Введение к работе
Актуальность проблемы
РНК-полимераза (РНКП) - высоко консервативный фермент, осуществляющий процесс транскрипции в клетках всех организмов. У бактерий транскрипция всех генов осуществляется единственной РНКП, которая является одной из основных моделей для изучения фундаментальных механизмов транскрипции, а также может служить перспективной мишенью для действия антибиотиков. Процесс транскрипции разделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию, которые сопровождаются сложными структурными перестройками РНКП. Инициация транскрипции осуществляется холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента и о-субъединицы, ответственной за узнавание промоторных элементов. Дальнейшие стадии транскрипции - элонгация и терминация - могут осуществляться в отсутствие о-субъединицы кор-ферментом РНКП, состоящим, в свою очередь, из пяти субъединиц - агРР'о). Нуклеиновые кислоты во время транскрипции располагаются в главном канале РНКП, сформированном (3- и (3'-субъединицами. Активный центр фермента, также образованный (3- и [У-субъединицами, содержит два каталитических иона магния. В процессе синтеза РНК нуклеотиды поступают через вторичный канал РНКП, соединяющийся с главным в области активного центра. Вторичный канал является также местом связывания многих регуляторных факторов белковой природы, которые, проникая в него, достигают активного центра фермента и могут напрямую регулировать активность РНКП.
На стадии элонгации РНКП может осуществлять не только синтез, но и эндонуклеолитическое расщепление РНК (далее для краткости «расщепление РНК»). Предполагается, что реакция расщепления РНК играет важную роль в исправлении ошибок транскрипции и в преодолении транскрипционных пауз, возникающих в ходе элонгации (Gordon et al., 2009; Sydow et al., 2009; Пупов и Кульбачинский, 2010). Было показано, что расщеплению РНК предшествует обратное смещение элонгационного комплекса (ЭК), при этом 3'-конец РНК выходит во вторичный канал РНКП. Следует сказать, что, хотя биохимические и структурные исследования последних лет позволили предположить детальный молекулярный механизм синтеза РНК бактериальной РНКП, про механизм расщепления РНК известно гораздо меньше.
В последние годы активно ведутся работы по расшифровке пространственных структур РНКП и транскрипционных комплексов, что вместе с биохимическими данными обеспечивает понимание молекулярных механизмов работы РНКП на разных стадиях транскрипции. К настоящему времени наиболее полная структурная информация получена для РНКП термофильных бактерий рода Thermus (Т. thermophilus и Т. aquaticus) (Vassylyev et al., 2007). РНКП этих бактерий обладают рядом уникальных особенностей, связанных с адаптацией к высоким температурам, и при этом являются неродственными РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli, которая очень хорошо изучена биохимическими методами. С этой точки зрения, большой интерес представляет исследование РНКП мезофильной бактерии Deinococcus radiodurans, которая филогенетически родственна бактериям рода Thermus. Существующие данные показывают, что РНКП Т. aquaticus, Т. thermophilus и D. radiodurans обладают гораздо большей скоростью расщепления РНК (в своих температурных оптимумах), чем РНКП Е. coli, что делает
сравнительное исследование этих РНКП актуальным с точки зрения понимания механизмов реакции расщепления РНК и температурной адаптации катализа.
В связи с консервативностью структуры активного центра РНКП у бактерий и эукариот, исследование механизмов действия различных факторов (белков, низкомолекулярных соединений, некодирующих нуклеиновых кислот и антибиотиков) на работу бактериальной РНКП позволяет понять общие принципы регуляции транскрипции. Важнейшей группой факторов являются регуляторные молекулы, способные непосредственно воздействовать на активный центр РНКП. К таким факторам относятся белки Gre, связывающиеся во вторичном канале РНКП и стимулирующие расщепление РНК (Borukhov et el., 1993). Еще одной группой факторов являются разнообразные белки бактериофагов, изменяющие активность хозяйской РНКП в процессе инфекции. Исследование механизма действия данных белков с привлечением современных данных о структуре РНКП (прежде всего, термофильных бактерий) может дать ценную информацию о различных способах регуляции активности РНКП. С этой точки зрения очень интересной моделью являются регуляторные белки бактериофагов, заражающих бактерии рода Thermus, в частности, открытый недавно белок gp39 бактериофага Р23-45, который взаимодействует с РНКП Т. thermophilus (Berdygulova et al., 2011).
Понимание молекулярного механизма транскрипции и основных принципов регуляции активности РНКП представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важное практическое значение, так как РНКП является перспективной мишенью для создания новых антибиотиков. Изучение факторов, играющих ключевую роль в регуляции активности РНКП, необходимо для разработки новых систем для высокоэффективной экспрессии целевых генов. Исследование взаимодействий регуляторных белков бактериофагов с РНКП может быть также использовано для разработки новых тест-систем для поиска и характеристики различных лигандов РНКП, в том числе, имеющих медицинское значение.
