Содержание к диссертации
Введение
ГлаваІ. ОБЗОР ЛИ ГЕРАТУРЫ 10
1.1. Структура и функции дрожжевой РНК 10
1.2. Выделение РНК из пекарских дрожжей 13
1.3. Гидролиз дрожжевой РНК 21
1.4. Использование мономеров дрожжевой РНК для синтеза лекарственных препаратов 23
1.4.1. Аденозин 23
1.4.2. Инозин 24
1.4.3. Гуанозин 25
1.4.4. Цитидин 26
1.4.5. Уридин 27
1.5. Биологическая активность дрожжевой РНК 28
1.5.1. Иммуномодуляция 28
1.5.2. Стимуляция метаболизма 29
1.5.3. Детоксикация 30
1.5.4. Стимуляция репарации, роста и размножения клеток ..31
1.5.5. Токсичность 31
1.6. Клиническое применение дрожжевой РНК 32
1.7. Биологическая активность и клиническое применение высокополимерной дрожжевой РНК 33
1.8. Резюме 34
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ . 36
2.1. Экспериментальные животные 36
2.2. Материалы 36
2.3. Аналитические методы 37
2.4. Препаративные методы 40
2.4.1. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей 40
2.4.2. Выделение высокополимерной РНК из пекарских дрожжей(йариант 1) 41
2.4.3. Выделение высоко- и низкополимерной РНК из
пекарских дрожжей (вариант 2) 43
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 48
3.1. Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей 48
3.2. Выделение фракций РНК различной степени полимерности из пекарских дрожжей 60
3.3. Иммобилизация и некоторые свойства иммобилизованных ферментов нуклеинового обмена из ядов змей 77
3.4. Биологическая активность РНК из пекарских дрожжей... 84
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102
ВЫВОДЫ 105
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
- Структура и функции дрожжевой РНК
- Экспериментальные животные
- Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дрожжевая РНК представляет собой смесь
полирибонуклеотидов разных молекулярных масс. Высокополимерная
составляющая дрожжевой РНК биологически наиболее активна и является,
например, специфическим стимулятором биосинтеза белка в кроветворных
и иммунокомпетентных органах крыс - селезенке, почках, тимусе и костном
мозге (Панин Л.Е., Харьковский А.В., 1995; Панин Л.Е., Харьковский А.В.,
1997). Этот препарат с фирменным названием Полирибонат в последнее
время используется в ветеринарии (Соколов В.Д. и др., 1992; Ноздрин Г.А.,
Донченко А.С., 1997; ).
Биологические испытания показали, что он является иммуномодулятором и адъювантом (Ред. Масычева В.И. Сб. науч.трудов сотр. НИКТИ БАВ, 1996). Завершены доклинические и 1 фаза клинических испытаний Полирибоната в качестве адъювантного средства. Проведены также его клинические испытания на больных хронической лейкопенией (Масычева В.И. и др., 1997). Полученные результаты свидетельствуют о выраженном иммуномодулирующем и лейкостимулирующем эффекте.
Натриевая соль низкополимерной дрожжевой РНК (нуклеинат натрия) давно применяется в медицине при лечении широкого круга заболеваний: от вирусных инфекций до расстройств памяти (Брехман И.И., 1976; Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Земсков В.М. и др., 1985; Земсков A.M., Земсков В.М., 1991; Крылов И.А. и др., 1992; Ершов Ф.И., 1998). тРНК используется в научных исследованиях. Мономеры РНК в виде нуклеозидов и 5Ч-мононуклеотидов имеют самостоятельное значение и могут служить исходными соединениями для синтеза олигонуклеотидов, нуклеозид-5ч-трифосфатов и ряда лекарственных препаратов (Земсков В.М. и др., 1985).
Несмотря на большой интерес к дрожжевой РНК, описанные в литературе способы выделения ее высокополимерной фракции недостаточно эффективны и требуют совершенствования. Классический способ выделения РНК фенольной экстракцией (Holley R.W., 1963; Филиппович Ю.Б. и др., 1982) в препаративных масштабах неприменим из-за проблем с утилизацией отходов Экстракция додецилсульфатом натрия (ДДС-Na) в условиях, предложенных Крестфилдом и соавт. (Crestfield A.M. et al, 1955), приводит к получению препаратов, разрушающихся при продолжительном хранении, вероятно, из-за неполной инактивации рибонуклеаз. Добавки ингибиторов рибонуклеаз не решают проблему и удорожают процесс.
Цель работы - создать методическую базу для организации на ее основе безотходного производства чистой биологически активной высокополимерной дрожжевой РНК на основе использования доступных реагентов и оборудования путем оптимизации отдельных процедур получения и фракционирования экстрактов дрожжевой биомассы.
