Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
Строение микротрубочек 5
Система микротрубочек с центром в центросоме 7
Нуклеация миктротрубочек на центросоме 7
Заякоривание микротрубочек на і{ентросоме 9
Системы микротрубочек, построенные без участия центросомы 10
Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам 13
Структура динеин-динактшового комплекса 14
Взаимодействие микротрубочкого цитоскелета с мембранными органеллами 16
Взаимодействие микротрубочек с клеточным кортексом 26
Цель и задачи исследования 29
Материалы и методы 30
Молекулярное клонирование 30
Rt-pcr и сайт-направленный мутагенез 32
Антитела 32
Культивирование клеток 33
Получение цитопластов 34
Микроскопия 34
Анализ изображений 34
Результаты 36
Система микротрубочек в стареющих цитопластах постепенно утрачивает радиальный характер 36
Хаотизация микротрубочек цитопласта не связана с утратой активности центросомы 36
В стареющих цитопластах не происходит стабилизации микротрубочек 38
Растущие в стареющих цитопластах микротрубочки не прекращают свой рост возле края цитопласта 40
Растущие микротрубочки в стареющих цитопластах не взаимодействуют клеточным кортексом. 41
Находится ли центросома (мтоц) цитопластов в их геометрическом центре 43
Разрушение динеин-динактинового комплекса ведет к хаотизации системы микротрубочек в клетках BSC-1 45
В бесцентросомных цитопластах микротрубочки нуклеируются преимущественно в центральной области 47
Аппарат гольджи и зависимый транспорт не участвуют в формировании радиальной системы микротрубочек 48
Окадаевая кислота эффективно блокирует формирование радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов 49
Ингибирование образования сори окаймления эффективно блокирует образование бесцентросомной радиальной системы микротрубочек 50
Кластеризация eres при сверхэкспрессии конститутивно-активного мутанта sarl a[h79g] происходит только при наличии микротрубочек 53
Кластеризация eres при сверхэксперссии конститутивно активного мутанта зависит от активности динеин-динактинового комплекса 54
Обсуждение 58
Выводы 66
Список литературы 67
- Системы микротрубочек, построенные без участия центросомы
- Взаимодействие микротрубочкого цитоскелета с мембранными органеллами
- Разрушение динеин-динактинового комплекса ведет к хаотизации системы микротрубочек в клетках BSC-1
- Ингибирование образования сори окаймления эффективно блокирует образование бесцентросомной радиальной системы микротрубочек
Введение к работе
Актуальность проблемы
Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками (МТ), актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток.
Интерфазные МТ в большинстве типов культивируемых клеток и в некоторых дифференцированных клетках in situ организованы в радиальную систему: к периферии клетки они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома. На центросоме начинается рост МТ и заякориваются их «минус»-концы. Транспорт вдоль МТ осуществляется при помощи моторных белков -специализированных механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам: динеинам и кинезинам. Динеин перемещаются по направлению к «минус»-концу МТ, а кинезин - к «плюс»-концу. Таким образом, радиальная организация МТ обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта. Однако радиальная система микротрубочек может образовываться и без участия центросомы. Такая система обнаружена, например, в бесцентриолярных фрагментах меланофоров рыб (Rodionov and Borisy, 1997; Cytrynbaum et al., 2004; Malikov et al., 2005), и организаторами этой системы служат меланосомы. В монослое клеток эпидермиса микротрубочки образуют радиально-подобную систему без выраженного центра, где микротрубочки отходят от околоядерной области в направлении к периферии (Lechler and Fuchs, 2007). Другие, помимо центросомы, центры организации системы микротрубочек изучены слабо. Центросома обычно является очень мощным, доминирующим центром организации микротрубочек, и в ее присутствии остальные центры организации микротрубочек могут быть незаметны. Предполагают, что в организации системы микротрубочек в клетках млекопитающих участвуют динеин-динактиновые комплексы, связанные транспортными везикулами или органеллами аппарата секреторного транспорта. Сами везикулы могут организовывать микротрубочки, нуклеируя их, ассоциируясь с ними и передвигаясь по ним, подобно пигментным гранулам во фрагменте меланофора (Malikov et al., 2005). Роль мембран в организации системы микротрубочек практически не исследована, хотя в последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что мембраны аппарата Гольджи содержат белковые комплексы, нуклеирующие и заякоривающие микротрубочки (Efimov et al., 2007).
Очевидно также, что для поддержания радиальной структуры сети микротрубочек, помимо центра организации, важным условием (детерминантом) является остановка роста микротрубочек у клеточной границы. Иначе бы отдельная микротрубочка могла, достигнув мембраны, свернуть и продолжить свой рост в другом направлении, хаотизируя тем самым общую радиальную систему. Роль этого фактора в формировании системы микротрубочек пока оставалась неизученной.