Степень разработанности
В то время как детальный механизм синтеза РНК достаточно хорошо изучен, механизм расщепления РНК остается не до конца ясным; в частности, непонятно, какие районы РНКП принимают участие в данной реакции. Кроме того, в настоящее время нет данных о роли определенных районов РНКП в межвидовых различиях в катализе реакции расщепления. Существуют противоречивые данные об участии одного из ключевых элементов активного центра - G-петли - в реакции расщепления РНК (Yuzenkova et al., 2010, Zhang et al., 2010). Механизм действия факторов, способствующих расщеплению РНК, - Gre-белков у прокариот и фактора TFIIS у эукариот - изучается с конца XX века, однако, многие детали взаимодействия данных белков с РНКП и их физиологическая роль у разных организмов понятны не до конца (Sosunova et al., 2003, Sigurdsson et al., 2010). Кроме того, в последнее время ведется поиск новых ингибиторов бактериальной РНКП, в том числе, на основе фаговых белков. В связи с этим, активно изучаются механизмы взаимодействия РНКП с регуляторами фаговой природы. Однако многообразие таких механизмов делает исследование каждого нового фагового регулятора хозяйской транскрипции уникальным.
Цели и задачи исследования
Цели работы:
-
Выявить районы РНКП D. radiodurans, Т. aquaticus и Е. coli, участвующие в реакции расщепления РНК и определяющие межвидовые различия в данной реакции.
-
Исследовать механизм регуляции транскрипции РНКП Thermus thermophilus белком gp39 бактериофага Р23-45.
Задачи:
-
Исследовать особенности реакции расщепления РНК РНКП D. radiodurans.
-
Методами сайт-направленного мутагенеза и транскрипции in vitro выявить участки активного центра РНКП, определяющие различия в скорости реакции расщепления РНК у РНКП Е. coli и D. radiodurans.
-
Изучить влияние мутаций в активном центре РНКП Т. aquaticus на расщепление РНК в реакциях по транскрипции in vitro и выявить связанные с температурной адаптацией различия в реакции расщепления между РНКП Т. aquaticus и D. radiodurans.
-
Методами транскрипции in vitro исследовать влияние белка gp39 бактериофага Р23-45 на транскрипционные свойства РНКП Т. thermophilus. Найти районы РНКП, ответственные за связывание белка gp39.
Научная новизна
В ходе работы при помощи анализа мозаичных вариантов РНКП, содержащих последовательности от разных бактерий, проведен поиск элементов фермента, участвующих в реакции расщепления РНК и ответственных за межвидовые различия в скоростях расщепления. В результате идентифицирован ключевой элемент активного центра РНКП (G-петля), обусловливающий различия в скоростях расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и Е. coli. Кроме того, при сравнении РНКП термофильных и мезофильных бактерий установлено, что на скорость расщепления РНК способны также влиять дополнительные элементы активного центра, контактирующие с G-петлей и ответственные за температурную адаптацию в реакции расщепления РНК. Изучено влияние Gre-факторов на реакцию расщепления РНК РНКП D. radiodurans и Е. coli. В части работы, посвященной изучению механизмов регуляции транскрипции фаговым белком gp39, детально исследованы транскрипционные свойства РНКП Т. thermophilus в присутствии белка gp39 и охарактеризован предполагаемый участок связывания белка gp39 с РНКП. В ходе выполнения работы также впервые исследованы механизмы действия белка gp39 на активность клеточной РНКП на стадиях инициации и терминации транскрипции.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в работе данные значительно расширяют имеющиеся представления о механизмах катализа в активном центре РНКП и о способах регуляции активности фермента на разных стадиях транскрипции. Результаты работы могут быть использованы для создания модельных систем для структурных исследований транскрипционных комплексов и разработки новых ингибиторов бактериальной РНКП.
Методы исследования
В работе использованы следующие методы исследования: сайт-направленный мутагенез, выделение нативных и рекомбинантных белков, различные варианты методик транскрипции in vitro, методы быстрой ферментативной кинетики, исследование влияния мутаций на выживаемость клеток бактерий in vivo.
Положения, выносимые на защиту
-
G-петля в активном центре РНКП обусловливает межвидовые различия в реакции расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и Е. coli.
-
F-петля определяет различия в реакции расщепления РНК между РНКП D. radiodurans и Т. aquaticus.
-
Скорость расщепления РНК в присутствии GreA-факторов у РНКП D. radiodurans и Е. coli выравнивается.
-
Белок gp39 бактериофага Р23-45 взаимодействует с доменом «заслонка» (3-субъединицы РНКП Т. thermophilus и ингибирует инициацию транскрипции, но при этом стимулирует элонгацию транскрипции и подавляет терминацию.
Степень достоверности и апробация результатов
Все результаты работы являются достоверными, эксперименты сделаны с необходимыми контролями и имеют повторности. Результаты работы были представлены на следующих семинарах, конференциях и симпозиумах: 16 и 17 международных пущинских школах-конференциях молодых ученых (Пущино, 2012, 2013 гг.); International conference of postgenomic technology for biomedicine (Novosibirsk, 2012); The 73rd Harden Conference Machines on genes II - the central dogma at the interface of biology, chemistry and physic (Oxford, UK, 2012); международной конференции FASEB «Mechanisms and regulation of prokaryotic transcription» (Vermont, 2013); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011 г.); «X чтениях памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 - статьи в рецензируемых научных изданиях, 7 - материалы международных и российских конференций и симпозиумов.
Структура и объем работы
Похожие диссертации на Особенности реакции расщепления РНК и регуляции активности у РНК-полимераз Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus и Thermus thermophilus
