Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Роль впч в этиологии рака шейки матки 12
1.2 Профилактика рака шейки матки 14
1.2.1 Вакцинация 14
1.2.2 Скрининг женщин на рак шейки матки 15
1.2.2.1 Классификация цервикальных цитологических поражений 16
1.2.2.2 Скрининговые технологии 19
1.3 Биология вируса папилломы человека 26
1.3.1 Классификация вируса папилломы человека 26
1.3.2 Жизненный цикл вируса папилломы человека 28
1.3.3 Организация генома вируса папилломы человека 29
1.3.4 Роль ранних белков вируса папилломы человека в онкогенной трансформации эпителиальных клеток 31
1.3.5 Молекулярные основы типоспецифических различий в трансформирующей активности вируса папилломы человека 33
1.3.6 Значение интеграции ДНК вируса папилломы человека в геном хозяина для онкогенной трансформации клеток 35
1.4. Факторы риска цервикальнои неопластической прогрессии, ассоциированные с вирусом папилломы человека 37
1.4.1 Инфицирование онкогенными типами и молекулярными вариантами вируса папилломы человека 37
1.4.2 Множественная папилломавирусная инфекция 40
1.4.3 Высокая вирусная нагрузка 40
1.4.4 Персистенция папилломавирусной инфекции 41
1.4.5 Нерегулируемая экспрессия вирусных онкогенов 42
Глава 2. Материалы и методы исследования... 47
2.1 Схема исследования 47
2.2 Клинический материал 48
23 Цитологические исследования! 48
2.4 Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала 49
2.5 Полимеразная цепная реакция с типоспецифическими праймерами. 50
2.6 Приготовление компетентных клеток... 51
2.7 Вьщеление плазмидной днк; 53
2.8 . Полимеразная цепная реакция в реальном времени. 54
2.9 Статистическая обработка данных 54
Результаты;собственных исследований. :. ,. ...56
Главa 3: Определение вирусной нагрузки и физического статусавируса папилломы человека. 56
З.г Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени 56
3.2 Методика определения физического статуса днк вирусов папилломычеловека 16 и 18 типов 61
Глава 4 Молекулярные маркеры вируса папилломы человекав ранней диагностике цервиьсальных шоплазий ... 66
4.1 Частота встречаемости онкогенных типов вируса папилломы человека при патологии шейки матки. . -.. ..66
4.2 Оценка вирусной нагрузки у женщин с патологией шейки матки:... ... ...69
4.3 Физический статус днк вируса папилломы человека при различных стадиях заболевания шейки матки ... ...72
4.4 Типоспецифическая персистенция впч 79
Глава 5. Обсуждение результатов 88
Выводы 102
Практические рекомендации 103
Список работ, опубликованных по теме диссертации. 104
Список литературы
- Классификация цервикальных цитологических поражений
- Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала
- Методика определения физического статуса днк вирусов папилломычеловека 16 и 18 типов
- Физический статус днк вируса папилломы человека при различных стадиях заболевания шейки матки
Введение к работе
Одним из важнейших достижений в области изучения рака является установление этиологической роли некоторых типов вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки (РШМ) [1]. В настоящее время охарактеризовано более 80 типов ВПЧ и показано, что около 40 типов могут вызывать заболевания аногенитального тракта [2]. На основании данных эпидемиологических и молекулярно-биологических исследований типы ВПЧ, инфицирующие слизистые оболочки аногенитального тракта, разделяют на группы низкого и высокого онкогенного риска [3]. Самыми распространенными типами ВПЧ высокого онкогенного риска являются 16 и 18 типы — их обнаруживают в 60-80% всех случаев РШМ [4].
Раку шейки матки предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии, которые по степени тяжести принято разделять на легкую, умеренную и тяжелую дисплазии. В большинстве случаев легкой и умеренной дисплазии происходит их спонтанная регрессия, и только в 10-20% случаев заболевание прогрессирует до РШМ [5]. Установление центральной роли онкогенных типов ВПЧ в этиологии РШМ привело к появлению новых стратегий профилактики этого заболевания. К ним относятся разработка вакцин против онкогенных типов вируса и включение теста на ВПЧ в скрининг РШМ. Многочисленные исследования продемонстрировали, что тест на ВПЧ обладает гораздо более высокой чувствительностью для выявления цервикальных интраэпительных неоплазии, чем традиционное цитологическое исследование [6]. Однако тест на ВПЧ имеет достаточно низкие показатели специфичности и прогностической значимости положительных результатов, так как у большинства женщин, особенно молодых, папилломавирусная инфекция (ПВИ) носит транзиторный характер.
