности, большой желточный мешок и малые размеры тела. Свободные эмбрионы, вылупившиеся позже (Табл.5), имели более короткий срок предличиночного развития (для территориальных рыб) или практически сразу (для плотвы и тетры плотвички) приступали к экзогенному питанию и отличались от первых высокой плавательной активностью. Анализ динамики двигательной активности «задержавшихся» эмбрионов в период времени после выклева группы с ранним развитием показал отсутствие отличия частоты флексий и движений перевертывания в этот период. Однако амплитуда движений и длительность каждого движения эмбриона значительно больше, чем у эмбрионов из первой группы перед вылуплением. Возможно, это связано с большими размерами тела эмбрионов из второй группы (Табл. 6, Контроль).
Разделение потомства рыб на две фенотипические группы по уровню катехоламинов (Табл.7). Значительные различия в сроках эмбриогенеза и двигательной активности эмбрионов в конце эмбрионального развития (Табл.5) потребовали проведения детального исследования динамики веществ катехоламинового ряда в этот период. Существовала значительная вероятность того, что биохимические изменения в процессе развития позволят выделить какие-либо особенности, свойственные рыбам с агонистическим поведением в группах на взрослых этапах онтогенеза. Проведенное исследование продемонстрировало наличие дифференциации потомства от одной пары производителей на две группы по уровню КА независимо от их видовой принадлежности.
Было показано, что в самом начале развития икры, с I стадии в ней присутствуют только L-ДОФА и ДА. По мере развития икры, перед или в момент появления специализированных катехоламинергических клеток (конец IV, начало V стадии развития), при проведении анализов впервые обнаруживается НА в очень малых количествах. Адр не удалось обнаружить ни на одной стадии развития икры.
Было отмечено постепенное повышение уровня L-ДОФА и НА в эмбриогенезе, причем если уровень НА повышался постоянно, то скорость роста концентрации L-ДОФА с появлением ДА значительно уменьшался. В это же время обнаруживалась ДОФУК и ГВК. Уровень ТН на всех стадиях эмбриогенеза оставался почти постоянным.
На VI - VII стадиях развития начинается (пока недостоверное) индивидуальное разделение икры на две группы по уровню L-ДОФА у A. pulcher. У Н. bimaculatus эта дифференциация на две группы начинается позже - на VIII стадии развития.
Примечание. ВУМ (группа В) - часть потомства с высоким уровнем активности КА-ергической системы (высокий уровень метаболизма), НУМ (группа А) - часть потомства с низким уровнем активности КА-ергической системы (низким уровнем метаболизма), ОРИ - отдельно развивающиеся икринки. Приведены ср. + 8. - различия между ВУМ и (НУМ и ОРИ) достоверны при р 0,05. Результаты количественного определения веществ катехоламинового ряда в икре рыб из потомства одной пары производителей показаны на примере двух видов. Отчетливо видна дифференциация потомства по уровню синтеза и утилизации ДА , которая начинается на этапе обособления головы эмбриона от желточного мешка. У части потомства достоверно возрастает уровень ДОФА, ДА и его метаболитов - ДОФУК и ГВК. Различия в уровне НА наблюдали позже, ближе к вылуплению свободных эмбрионов.
Проведенные эксперименты со всей очевидностью продемонстрировали наличие общих закономерностей в эмбриональном развитии рыб с различной стратегией поведения на взрослых этапах развития. Однако возник вопрос: почему происходит разделение потомства, и не появятся ли различия в эмбриогенезе рыб (не связанные с их экологией) в случае индивидуального развития икринок без их взаимного влияния внутри кладки. Для ответа на этот вопрос была проведена серия следующих экспериментов.
Роль химических взаимодействий икринок в кладке в дифференциации эмбрионов на две фенотипические группы. Целью данного эксперимента было определение роли химических взаимодействий икринок плотвы в проявлениях эффекта провизорной дифференцировки молоди на два фенотипа, различающихся по характеру гормональной деятельности и поведению, а также изучение временной последовательности выхода предличинок из икры и различий в уровне метаболических реакций личинок, связанных со временем инкубации.
В результате проведенного исследования было показано, что при индивидуальной инкубации икринок дифференциации по уровню метаболизма исследуемых веществ не происходит. Концентрация соединений КА-ергической системы у всех эмбрионов в среднем была ниже, чем в контроле у группы с низким уровнем метаболизма, однако эти различия не достоверны (Табл.7). Еще одним подтверждением взаимного влияния икринок послужил эксперимент с добавлением воды из емкости с общей кладкой в емкости с индивидуально развивающимися икринками.
