Содержание к диссертации
-
ВВЕДЕНИЕ 7
-
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
2.1 Динеин 10
-
Введение 10
-
Устройство молекулы цитоплазматического динеина 11
-
Тяжелые цепи динеина 12
-
Промежуточные цепи динеина 13
-
Легкие промежуточные цепи и легкие цепи динеина. ..15 2.2 Динактиновый комплекс 17
-
Arpl «плечо»: 18
-
Подвижное «предплечье» 20
2.3 Функции динеин-динактинового комплекса 26
-
Внутриклеточная локализация динактина 26
-
Процессы внутриклеточного движения 26
-
Динамика внутриклеточных мембран 26
-
Ядро 29
-
Другие цитоплазматические частицы 30
2.3.2 Участие динеин-динактииа в других процессах 32
2.3.2.1 Цеіпросома и организация системы интерфазных
микротрубочек 32
2.3.2.2 Плюс-концы МТ 35
2.4 Семейство 31е20-подобных протеинкиназ: классификация и
основные свойства 37
2.5 GCK-подобные протеинкиназы: классификация 40
2.6 Протеинкиназы LOK/xPIkk и LOSK 44
3 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ 53
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
4.1 Материалы 55
-
Культуры клеток 55
-
Штаммы E.coli 55
-
Антитела 55
-
ДНК-конструкты 56
-
Химреактивы 56
-
Для работы с Е. coli 56
-
Для работы с культурами клеток 56
-
Для электрофореза белков вПААГ 58
-
Для полусухого переноса 58
-
Для со-осаждения с экзогенными МТ 59
-
Для аффинного выделения рекомбинантных белков59
-
Для киназной реакции 59
-
Для микроинъекций 60
-
Другие материалы 60
-
Приборы 60
-
Специализированные компьютерные программы 61
4.2 Методы 61
4.2.1 Трансформация Е. coli 61
-
Получение компетентных клеток Е. coli 61
-
Трансформация клеток Я. coli плазмидной ДНК 62
-
Очистка плазмидной ДНК 62
-
Получение рекомбинантных белков (протеинкиназа LOSK, plSO(Glued) 62
4.23 Л Экспрессия белков в Е. coli 62
-
Очистка рекомбинантных белков, слитых с GST, на глутатион-8-агарозе 63
-
Очистка рекомбинантного белка, слитого с 6His, на Ni-NTA-агарозе (в нативных условиях) 63
-
Проведение киназной реакции 64
-
Co-осаждение с микротрубочками 65
4.2.5.1 Полимеризация микротрубочек из очищенного
тубулина 65
4.2.5.2 Со-осаїкдение с экзогенными микротрубочками 65
-
Электрофорез белков в полиакриламидпом геле и окраска гелей 67
-
Иммуноблотинг 67
-
Конъюгирование флуорохрома СуЗ с тубулином 68
-
Ведение клеточной культуры 69
4.2.10 Трансфекции культивируемых клеток 69
-
Л ипосомная трансфекция 69
-
Микроинъекции плазмидных ДНК 70
-
Микроинъекции антител и рекомбинантного белка 70
-
Фиксация клеток 70
-
Моделирование клеток перед фиксацией 70
-
Фиксация клеток параформальдегидом 71
-
Фиксация метанолом 71
-
Фиксация формалин-метанолом 71
-
Фиксация метанол-формалином 72
-
Иммунофлуоресцентное окрашивание 72
-
Прижизненные наблюдения клеток 72
4.2.14.1 Организация системы микротрубочек в интерфазной
клетке 72
4.2.14.2 Нуклеирующая активность центросомы 73
4.2.Ї5 Анализ изображения 73
4.2.16 Статистическая обработка данных 74
5 РЕЗУЛЬТАТЫ 76
5.1 Экпериментальные подходы к исследованию формирования и
поддержания радиальной организации микротрубочек в
интерфазных клетках 76
5.2 Влияние ннгибирования активности динеина путем
микроинъекции 74.1 антител и рекомбинантного белка
динамитина на радиальную организацию микротрубочек
в интерфазных клетках 77
5.3 Морфология и внутриклеточное расположение аппарата
Гольджи после воздействия ингибиторов динеина 81
5.4 Содержание основных белков перицентриолярного материала
в центросоме после воздействия ингибиторов динеина..83
5.5 Влияние ингибиторов динеина на нуклеацию микротрубочек
на центросоме 87
5.6 Ассоциация динеина с центросомой в клеточном цикле 89
5.7 Локализация в культивируемых клетках продуктов
экспрессии и молекулярные массы полноразмерной протеинкиназы LOSK и ее фрагментов, слитых с GFP....91
5.8 Ферментативная активность протеинкиназы LOSK in vitro,
доминантно-негативный мутант и участок связывания ее с
микротрубочками 95
5.9 Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на систему
микротрубочек 100
5.10 Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на
формирование актиновых стресс-фибрилл в интерфазных
клетках 102
-
Влияние инактивации протеинкиназы LOSK на содержание основных белков центросомы 105
-
Идентификация нового субстрата протеинкиназы LOSK.Л07
-
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 109
-
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 118
-
ВЫВОДЫ 120
-
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 121
10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
Введение к работе
Для большинства интерфазных клеток млекопитающих характерна радиально-симметричная система микротрубочек (МТ): МТ отходят от центра организации (ЦОМТ) к периферии клетки. При этом в ЦОМТ располагаются минус-концы, а по периферии клеток - плюс-концы МТ. Радиальная сеть МТ необходима для организации внутриклеточного движения органелл по эндоцитозному и экзоцитозному пути, для поддержания поляризованной формы клеток при их передвижении по субстрату и для функциональной компартментализации клетки.