По мнению экспертов, на сегодняшний день самым надежным прогностическим индикатором прогрессии заболевания является
7 выявление у женщины персистирующей ПВИ. Показано, что риск персистенции и последующей прогрессии выше в случаях ПВИ с более высокой вирусной нагрузкой ВПЧ [7]. Однако использование в клинической практике высокой вирусной нагрузки как фактора неопластической прогрессии в настоящее время остается проблематичным по ряду причин. Во-первых, зависимость степени дисплазии от вирусной нагрузки в достаточной мере описана только для ВПЧ 16 типа, а во-вторых, по причине отсутствия стандартизованной методологии определения количества вирусной ДНК нельзя установить пороговое значение, выше которого она может считаться клинически значимой.
Ключевым событием в злокачественной трансформации эпителиальных клеток считается интеграция вирусной ДНК в ДНК клетки-хозяина. Процесс интеграции сопровождается разрушением открытых рамок считывания генов вируса Е1 и Е2, продукты которых участвуют в регуляции экспрессии онкогенных белков вируса Е6 и Е7 [8]. Считается, что следствием интеграции, вирусной ДНК в ДНК хозяина является значительное повышение экспрессии белков Е6 и Е7, которые выводят из строя два ключевых белка (р53 и pRb), регулирующих клеточный цикл.
Несмотря на то, что явление интеграции вирусной ДНК в геном хозяина активно изучается, имеющиеся данные не позволяют однозначно оценить его клиническое значение. Как правило, на ранних стадиях опухолевого процесса вирусная ДНК выявляется в эписомной форме, тогда как на поздних — в интегрированной [9]. Недавно был предложен высокочувствительный метод определения физического статуса ВПЧ 16 типа с применением ГЩР в реальном времени, с помощью которого интегрированная форма вируса была обнаружена на самых ранних стадиях заболевания, когда еще не было цитологических доказательств неопластических изменений [10].
Многие авторы оценивают определение вирусной нагрузки и интегрированной формы вирусной ДНК ВПЧ как молекулярные маркеры
8 трансформирующей активности ВПЧ, однако, возможность их использования в клинической практике еще предстоит оценить.
Целью данного исследования является изучение вирусной нагрузки, персистенции ВПЧ и интеграции вирусной ДНК в геном клетки хозяина как индикаторов прогрессии цервикальных поражений.
Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:
Разработать методику определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов на основе метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени
Разработать методику определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов на основе метода ПЦР в реальном времени
Исследовать на- наличие ДНК ВПЧ типов высокого онкогенного риска, пробы, взятые от пациенток с патологией шейки матки, и оценить распространенность онкогенных типов вируса в данной популяции, а также изучить ассоциацию выявления нескольких типов ВПЧ со степенью неоплазии
Определить вирусную нагрузку в пробах, содержащих ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, и изучить ассоциацию вирусной нагрузки со степенью дисплазии эпителия цервикального канала
Определить статус вирусной ДНК в пробах, содержащих ВПЧ 16 и 18 типов, и исследовать связь между интеграцией вирусной ДНК в ДНК человека и степенью неопластических изменений
Оценить персистенцию ВПЧ в эпителии цервикального канала как фактор неопластической прогрессии.
Научная новизна работы
- Разработана методология определения вирусной нагрузки ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, позволяющая определять концентрацию ДНК вируса, нормированную на количество клеток в клинической пробе.
Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 типов на основе метода количественной ПЦР в реальном времени.
Показано, что при одновременном выявлении нескольких типов ВПЧ 16 тип существенно доминирует над остальными типами.
Выявлено, что высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа ассоциирована с повышенным риском развития неоплазии.
Установлена ассоциация степени интеграции ДНК вируса в ДНК человека со степенью неопластических изменений при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа.
Показано, что персистенция ВПЧ, определяемая как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев, может применяться в качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ
Научно-практическая значимость работы
Разработана методология определения концентрации ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов, нормированная на количество клеток в клинической пробе, которая может быть использована для дальнейшего изучения связи вирусной нагрузки с прогрессией цервикальных неопластических изменений.
Показано, что основными типами вируса папилломы человека, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы, что позволяет определить группу повышенного риска развития неопластических изменений.
Показано, что определение вирусной нагрузки при инфицировании ВПЧ 16 типа может использоваться для оценки риска развития дисплазии.
Разработана методология определения физического статуса ВПЧ 16 и 18 и показано, что степень интеграции вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина может быть использована в качестве одного из
10 маркеров развития цервикальных интраэпителиальных неоплазий при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типа.
- В качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ, предложено использовать персистенцию ВПЧ, определяемую как выявление одного и того же типа вируса при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
В популяции женщин с патологией шейки матки 16 тип ВПЧ существенно доминирует над остальными типами, а основными типами, обнаруживаемыми при раке шейки матки, являются 16, 18, 31, 33 и 45 типы.
Высокая вирусная нагрузка ВПЧ 16 типа может использоваться ' в качестве прогностического маркера, хотя низкая нагрузка не исключает прогрессию заболевания. Для остальных типов зависимости тяжести поражений от вирусной нагрузки не установлено.
Определение физического статуса вирусной ДНК может использоваться как один из критериев прогноза прогрессии заболевания.