Задачи исследования:
Изучить влияние на процесс лизиса клеток дрожжей различных ПАВ, концентрации наиболее эффективного ПАВ, температуры, времени и присутствия ингибитора рибонуклеаз (ЭДТА). Оптимизировать условия лизиса.
Разработать новые способы выделения суммарной РНК из пекарских дрожжей и получения ее фракций различной степени полимерности, в том числе высокополимерной. Исследовать возможность замены высокоскоростного центрифугирования на простое отстаивание.
Разработать экономичный способ получения нуклеозидов и 5'-мононуклеотидов путем гидролиза некондиционных партий и отходов производства дрожжевой РНК иммобилизованными ферментами нуклеинового обмена из ядов змей.
Провести оценку биологической активности суммарной и высокополимерной дрожжевой РНК в экспериментах in vivo.
Научная новизна полученных результатов.
Детально изучены условия лизиса клеток дрожжей и оптимизированы методы извлечения РНК из лизата. На основе этих исследований предложены три новых способа выделения высокополимерной РНК из дрожжей. Лизис биомассы проводили разработанным нами методом: 2,5%-ным раствором ДДС-Na при 100С в течение > 40 мин.
Впервые при выделении высокополимерной РНК вместо центрифугирования в качестве основного приема фракционирования лизатов предложено использовать отстаивание, которое можно проводить как на холоду (0-4С), так и при комнатной температуре. Скорость отстаивания можно регулировать изменением состава дисперсионной среды.
Впервые для высаливания высокополимерной РНК из осветленного лизата был применен З М NaCl. Из оставшейся фракции выделена низкополимерная РНК осаждением соляной кислотой.
Разработан принципиально новый метод дробного осаждения РНК этанолом, с помощью которого из суммарной РНК выделена высокополимерная и тРНК-подобная фракции.
Физико-химические свойства высокополимерной РНК превосходят таковые, получаемые по традиционным процедурам, особенно это касается близкого к нулевому прироста КРФ.
Фосфодиэстеразы из ядов кобры и гюрзы иммобилизованы на CNBr-активированной сефарозе 4В с выходом 80-90%. Показана возможность
длительной эксплуатации колонок с иммобилизованными ферментами (по крайней мере, в течение двух месяцев).
Исследована биологическая активность трех препаратов РНК из пекарских дрожжей: суммарной РНК и высокополимерной РНК с разными распределениями по молекулярным массам. Впервые показано, что препараты РНК различной степени полимерности и чистоты действуют на разные органы и ткани крыс, стимулируя избирательно в них биосинтез белка.
Научно-практическое значение работы. Проведенные исследования позволяют значительно упростить технологию выделения и фракционирования дрожжевой РНК. Особенно это касается нового метода дробного осаждения РНК этанолом и нового способа выделения двух фракций РНК: высоко- и низкополимерной путем простого отстаивания. Замена центрифугирования на быстрое отстаивание при комнатной температуре позволяет не только упростить технологический процесс, но и снизить затраты на электроэнергию и оборудование.
Обнаруженное в работе избирательное воздействие препаратов дрожжевой РНК различной степени полимерности и чистоты на разные органы и ткани лабораторных животных после дальнейшего исследования может послужить основой для создания новых лекарственных средств.
Основные положения, выносимые на защиту:
Эффективный лизис клеток пекарских дрожжей достигается при обработке 2.5%-ным раствором ДДС-Na при 100С в течение > 40 мин.
Выделение высокополимерной РНК из лизата пекарских дрожжей может быть осуществлено в течение < 4 сут методом седиментации при 1 g и комнатной температуре.
Суммарная и высокополимерная дрожжевая РНК могут быть осаждены из осветленного лизата пекарских дрожжей З М NaCl.
Дробное осаждение 36%-ным этанолом позволяет осуществлять фракционирование суммарной РНК пекарских дрожжей по молекулярной массе.
Иммобилизация (ЬосЛодиэстетэаз из ялои кобпы и гюпзы на CNBr-
Л. X ± 1 1
активированной сефарозе 4В может быть осуществлена с выходом по активности 80-90%.
6. Препараты дрожжевой РНК различной степени полимерности и
чистоты действуют на разные органы и ткани крыс.
Высокополимерная РНК с молекулярным распределением 250-700
нуклеотидов избирательно стимулирует биосинтез белка в клетках
красного костного мозга.
Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации доложены на XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), на Второй научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), на IX Дальневосточной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2005) и на 4-ом съезде «Союза биотехнологов России» (Пущино, 2006). По теме диссертации имеется 7 печатных работ.