Мы исследовали организацию микротрубочек на экспериментальной модели цитопласта - безъядерных клеток, используя цитопласты, содержащие или не содержащие центросому. Полученные нами данные проясняют некоторые особенности в организации радиальной системы микротрубочек в клетке, а также свидетельствуют о наличии определенных внецентросомных факторов, влияющих на организацию микротрубочек. В частности, нам удалось установить роль компонентов везикулярного транспорта эндоплазматический ретикулум (ЭР) - аппарат Гольджи (АГ) в организации микротрубочек.
Цель и задачи исследования
Целью работы было определение внецентросомных факторов (детерминант), влияющих на организацию системы микротрубочек в культивируемых клетках млекопитающих.
Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Определить, сохраняется ли активность центросомы при разрушении радиальной
системы микротрубочек в стареющих цитопластах.
2. Сравнить взаимодействие микротрубочек с клеточным кортексом в
свежеполученных и в стареющих цитопластах.
3. Выявить, сохраняется ли в стареющих цитопластах активность динеин-
динактинового комплекса.
3. Установить, влияет ли отсутствие взаимодействия микротрубочек с клеточным
кортексом на центральное расположение центросомы в стареющих цитопластах.
4. Определить роль аппарата Гольджи и аппарата раннего везикулярного транспорта в
организации бесцентросомной радиальной системы микротрубочек в цитопластах путем
воздействия брефелдином А и окадаевой кислотой для их ингибирования.
5. Изучить инактивацию и морфологическую перестройку аппарата раннего
везикулярного транспорта при экспрессии в клетках мутантов ГТФ-азы Sari а.
6. Установить роль микротрубочек в образовании центральных скоплений мест выхода
везикул из эндоплазматического ретикулума (ERES) при экспрессии конститутивно-
активного мутанта ГТФ-азы Sarla[H79G].
8. Установить роль динеин-динактинового комплекса в образовании центральных скоплений мест выхода везикул из эндоплазматического ретикулума при экспрессии конститутивно-активного мутанта ГТФ-азы Sarla[H79G].
Основные положения, выносимые на защиту Научная новизна работы
В работе впервые показано, что хаотизация радиальной системы клеточных
микротрубочек возможна при сохранении основных детерминант такой системы:
нуклеирующих и заякоривающих микротрубочки свойств центросомы, динамичных
микротрубочек, активного динеин-динактинового комплекса. Впервые
продемонстрировано, что основной причиной хаотизации системы микротрубочек в экспериментальной модели стареющих цитопластов является отсутствие остановки роста микротрубочек у клеточного кортекса. Это первое прямое доказательство наличия особых условий у края клетки, которые способствуют прекращению роста микротрубочек и их последующей разборке.
Впервые показано, что для организации бесцентросомной радиальной системы микротрубочек необходимы компартменты раннего везикулярного транспорта, и образование радиальной системы микротрубочек ингибируется при инактивации образования СОРП-окаймленных везикул в местах экспорта белков из эндоплазматического ретикулума.
Впервые продемонстрировано, что кластеризация в центре клетки мест экспорта белков из эндоплазматического ретикулума при экспрессии постоянно активной формы ГТФазы Sari а требует наличия микротрубочек, а также активности минус-концевого моторного белка динеина. Этот результат может свидетельствовать о том, что ERES в данных условиях перемещаются по клетке при помощи зависимого от динеина активного транспорта по микротрубочкам.
Теоретическое и практическое значение работы
В работе получены оригинальные, мирового уровня результаты, позволяющие выявить внецентросомные механизмы образования радиальной системы микротрубочек в клетках млекопитающих. Впервые показано, что наряду с центросомой клеточный кортекс играет важную роль в построении данной системы. Роль кортекса состоит в остановке роста микротрубочек, достигших края. В работе предложена экспериментальная модель для изучения роли клеточного кортекса в организации системы микротрубочек.
Кроме того, внесен значительный вклад в понимание образования бесцентросомной радиальной системы микротрубочек, что может быть также
экспериментальной моделью образования и поддержания систем микротрубочек в терминально дифференцированных клетках организма, таких как поляризованный эпителий, миотрубки, клетки эпидермиса и нейроны. В работе показано, что существенную роль в образовании бесцентросомной радиальной системы микротрубочек играет аппарат раннего везикулярного транспорта из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, а при ингибировании этого транспорта образование системы микротрубочек нарушается. Установление микротрубочки-организующей роли аппарата раннего везикулярного транспорта расширяет представления о биологии клетки: о динамике цитоскелета и о функциях отдельных органелл.
