Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействия белков лежат в основе выполняемых ими функций. Совокупность всех биологически значимых белковых взаимодействий в рамках целого протеома носит название интерактом. На сегодняшний день все больше внимания уделяется исследованиям как глобальных интерактомов различных организмов, так и интерактомов отдельных белков. Составление карт взаимодействий между биомолекулами (например, белками) позволяет систематизировать и расставить отдельные фрагменты гигантской «интерактомной мозаики» на свои места и прогнозировать возможные пути функционирования и регуляции биологических процессов. Использование подобного подхода имеет ценность не только для фундаментальных биологических исследований, но и важно для разработки новых подходов в медицине. В наши дни для решения этой задачи используют высокопоточные методы анализа взаимодействий биомолекул в клетках и организмах. Однако, именно в силу гигантского объема информации, получаемой с помощью высокопоточных поисковых методов, их применение порождает массу «ошибок» и «пробелов» в составляемых интерактомных схемах. Поэтому интерактомные исследования, осуществляемые небольшими коллективами, обычно посвященные отдельному объекту, часто дают более достоверные результаты о молекулярных взаимодействиях и их роли в функционировании организмов.
Наиболее ярким примером приложения интерактомного подхода являются исследования этиологии онкологических заболеваний. В настоящее время считается, что канцерогенез - это сложный, многоэтапный процесс, одним из движущих факторов которого является взаимодействие опухоли и ее окружения, а также изменение характеристик клеточных интерактомов. Особый интерес в этом плане представляют собой белки, непосредственно вовлеченные в процессы метастазирования и прогрессии опухоли, в частности, семейство лизилоксидаз (LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, LOXL4). Все представители семейства лизилоксидаз характеризуются высокой консервативностью аминокислотной последовательности каталитического домена и проявляют схожую субстратную специфичность. Эти белки секретируются различными типами клеток во внеклеточное пространство, где они участвуют в посттрансляционной модификации коллагена и эластина, формируя тем самым структуру внеклеточного матрикса. В то же время ряд представителей семейства лизилоксидаз (LOX и LOXL2) найдены в ядрах клеток, где они участвуют в регуляции экспрессии генов, например, гена кадгерина Е, репрессия которого приводит к изменению клетками фенотипа с эпителиального на мезенхимальный, характеризующийся большей миграционной активностью. Несмотря на успешность
функциональных исследований, остаются непонятыми молекулярные механизмы этих процессов и конкретная роль лизилоксидаз в них. Поэтому составление интерактомной карты белковых взаимодействий с участием лизилоксидаз позволило бы проанализировать возможные механизмы работы этих белков, а также установить роль внеклеточной и внутриклеточной функциональной активности лизилоксидаз в прогрессии опухолей.
Так как лизилоксидазы непосредственно участвуют в метастатической прогрессии опухолей и являются потенциальной мишенью для терапии онкологических заболеваний, остро встает вопрос о возможности специфического воздействия на ферментативную активность этих ферментов in vivo. Необходимо отметить, что до сих пор не созданы лекарственные препараты, ингибирующие активность этих ферментов, пригодные для применения в медицинской практике. Известные на сегодняшний день ингибиторы лизилоксидаз обладают высокой токсичностью и неспецифичностью действия по отношению к лизилоксидазам и не пригодны для медицинских целей. В то же время полное ингибирование лизилоксидазной активности нежелательно, так как эти белки крайне необходимы для нормального функционирования тканей. Поэтому наиболее перспективным направлением исследований является поиск возможных альтернативных путей регулирования / моделирования активности лизилоксидаз.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием различных поисковых методов (например, «молекулярный фишинг», двугибридный дрожжевой скрининг) определен ряд новых, до этого момента неизвестных белков-партнеров лизилоксидазы человека. Хотя подобные работы уже проводились рядом авторов [Fogelgren et al, 2005; Polgar et al, 2007], до сих пор круг известных белков-партнеров лизилоксидаз очень узок и ограничен, в основном, данными о внеклеточных интеракторах этого белка. Данное исследование не только выявило ряд новых потенциальных внутриядерных интеракторов лизилоксидазы человека, но и позволило выдвинуть гипотезу, объясняющую механизм регуляции лизилоксидаза-зависимой репрессии гена кадгерина Е. По результатам работы также была составлена карта фрагмента глобального интерактома с участием лизилоксидаз.
В данной работе был осуществлен не только поиск новых интеракторов лизилоксидазы, позволяющий предположить новые пути регуляции ее функциональной активности в организме, но также предложен уникальный метод модуляции каталитической активности лизилоксидазы, основанный на применении изотопного эффекта. Этот метод может быть использован как новый инструмент для исследований функциональной активности лизилоксидаз.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования являлся поиск новых путей регуляции функциональной активности лизилоксидазы человека с помощью различных подходов и методов. В связи с этим предполагалось решить следующие задачи:
-
Получить продуценты рекомбинантной лизилоксидазы на основе различных систем экспрессии белков и, по возможности, выделить каталитически активную лизилоксидазу.
-
Охарактеризовать локализацию каталитического домена лизилоксидазы в различных тканях, а также в культурах различных клеточных линий, в том числе в первичной культуре.
-
С помощью дрожжевой двугибридной системы произвести поиск белок-белковых взаимодействий каталитического домена лизилоксидазы в организме человека.
-
Подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, колокализации в клетке и других.
-
Произвести поиск новых интеракторов лизилоксидазы методом «молекулярного фишинга» с последующей идентификацией белков при помощи масс-спектрометрии. Подтвердить детектированные взаимодействия независимыми методами.
-
Измерить изотопный эффект сайт-специфичного дейтерирования нативных субстратов лизилоксидазы и протестировать возможность регуляции лизилоксидазной активности при помощи данного подхода.
-
Исследовать особенности внутриклеточной локализации предполагаемого онкосупрессора ТТС4.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международных конференциях "Cancer Proteomics, 2009" (Дублин, Ирландия), "The 25th Anniversary Symposium of the Protein Society" (Бостон, США, 2011) и "15th Amine Oxidase Congress, AOC 2012" (Тулуза, Франция), а также на "Х-ых чтениях, посвященных памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", (Москва-Пущино, Россия, 2011), «Белки и пептиды» (Казань, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ - 2 статьи в реферируемых научных журналах и 7 в сборниках тезисов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав основной части (литературный обзор, результаты и обсуждение, экспериментальная часть), выводов, приложения и списка литературы, включающего 265 источников. Работа содержит 43 рисунка и 5 таблиц.