Периодическая подмена воды в бакпечатках индивидуально развивающихся икринок на воду из аквариума с общей кладкой приводит к разделению икринок на две группы по уровню метаболизма. Однако, в отличие от общей кладки процент личинок с высоким уровнем метаболизма (ВУМ) значительно ниже, чем с низким уровнем метаболизма (НУМ). Концентрация исследуемых соединений в группе с заменой воды была достоверно выше таковой в группе без замены воды при индивидуальном развитии (Табл.8). Размерных отличий между предличинками не отмечено.
Личинки рыб, без заботы о потомстве
Совершенно иная картина наблюдается у молоди рыб, которым не свойственна забота о потомстве. Мы исследовали динамику катехоламинов у R. rutilus как в аквариальных, так и в естественных условиях в период личиночного развития и по мере расселения с мест нереста.
На первом раннем этапе развития (этап А) предличинки плотвы ведут малоподвижный образ жизни. Они обитают в зарослях водной растительности в районе нерестилищ и обычно прикрепляются к ней с помощью желез приклеивания. Первые активные подвижки молоди плотвы начинаются на этапе В. Они открепляются от растительности и начинают активно плавать. На этот этап приходится начало внешнего питания молоди.
С переходом на внешнее питание и активное плавание (этапы B-Ci) плотва обнаруживается в различных по числу особей скоплениях на различных участках прибрежья реки, удаленных от нерестилищ (Нездолий, Кириллов, 1997). Обычно к тому времени, когда большинство особей плотвы переходят на этап Сі, в реке заполняются личинками все участки прибрежья, пригодные для их обитания.
Наблюдения ( Павлов и др., 1981) показали, что личинки плотвы на этапах Ci - D\ днем находятся в заливах. Если в них нет течения, то четкая ориентация рыб в группах относительно друг друга отсутствует. Молодь держится в непосредственной близости от растительности, но не заходит в нее. На границе с русловым потоком личинки образуют стайки и имеют четкую ориентацию против течения. Нездолий и Кириллов (1997) впервые установили, что и ночью личинок плотвы на этих этапах можно встретить как на участках прибрежья без течения (лимноусловия), так на границе с русловым потоком (реоусловия), где скорости течение ярко выражены и составляют от 40 до 80% от величины критической скорости течения для находящихся там личинок.
В лимноусловиях скопления молоди плотвы чаще всего напоминали стаи "кругового обзора" по Радакову (1972), а в реоусловиях образовывали "ходовые" стаи, в которых, проявляя реореакцию, они практически не перемещались относительно неподвижных ориентиров (Нездолий, Кириллов, 1997).
Именно на этих этапах развития молоди в малой реке наблюдается наиболее интенсивная покатная миграция. Она происходит в основном в темное время суток и начинается вблизи прибрежья с постепенным переходом рыб к стрежню реки. Но не вся молодь скатывается часть ее остается в прибрежье в лимно- и рео- условиях (Павлов и др., 1981; Нездолий, Кириллов, 1997).
Мигрирующие личинки плотвы находятся в пассивном состоянии. Они случайно ориентированы относительно направления течения и не совершают активных движений в потоке (Павлов и др., 1999). Ночью в лимноусловиях большая часть личинок плотвы как бы зависает в толще воды, почти не двигаясь. Часть из рыб находится на дне или в зарослях водной растительности, при этом плавательные движения у них практически отсутствуют. В реоусловиях, по мере снижения освещенности, стаи личинок плотвы становятся более плотными, чем днем. У личинок наблюдается четкая реореакция и снижение двигательной активности, за счет перемещения рыб в зоны потока с меньшими скоростями течения. Визуально неоднократно удавалось зафиксировать отрыв некоторых личинок от стаи и их скат вниз по течению (Павлов и др., 1981; Нездолий, Кириллов, 1997).
На этапе D2 стабильность картины распределения молоди в прибрежье несколько нарушается. На общем фоне уменьшения численности молоди в реке, изменяется соотношение между количеством личинок в рео- и в лимно- условиях. Все больше рыб находится в реоусловиях, и все меньше - в лимноусловиях. В лимноусловиях чаще наблюдали "ходовые" стаи, и реже - стаи "кругового обзора", а в реоусловиях молодь перемещается на участки с большей абсолютной скоростью течения. В целом заметно общее увеличение подвижности личинок плотвы. На данном этапе развития интенсивность покатнои миграции значительно снижается и практически прекращается на мальковых этапах (Попова, Легкий, 1984; Нездолий, Кириллов, 1997).
Таким образом, в процессе онтогенеза изменяется поведение и распределение молоди плотвы в прибрежье малой реки. Начало покатнои миграции молоди в малой реке наблюдается на этапе В. Наибольшая интенсивность миграции имеет место у личинок плотвы на этапах CrDi и заметно снижается к этапу D2.