В работе сделаны шаги в направлении понимания молекулярных механизмов взаимодействия аппарата раннего везикулярного транспорта и микротрубочек, посредством изучения роли микротрубочек и динеин-динактинового комплекса в образовании агрегатов мест выходв везикул из эндоплазматического ретикулума (ERES) при сверхэкспрессии конститутивно-активного мутанта ГТФ-азы Sari а.
Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебных лекционных и практических курсах по молекулярной биологии клетки.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах группы клеточной биологии Института белка РАН, лаборатории цитоскелета НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, на ежегодных научных конференциях Института белка РАН.
Публикации
По теме диссертации опубликована 1 статья, сделано 2 устный доклада, 2 стендовых сообщения на всероссийских конференциях.
Объем и структура диссертации
Системы микротрубочек, построенные без участия центросомы
В большинстве фибробластоподобных клетках, культивируемых в культуре (Vero, СНО и др.) имеется радиальная сеть микротрубочек с довольно выраженным центром в центосоме, однако в клетках эпителиального происхождения, таких как HeLa система микротрубочек не имеет выраженного центра. Также в очень многих дифференцированных клетках организма система микротрубочек организуется без видимого участия центросомы. Интересно поэтому понять, как же образуются данные системы микротрубочек.
Поведение микротрубочек в эпителиальных культурах отличается от культур фибробластов (Pepperkok et al., 1990; Shelden and Wadsworth, 1993; Waterman-Shtorer et al., 2000). Наблюдаемая здесь скорость роста и разборки микротрубочек с плюс конца медленнее, а периоды колебаний в длине короче (Shelden and Wadsworth, 1993), свободные микротрубочки спонтанно возникают в цитоплазме и их поведение можно описать скорее как динамическую нестабильность, тогда как в фибробластах наблюдается тредмиллинг свободных микротрубочек (Rodionov et al., 1999). Интересно, что изменение параметров динамики микротрубочек зависит от экспрессии Е-кадгерина. При его экспрессии в клетках наблюдается стабилизация минус конца микротрубочки в клетке, что и изменяет динамику микротрубочек (Chansovsky et al., 2000, Shtutman et al., 2008).
Если рассматривать клетки поляризованного эпителия, например, MDCK1 или Сасо-2, то в разреженной культуре они имеют фибробластоподобный вид с радиальной системой микротрубочек. Однако при достижении монослоя система микротрубочек в клетке постепенно изменяется, в дифференцированном состоянии она становится нецентросомно организованной: минус-концы микротрубочек заякорены в районе апикальной части плазматической мембраны, а плюс-концы направлены к базолатеральной мембране (Meads and Schroer, 1995). Так образуется система полярно ориентированных микротрубочек, обеспечивающих направленный транспорт везикул от одной мембраны к другой. Причем эффективный сортинг везикул в поляризованных клетках зависит от наличия такой системы микротрубочек (Miinsh, 2004).
Похожем же образом организуется система микротрубочек у гепатоцитов, там апикальный кортекс, заякоривающий минус-концы микротрубочек, располагается в той части гепатоцита, которая обращена к желчному протоку (Ihrke et al., 1993).
В поляризованных эпителиальных клетках, кроме параллельных оси микротрубочек в толще клетки, также присутствуют микротрубочки в подмембранной области апикалькальной части базальной мембраны, где образуется специальная сеть из микротрубочек смешанной полярности (Bre et al., 1987). Данная система также далеко не случайна, а имеет отдельные области, где микротрубочки перекрещиваются, а также замедляется деполимеризация минус-конца микротрубочки. В результате образуется паутиноподобная сеть, где в свою очередь точки нуклеации не совпадают с узелками сети (Reilein et al., 2005).
В неполяризованных эпителиальных клетках можно наблюдать систему микротрубочек без выраженного центросомного центра организации (Grindstaff et al., 1997). Такая система микротрубочек близка к радиальной, однако микротрубочки здесь отходят от области ядра, где сконцентрированы их минус концы, подобную же картину можно наблюдать в кератиноцитах эпидермиса (Lechter and Fuchs, 2007).
Еще одним примером образования нецентросомной системы микротрубочек является дифференцировка миобластов в миотрубки, которая происходит при образовании мышечной ткани. В недифференцированных миобластах можно наблюдать характерную фибробластоподобную систему микротрубочек с центром, организованным центросомой (Pizon et al., 2005). Однако при дифференцировке миобласты начинают сливаться в миотрубки, при этом происходит перестройка системы микротрубочек в слитых клетках, активность центросомы исчезает, а микротрубочко-нуклеирующие белки перераспределяются с центросомы в околоядерную область (Fant ct al., 2009). Вследствие этого микротрубочки начинают тянуться до всей длине получившейся клетки (Pizon et al., 2005).