Центром радиальной сети МТ в животной клетке обычно является центросома, представленная парой центриолей и окружающим их перицентриолярным материалом. На центросоме происходит нуклеация МТ (Moudjou et ah, 1996; Steams & Kirschner, 1994) и их заякоривание (связывание их минус-концов) (Mogensen et al., 1997; Mogensen et al., 1999; Quintyne et al., 1999; Mogensen et al, 2000; Bornens et al., 2002; Dammermann & Merdes, 2002). Молекулярные механизмы нуклеации и заякоривания МТ, также как и функции многих белков перицентриолярного материала, до сих пор остаются неясными. Был опубликован ряд работ, показывающих, что дисфункция многих белков с центросомной локализацией ведёт к утрате центросомой функции центра организации МТ. В частности, это было показано для динеин-динактинового комплекса (Quintyne et al., 1999) и для протеинкиназы LOSK (по данным, полученным ранее в лаборатории).
Цитоплазматический динеин представляет собой моторный белок, АТФ-зависимо перемещающийся по МТ по направлению к ее минус-концу. Он осуществляет ретроградный транспорт молекул и органелл, взаимодействуя с ними через свой кофактор - белковый комплекс динактин. В митозе и в интерфазе динеин и динактин ассоциированы с центросомой, причем, вероятно, независимо друг от друга (Purohit et aL, 1999; Quintyne et aL, 1999; Tynan et aL, 2000, Quintyne et al, 2002; Uetaki et aL, 2004). В опытах, в которых добивались ипгибироваиия активности динеина или разрушения динактинового комплекса, наблюдали дезорганизацию полюсов митотического веретена и разрушение радиального расположения МТ в иитерфазных клетках, сопровождавшееся нарушением связи МТ с центросомой (Gaglio et aL, 1996; Gaglio et aL, 1997; Burkhard et aL, 1997; Quintyne et aL, 1999). Роль динеина в формировании радиальной сети МТ в интерфазных клетках, тем не менее, пока исследована недостаточно. В частности, неясно, участвует ли непосредственно динеин в нуклеации или в заякоривании МТ на центросоме. Разрушение радиальной сети МТ при ингибировании динеина ранее объясняли тем, что динеин доставляет в центросому ее функционально важные белки, и при дисфункции динеина происходит деплеция центросомы по этим белкам (Young et aL, 2000). Поэтому важным представлялось исследовать ранние эффекты ингибирования динеина в клетках, когда деплеция центросомы по функционально важным белкам еще маловероятна.
Выраженность радиальной сети МТ в клетках бывает разной: в одних типах клеток она почти строго радиальная, а в других -значительно более хаотичная. Это заставляет предположить, что степень радиальности сети МТ регулируется клеткой. Вероятно, что в регулировании радиальной сети МТ могут принимать участие протеинкиназы, связанные с центросомой и МТ. Протеинкиназы - одно из самых обширных белковых суперсемейств эукариот, насчитывающее до тысячи представителей. Протеинкиназы катализируют реакцию переноса у-фосфатной группы АТФ (или ГТФ) на спиртовые группы серина/треонина (или фенольную группу тирозина) в белках для образования фосфомоноэфиров. Большинство протеинкиназ - минорные клеточные белки, которые удается идентифицировать только молекулярно-биологическими методами. Однако экспериментально вызванная дисфункция многих протеинкиназ ведет к фатальным последствиям для клеток. Протеинкиназы регулируют клеточный цикл, дифференцировку, метаболические пути, морфогенез, участвуют в цепях передачи внутри клеточых сигналов и в запуске апоптоза.
Ранее идентифицированная в нашей лаборатории серин-треониновая протеинкиназа LOSK (LOng Ste20-like Kinase) ассоциирована с МТ и центросомой (Zinovkina et al., 1997), и были получены предварительные данные о том, что ингибирование функций LOSK приводит к нарушению радиальной организации системы МТ в клетках. Это позволило предположить, что LOSK является протеинкиназой, участвующей в процессе регулирования организации радиальной системы МТ.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 ДИНЕИН 2.1.1 Введение
Цитоскелетные молекулярные моторы в эукариотической клетке представлены тремя основными классами: динеинов, кинезинов и миозинов. Они используют освобожденную энергию гидролиза АТФ для перемещения по цитоскелетным фибриллам: динеины двигаются вдоль МТ по направлению к их минус-концу (Paschal & Vallee, 1987), кинезины - вдоль МТ к плюс-концу, а миозины перемещаются вдоль актиновых филаментов (Vale & MilHgan 2000). В настоящее время наблюдается большой прогресс в изучении биохимии и механохимических циклов кинезина и миозина (Vale & Milligan 2000), но гораздо меньше известно о динеине. Одной из причин этого могло послужить более сложное устройство молекулы динеина по сравнению с другими молекулярными моторами. В многочисленных семействах кинезинов и миозинов отдельные энзимы отличаются по строению тяжелых цепей (Hirokawa, 1998; Sellers, 2000), а гетерогенность наиболее широко распространенного у эукариотов класса динеинов заключается в разнообразии дополнительных полипептидов, которые связаны с ограниченным количеством консервативно устроенных тяжелых цепей.
Пока все еще остается неизвестным, как много биохимически разных изоформ динеина существует в клетке. Тем не менее, на данный момент в клетках различают два типа динеинов, встречающихся в разных клеточных компартментах: цитоплазме и аксонемах ресничек и жгутиков, которые так и называют - цитоплазматический динеин и аксонемный. В геноме челове содержится восемь генов для тяжелой