Структура и функции дрожжевой РНК
Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются простейшими одноклеточными эукариотическими организмами, т.е. как и все эукариоты содержат ограниченное оболочкой клеточное ядро. Генетическая информация, заключенная в ядерной ДНК дрожжей реализуется в структуре белков при посредстве РНК. Согласно современным представлениям, эукариотическая РНК представляет собой смесь полирибонуклеотидов разных молекулярных масс и включает в себя мРНК, тРНК, рРНК (Страйер Л., 1985), а также ряд минорных компонентов (Сингер М., Берг П., 1998) и природные олигорибонуклеотиды (Grigorieva E.V., Rykova V.I., 1995; Umbreit J.N., 1996а; Umbreit J.N., 1996b; Григорьева Э.В., Рыкова В.И., 1997; Рыкова В.И. и др., 2000).
мРНК (матричная РНК) пекарских дрожжей - одноцепочечный линейный нерегулярный гетерополирибонуклеотид со степенью полимерности от 500 до 5000 нуклеотидов. Составляет 1-5% всей клеточной РНК (Tuite M.F., Oliver S.G., 1991). Переносит информацию для синтеза белка от ДНК к рибосомам. Мономерами мРНК являются 4 основных рибонуклеозида: В составе РНК нуклеозиды связаны между собой 3 , 5 -фосфодиэфирными связями, устойчивыми в кислоте, но лабильными в щелочи. мРНК неуязвима для 5 -экзонуклеаз, поскольку имеет на 5 -конце так называемую шапочку - «кеп» из 7-метилгуанозина (Sripati СЕ. et al., 1976). На 3 -конце мРНК содержит poly(A) - хвост длиной -50 нуклеотидов (McLaughlin C.S. et al., 1973), что делает ее мало уязвимой для 3 -экзонуклеаз. Однако для эндорибонуклеаз молекулы мРНК доступны. В то же время мРНК очень чувствительна к повреждениям структуры, поскольку несет большую информационную нагрузку, смысл которой исчезает при появлении единственного разрыва. По этой причине выделение целостной мРНК требует особой тщательности.
тРНК (транспортная РНК) пекарских дрожжей - линейный нерегулярный гетерополирибонуклеотид со степенью полимерности от 73 до 93 нуклеотидов. Составляет 10-20% всей клеточной РНК (Ямковой В.И., 2001). Выполняет акцепторную и адапторную функции. Состоит из тех же мономеров, что и мРНК. Однако в составе тРНК много редких (минорных) нуклеозидов.
Экспериментальные животные
Исследования были проведены на 25-и крысах (самцах) линии Вистар, массой 180-250 грамм, полученных из вивария Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (СО РАМН, г. Новосибирск). Животные содержались на стандартном рационе ad libitum.
В работе были использованы прессованные (содержание воды -10%) и сухие пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Новосибирский дрожжевой завод); контрольный образец высокополимерной РНК с молекулярным распределением 100-500 нуклеотидов и суммарная дрожжевая РНК, выделенная по методу Крестфилда и соавт. (1955), полученные из Научно-исследовательского конструкторско технологического Института биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор», г.Бердск); рибосомальная РНК (маркеры для электрофореза) и суммарная дрожжевая тРНК любезно предоставленные Г.Г.Карповой, В.В.Власовым и Г.А.Невинским из Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН, г.Новосибирск); яды кобры (Naja naja oxiana) и гюрзы (Vipera lebetina), полученные .
Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей
Главная цель настоящего исследования - разработать технологию и получения чистой высокополимерной дрожжевой РНК. Первым этапом такого процесса, очевидно, должно являться получение суммарной РНК, которая может служить исходным продуктом для дальнейшей очистки. В ходе последующих этапов фракционирования суммарной РНК должны были быть получены и другие фракции РНК, изучение которых позволит найти направления их использования. В частности, из низкомолекулярных фракций может быть получена, например, тРНК. Кроме того, суммарная дрожжевая РНК - традиционное исходное сырье для производства нуклеозидов, моно- и олигорибонуклеотидов. Набор продуктов, которые і могут быть получены из суммарной дрожжевой РНК, представлен на рис. 1. В настоящей работе предлагается простой и эффективный способ выделения суммарной РНК из пекарских дрожжей, который позволяет избежать недостатков предыдущих методик.
Выделение РНК из дрожжей начинают с ее экстракции. Эту процедуру мы решили осуществить с использованием детергентного метода разрушения клеток. Одним из приемлемых соединений для экстракции является экологически безопасное ПАВ.