В нейронах также микротрубочки полимеризуются на центросоме, которая находится в теле нейрона. Однако в отростках представлены свободные микротрубочки, расположенные вдоль их оси (Signor and Scholey, 2000, Bartolini and Gundersen, 2006), Интересно, что полярность микротрубочек различна в аксоне и дендрите: в аксоне микротрубочки ориентированы минус-концами к телу нейрона, а плюс концы смотрят на периферию, а в дендритах присутствуют микротрубочки смешанной полярности (Baas et al., 1988). Это достигается путем направленного транспорта микротрубочек в дендриты.
Таким образом, можно видеть, что достаточно часто в интерфазе система микротрубочек организуется без участия центросомы. Интересно было бы определить, существуют ли в данном случае МТОЦ, или же это происходит по механизму самоорганизации. Для изучения бесцентросомной организации сети микротрубочек удобно использовать модели, которые представляют собой безъядерные клетки - цитопласты. Для получения цитопластов обычно используют метод центрифугирования в присутствии нокодазола (разборка микротрубочек) и цитохалазина D или латранкулина В (разборка актиновых филаментов) (Karsenti et al., 1984). Причем в присутствии нокодазола и цитохалазина D (или латранкулина В) получаются как цитопласты, содержащие центросому, так и лишенные ее, а при добавлении в среду лишь цитохалазина В получаются только содержащие центросому цитопласты. В результате при использовании линии клеток мышиных фибробластов L 929 Karsenti с соавт. (1984) показали, что цитопласты с центросомой образовывали радиальную систему микротрубочек, а у бесцентросомных система микротрубочек была хаотической. Другой способ получения цитопластов состоит в отрезании стеклянной иглой части цитоплазмы с ядром. Такие цитопласты получали из клеток культуры эпителия почки зеленой мартышки BSC-1, отделяя фрагмент, содержащий ядро (кариопласт), от участка цитоплазмы с центросомой (Maniotis and Schliwa, 1991). Далее при наблюдении за системой микротрубочек в полученных кариопласте и цитопласте оказалось, что при коротких интервалах инкубации (порядка 1 часа) после операции радиальную систему микротрубочек образовывал цитопласт с центром в центросоме, тогда как у кариопласта система микротрубочек становилась хаотической. Однако при длительном времени инкубирования (порядка 20 часов) ситуация менялась, и уже радиальную систему микротрубочек образовывал кариопласт (бесцентросомный), восстанавливавший нормальные размеры клетки, но не центросому. Впрочем, для некоторых видов клеток в более поздних работах показана возможность восстанавливать центросому de novo (La Terra et al., 2005). У цитопласта же система микротрубочек становилась хаотической. Можно было предположить, что в стареющем цитопласте теряла свою активность центросома.
Взаимодействие микротрубочкого цитоскелета с мембранными органеллами
Большинство животных клеток пигментных гранул не имеет, однако и другие мебранные органеллы могут принимать участие в организации микротрубочек. Они должны содержать на своей мембране белки, которые способны вызывать нуклеацию микротрубочек и способствовать их заякориванию. Взаимодействуя с радиальной системой микротрубочек, организованной центросомой, микротрубочки, организованные другими органеллами, нарушают структуру сети или способствуют поддержанию ее упорядоченности, что служит регулированию внутриклеточного транспорта. В качестве органелл, участвующих в организации микротрубочек, могут выступать аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ЭР), аппарат везикулярного транспорта между ЭР и аппаратом Гольджи, эндосомы и т.д. Вероятнее всего, митохондрии, хотя и транспортируются по микротрубочкам, не принимают участия в их организации, во всяком случае, мы не обнаружили данных на этот счет. ЭР, как правило, равномерно заполняет значительную часть объема клетки, поэтому может организовывать только хаотичную сеть микротрубочек. Аппарат Гольджи обычно представляет собой достаточно компактную мембранную структуру, расположенную в центре клетки возле центросомы. Структурная целостность и расположение аппарата Гольджи в клетках зависят от микротрубочек: при разрушении микротрубочек аппарат Гольджи фрагментируется (Рис.4), и его отдельные фрагменты распределяются по всей клетке (Cole et al., 1996). Аналогичный фенотип наблюдается также при ингибировании клеточного динеина, т.е. при нарушении зависимого от динеина клеточного транспорта. Ингибирование динеина достигают путем экспрессии компонента динактинового комплекса белка р50, что приводит к разрушению динактинового комплекса (Burhard et al., 1996) или же при продукции в клетке фрагмента СС1 белка динактина pl50Glued, который также ингибирующе действует на активность динеинового мотора (Quintyne et al., 1999).
Везикулярный транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи происходит одновременно в двух направлениях: прямом (антероградном) от ЭР в аппарат Гольджи и обратном (ретроградном), причем в ретроградном направлении доставляются компоненты ЭР, либо рециклирующие, либо синтезированные в аппарате Гольджи. При транспорте происходит отпочковывание везикул от ЭР или от цистерн Гольджи, их перенос по цитоплазме и слияние с рецепиентной структурой. При прижизненных наблюдениях клеток отчетливо видны везикулы, перемещающиеся между ЭР и аппаратом Гольджи по микротрубочковым трекам (Presley et al., 1997). Образование везикул на ЭР происходит в специальных доменах, называемых endoplasmic reticulum exit sites (ERES). После отпочковывания происходит слияние везикул между собой с образованием ERGIC (ER Golgi intermediate carrier/compartment) (Hauri et al., 2000, Appenzeller-Herzog С and Hauri, 2006) или, по другой терминологии, VTC (vesicule tubule clusters) (Altan-Bonnet et al., 2004). Динамику последнего можно наблюдать, используя термочувствительный мутант вирусного белка VSV-Gts045 (Presley et al., 1997). Он не может покинуть ЭР при 40С, и процесс экспорта легко синхронизировать, проинкубировав клетки некоторое время при этой температуре. Если понизить температуру до 15 С, VSV-G скапливается в кластерах возле ERES, которые при 32С начинают очень процессивно двигаться в область аппарата Гольджи по микротрубочкам (Presley et al., 1997). Белок ERGIC53, который является транспортным посредником для многих секретируемых белков (Appenzeller, 1999), постоянно мигрирует между ЭР, ERGIC и аппаратом Гольджи (Рис 6) (Klumperman et al., 1998). При экспрессии в клетках слитого с GFP ERGIC53 можно наблюдать, что он в основном локализован в относительно стационарных кластерах, находящихся возле ERES и в везикулах, быстро перемещающихся от одного кластера к другому (Benekaya et al., 2004). При разборке микротрубочек нокодазолом пул везикул исчезает (Benekaya et al., 2004).
Почему происходит фрагментация аппарата Гольджи при нарушении зависимого от микротрубочек транспорта, в том числе при разрушении самих микротрубочек? Можно предположить, что при разрушении микротрубочек происходит «разъезжание» отдельных цистерн аппарата Гольджи по остаточным микротрубочкам при помощи кинезина-1 (Minin, 1997). Однако скорее всего механизм диспергирования аппарата Гольджи несколько иной. Дело в том, что ретроградный транспорт белков аппарата Гольджи мало зависит от наличия микротрубочек, поскольку везикула, покидающая аппарат Гольджи, легко находит ЭР в различных местах клетки. Везикула же, покидающая ЭР, с трудом может найти компактный аппарат Гольджи в объеме клетки, и ей нужны микротрубочки, чтобы следовать в нужном направлении. При воздействии нокодазола, разрушающего микротрубочки, происходит блокада в основном антероградного везикулярного транспорта (Cole et al., 1996). Везикулы, покидающие ЭР, мигрируют на небольшие расстояния, поэтому возле ERES формируются мини-цистерны аппарата Гольджи (Cole et al., 1996), а исходное скопление цистерн аппарата Гольджи в центре клетки рассасывается, поскольку из-за преобладания ретроградного транспорта происходит перераспределение белков аппарата Гольджи в ЭР (Рис. 5). Данный процесс ускоряется кинезином, работающим на стабильных к разборке нокодазолом микротрубочках, поэтому при ингибировании кинезина фрагментация аппарата Гольджи замедляется (Minin, 1997).
Транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи тоже может проходить и без участия микротрубочек, хотя, вероятно, и с меньшей скоростью и эффективностью. Так, секреторные белки типа VSV-G или проколлагена секретируются клеткой и в отсутствие микротрубочек (Musch, 2004). В каждый конкретный момент мы видим некоторое стационарное состояние распределения органелл везикулярного пути, определяемого скоростями прямого и обратного транспорта, последние же напрямую зависят от микротрубочкового цитоскелета и активности моторов (Altan-Bonent et al., 2004). Микротрубочковые моторы, связываясь с определенными везикулами, определяют скорость и направление того или иного транспорта, регулируя при этом динамику общего процесса.
Разрушение динеин-динактинового комплекса ведет к хаотизации системы микротрубочек в клетках BSC-1
В настоящей работе мы обнаружили, что в стареющих цитопластах изменены свойства клеточного кортекса и микротрубочки не взаимодействуют с ним - они изгибаются и уходят назад в цитоплазму, достигнув края клетки. Также отсутствуют плюс концевые кометы белка pl50Glued у края клетки, что может свидетельствовать об отсутствии динамической нестабильности - осцилляции микротрубочки после достижения ей клеточного кортекса. При экспрессии белка CLIP170-YFP часто наблюдались плюс-концевые кометы, которые не исчезали после достижения края, а изменяли свое направление роста и продолжали рости далее.
Из наших данных следует, что изменение динамики микротрубочек у края клетки вызвано не просто механическим препятствием, но активным взаимодействием микротрубочки и кортекса. Исходя из полученных данных, можно предложить следующую модель хаотизации микротрубочек в цитопласте с течением времени. Предположим в кортексе, имеется специфический фактор, ответственный за остановку роста микротрубочки у края. Данный фактор пока остается неизвестным, хотя в настоящее время в литературе описаны ряд белков, которые могут влиять на динамику плюс конца вблизи края клетки, например, это белки Clasp (Mimori-Kiyosue et al., 2004), APC (Nathke et al., 1996), ACF7/MACF1 (Kodama et al., 2003) и другие. В присутствии данного деполимеризующего фактора клеточный кортекс является активным деполимеризатором миротрубочек. При предположении, что число сайтов нуклеации на центросоме конечно, отрастающие от центросомы микротрубочки не могут исчерпать весь пул димеров тубулина, потому что, дорастая до кортекса, они не могут расти далее. Ситуация меняется, когда цитопласт теряет деполимеризующий фактор. В этом случае микротрубочки могут расти и после достижения ими кортекса, меняя направление своего роста. Теперь они конкурируют между собой за димеры тубулина, и преимущество получают случайно отобранные более длинные микротрубочки, у которых меньше шансов деполимеризоваться полностью при катастрофе. Данная ситуация как раз происходит в системе in vitro (Kirschner and Mitchison, 1986): средняя длина микротрубочек увеличивается по мере инкубации.
В литературе имеются данные, что взаимодействие микротрубочки с клеточным кортексом может быть предметом регуляции. Так было показано, что Wnt сигнальный каскад может ингибировать деполимеризацию микротрубочек у кортекса в растущем аксоне и они начинают загибаться обратно, что сильно затрудняет дальнейший рост аксона (Purro et al., 2008). В этом случае при запускании Wnt каскада происходит потеря белка АРС с плюс конца микротрубочки (Purro et al., 2008).
Интересные данные, полученные при исследовании цитопластов, относятся к механизму центрирования центросом. Хотя микротрубочки в стареющих цитопластах часто растут параллельно кортексу, и приложенные к ним тянущие усилия минус-концевого динеинового мотора, закрепленные на кортексе, не могут прямо влиять на положение центросомы, центросома в последних находится вблизи центроида. Это может подтверждать модель центрирования, которая говорит, что центровкой центросомы занимаются динеиновые моторы, закрепленные по всей цитоплазме, а не только на краю клетки (Valee and Stehman, 2005). Действительно, такая модель должна работать в нашей системе с внешне хаотическими микротрубочками, поскольку при нуклеации микротрубочки на центросоме она сначала растет до периферии, образуя радиальный участок своей длины, а затем только загибается и продолжает свой рост, но силы, приложенные ко второму участку длины микротрубочки, уже играют второстепенную роль в центровке, так как они уже не "тянут" саму центросому.
В цитопластах, полученных из клеток BSC-1 и HeLa, возможно формирование бесцентросомной радиальной сети микротрубочек. В клетках HeLa подобный механизм играет, по-видимому, основную роль из-за низкой активности самой центросомы, что выявляется после деполимеризации микротрубочек с последующим восстановлением. В результате мы можем наблюдать в основном свободные микротрубочки в клетках HeLa по сравнению с выраженной центросомной звездой микротрубочек в BSC-1. Для формирования бесцентросомной системы микротрубочек также, по-видимому, необходимо участие динеиновых комплексов. При ингибировании функции динеина при сверхпродукции фрагмента СС1 белка р150 lued радиальная система микротрубочек разрушается, как у клеток Vero, где эта система организована центросомой, так и у клеток HeLa, которые образуют ее и без участия центросомы и у бесцентросомных цитопластов BSC-1. Это может говорить о том, что функция динеина важна для построения бесцентросомной радиальной системы микротрубочек. Следовательно, для исследования более детального механизма образования радиальной системы микротрубочек необходимо определить возможные органеллы клетки, которые принимают участие в формировании радиальной системы микротрубочек без участия центросомы.
Возможно, данной функцией обладают органеллы везикулярного транспорта, которые тесно связаны с микротрубочковым цитоскелетом. Причем мы обратили внимание на ранний везикулярный транспорт - из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и обратно, так как прямое его направление идет в направлении центра клетки, где локализован аппарат Гольджи к минус концам микротрубочек, за что как раз ответственны динеиновые моторы, необходимые для построения бесцентросомной системы микротрубочек. Следовательно, отпочковавшаяся от ERES везикула должна нести на себе динеиновые моторы, чтобы быть доставлена к аппарату Гольджи. Нами было предположено, что данный сегмент транспорта имеет постоянную динеиновую активность, которая, возможно, может быть движущей силой и организации самих микротрубочек.
Чтобы проверить настоящую гипотезу, необходимо заингибировать прохождение транспорта ЭР-аппарат Гольджи и посмотреть, как это отразится на системе бесцентросомных микротрубочек. Предполагалось, что формирование бесцентросомной радиальной сети микротрубочек идет за счет образования из диспергированного состояния компактной структуры аппарата Гольджи после отмывки нокодазола (Malikov et al., 2005). Также аппарат Гольджи является внецентросомным нуклеатором микротрубочек (Efimov et al., 2007), что впрочем, и было подтверждено также в нашей работе, так как у цитопластов с отсутствующей явной центросомной нуклеацией микротрубочек, последние все равно нуклеировались в центральной области, которую занимает как раз аппарат Гольджи.
Роль аппарата Гольджи легко проверить действием брефелдина А, который полностью его диспергирует (Lippincott-Scwartz et al., 1990). В нашей работе брефелдин не препятствовал возникновению радиальной системы микротрубочек, то есть она собиралась в отсутствие аппарата Гольджи. Это казалось удивительным, поскольку остальные органеллы системы везикулярного транспорта не занимают в клетке четко выраженной центральной позиции, что казалось бы необходимым для образования микротрубочко-организующего центра.
В отсутствие COPI зависимого транспорта, заингибированого брефелдином, СОРИ-зависимый транспорт происходит нормально, и промежуточный компартмент ERGIC сохраняется. Сохраняется и ERES, причем различия ERES и ERGIC в настоящее время признаются не всеми группами, работающими в этой области. Для обеих органелл показано возможность связывания с динеин-динактиновым комплексом. Роль этих органелл в радиальной организации микротрубочек, тем не менее, считалась сомнительной, поскольку они распределены в виде везикулярных структур по всей клетке, кроме того, не являются подвижными органеллами.
Ингибирование образования сори окаймления эффективно блокирует образование бесцентросомной радиальной системы микротрубочек
В этой связи нам было очень интересно более подробно разобраться с действием другого мутанта малой ГТФ-азы Sari а - конститутивно-активного. При действии данного мутанта ингибируется отпочковывание СОРП-окаймленных везикул, но при этом окаймление как бы остается замороженным на мембранах ERES, и они образуют скопления в центре клетки (Ward et al., 2001). Также белки-маркеры ERGIC и некоторые маркеры аппарата Гольджи, а именно гольджины - белки, образующие внешний каркас аппарата Гольджи, колокализуются с данными скоплениями. Из-за этого вначале было сделано предположение, что скопления ERES есть остаточная часть аппарата Гольджи, которая не чувствительна к действию Sarla[H79G] (Seemann et al., 2000). Однако, данный конгломерат устойчив к действию брефельдина А, более того, если в преинкубированные с BFA клетки инъецировать рекомбинантную Sar[H79G], то образующиеся везикулярные структуры по всей клетке сходятся в центральную область, независимо от того, был или нет отмыт брефельдин A (Ward et al., 2001). Можно также заметить, что другими авторами было показана возможность прямой сборки диспергированных нокодазолом цистерн аппарата Гольджи путем их кластеризации в достаточно специализированной культуры клеток сетчатки глаза (Miller et al., 2009).
Так как при сверхэкспрессии Sar[H79G] отсутствуют другие органеллы раннего везикулярного транспорта, кроме ERES/ERGIC (Ward et al., 2001), по-видимому, сборка скоплений ERES/ERGIC является основной движущей силой образования радиальной системы микротрубочек без участия центросомы. Поняв молекулярные механизмы сборки данных скоплений, впоследствии их можно применить для исследования роли в построении бесцентросомной радиальной системы микротрубочек.
Нами было показано, что образование такого конгломерата зависит от присутствия микротрубочек, и при их деполимеризации можно наблюдать разделение конгломерата на отдельные части. При этом само диспергирование в системе везикулярного транспорта может происходить по-разному. Диспергирование аппарата Гольджи происходит не прямо, а в результате рециркуляции его компонентов, через эндоплазматический ретикулум, то есть отдельные мембраны аппарата Гольджи формируются на периферии de novo. Противоположный пример - это прямое схождение-расхождение везикулярных структур, к примеру, транспорт пигментных гранул в меланоцитах Xenopus, которое как раз может организовывать микротрубочки (Malikov et al., 2005).
В случеае кластера ERES при сверхэкспресси Sar[H79G] мы имеем дело как раз с прямым диспергированием и агрегированием, как нами было показано при прижизненном наблюдении. Тогда следует ожидать, что образование такого кластера связано с действием минус-концевого мотора динеина, который вместе со своим кофактором динактином должен привлекаться на эти мембраны для их перемещения. Информация о связывании и регулировании динеина при сверхэкспресси Sar[H79G] и образование кластера ERES является, скорее всего, ключевой для понимания механизма образования радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов, так как формирование последней зависит от активности динеина и ингибируется при сверхэкспрессии р150-СС1.
В работах других авторов было показано ранее, что С-концевой фрагмент белка pl50-Glued (СТ-р150) может связываться с белком СОРИ окаймления Sec23 (Watson et al., 2005), тем самым возможно привлечение динеина к окаймленной везикуле. Мы решили проверить, будет ли сверхэкспрессия данного фрагмента ингибирующе действововать на образование кластера ERES. Для этого клетки были котрансфицированы GFP-CT-pl50 и HA-Sar[H79G]. Оказалось, что сверхэкспрессия СТ-р150 не влияет на образование кластера, причем сам С-концевой фрагмент достаточно хорошо колокализуется с образующимся скоплением ERES. В качестве отрицательного контроля нами был выбран междоменный участок белка р150 (MD-pl50), который также не влиял на образование кластера, но, что удивительно, также колокализовался со скоплением. Нами было предположено, что этот участок также может принимать участие в направление динеин-динактинового комплекса к ERES, и тем самым это объясняло бы отсутствие эффекта при сверхэкспрессии одного только С-концевого фрагмента. Для проверки данного предположения нами был коэкспрессирован участок белка р150, содержащий оба этих фрагмента (MD-CT), однако результат был таким же, как и экспрессии отдельно СТ и MD.
В качестве положительного контроля мы использовали СС1 фрагмент белка р150, который ингибирующе действует на динеин-динактиновый комплекс (Quentine et al., 1999). В этих условиях кластер не формировался, и можно было наблюдать диспергированные везикулярные структуры. Такой же эффект оказывал фрагмент белка р150, у которого отсутствовал N-концевой участок (pl50-delta head), однако имелся СС1 фрагмент. Отдельно же экспрессированый N-концевой участок не оказывал никакого влияния на образование кластера.
Сама колокализация с кластерами СТ и MD фрагментов может быть следствием двух причин: либо это опосредуется связыванием с Sec23, либо же, чего нельзя исключать, это есть последствие димеризации данного фрагмента с полноразмерным р150, присутствующим в комплексе (Shroer, 2004). Известно, что участки СТ и MD входят в часть молекулы pl50Glued, погруженную в «плечо» динактина, т.е. в комплекс Arpl филамента и динамитина. Возможно, что фрагменты MD-CT связываются с «плечом» динактина, содержащим также и полноразмерную молекулу pl50Glued, что делает комплекс функционально полноценным. Также нельзя исключать прямое взаимодействие Sarla[H79G] с моторными белками. Данные о таком взаимодействии были получены в экспериментах с пермеабилизованными клетками. У этих клеток вымывалось большинство цитоплазматических белков, но оставались внутренние мебраны. При добавлении Sarla[H79G] формировались мембранные тубулы, причем интересно, что тубулы не формировались, если перед пермеабилизацией микротрубочки у таких клеток были разрушены (Aridor et зі., 2001). Очень интересным примером, возможно, подтверждающим, что у ERES могут иметься функции в клетке, связанные с микротрубочковым цитоскелетом, являются последние данные об образовании аксона, формирование которого зависит от индукции полимеризации микротрубочек в нейрите с последующей их там стабилизацией (Poulain and Sobel, 2009). На ранних стадиях формирования аксона происходит специфическое накопление ERES в формирующимся отростке, и если заингибировать СОРИ активность ERES путем сверхэкспрессии мутанта Sarla[T39N] то формирование аксона сильно затруднено (Aridor and Kenneth, 2009).
![Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания](/i/i/4306/51263.png "Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания Крындушкин Дмитрий Сергеевич")