Персистенция ВПЧ, определяемая как выявление одного и того же типа ВПЧ при повторных исследованиях с интервалом 6 месяцев, может применяться в качестве подхода, увеличивающего специфичность теста на ВПЧ в скрининге РШМ.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК России для публикации.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004), Международной конференции, посвященной 80-летию лаборатории микробиологии ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН «Репродуктивно значимые инфекции: Европейские
стандарты диагностики, терапии и профилактики» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее» (Москва, 2008).
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 15 рисунками; библиографический указатель включает 169 публикаций.
Работа поддержана грантом Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности № 50/06 от 26 мая 2006 года.
Классификация цервикальных цитологических поражений
Доказательство того, что рак шейки матки является последствием ВИЧ инфекции, поставило его в ряд заболеваний, потенциально предотвратимых с помощью вакцинации. Это потребовало создания профилактических вакцин против типов папилломавируса, которые наиболее часто ассоциируются с развитием новообразования, в первую очередь, против. 16 и 18 типов, доминирующих во всех регионах мира. Для создания таких вакцин использовались наиболее иммуногенные вирусные белки, полученные генно-инженерным способом, превращающиеся на основе самосборки в вирусоподобные частицы, не содержащие ДНК, т.е. не способные вызвать инфекционный процесс [23-25].
Несмотря на то, что в ходе клинических исследований вакцин были получены оптимистичные результаты, необходимы дальнейшие исследования: 1. для получения дополнительных доказательств снижения заболеваемости дисплазией, поскольку опубликованных данных недостаточно [26]; 2. для изучения возможности создания коллективного иммунитета в отношении онкогенных типов ВПЧ, а также решения вопроса о целесообразности вакцинации мужчин (пока исследования показывают, что это экономически не оправдано) [27]; 3. для изучения степени замещения вакцинных типов вируса другими высокоонкогенными типами; 4. для более надежного подтверждения формирования протективной защиты в отношении других онкогенных типов ВПЧ, и решения вопроса о целесообразности разработки мультивалентньгх вакцин против других онкогенных типов ВПЧ; 5. для изучения экономической эффективности программ массовой иммунизации против ВПЧ; 6. для определения наиболее приемлемого возраста для вакцинации подростков в России [28] (возможно, таким возрастом является 10-14 лет, когда отсутствует существенная «прививочная нагрузка», имеется минимальный риск предшествующего инфицирования ВПЧ и максимально высока иммуногенность вакцины).
Полученные и накапливаемые в настоящее время данные позволяют рассматривать вакцинацию как вполне реальный путь борьбы с раком шейки матки. Именно поэтому профилактическая массовая вакцинация против ВПЧ высокого риска дает обоснованную надежду и может быть эффективной в борьбе с раком шейки матки в глобальном масштабе. Между тем, профилактическая вакцинация может не повлиять на заболеваемость цервикальным раком в поколении женщин, уже инфицированных ВПЧ и имеющих цитологические изменения, для которых единственным профилактическим мероприятием остается скрининг.
Цитологическое исследование клинических материалов, полученных из эндо- и экзоцервикса (мазков по Папаниколау — Pap smear / Рар-тест), является основой программ, направленных на раннее выявление предрака и рака шейки матки в развитых странах в течение нескольких десятилетий [29, 30]. Эффективность цитологического скрининга не изучалась в рандомизированных контролируемых исследованиях, однако в когортных исследованиях на больших популяциях было показано, что цитологическое исследование каждые 3-5 лет позволяет диагностировать заболеваемость на ранних стадиях, что снижает смертность от рака шейки матки [19]. Снижение смертности на 20-60% достигнуто проведением скрининговых программ в Европе и Северной Америке [31-33]. При этом попытки внедрения цервикального скрининга в развивающихся странах не привели к ожидаемому снижению частоты рака шейки матки ввиду недостаточного контроля над качеством мазков, неэффективностью системы транспортировки их в лаборатории, некачественным выполнением микроскопического исследования и т.п. [34, 35].
С целью повышения эффективности цервикального скрининга для интерпретации данных цитологического исследования в большинстве стран мира внедрена Терминологическая система Бетесда {Terminology Bethesda System, ТБС), наиболее соответствующая биологии цервикального канцерогенеза и рекомендованная Всемирной Организацией Здравоохранения [30, 36]. ТБС создана для более эффективной передачи информации от лабораторий клиницистам и обеспечения стандартизации лечения выявленных нарушений, а также последующего наблюдения за пациентами [37]. Последний пересмотр Терминологической системы Бетесда состоялся в 2001 году. Основные терминологические характеристики представлены в таблице 1.
Терминологическая система Бетесда предполагает разделение всех плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SIL) на две группы:
Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени (LSIL) являются морфологическим отражением продуктивной вирусной инфекции и включают в себя койлоцитоз и другие цитологические признаки инфекции, связанной с ВПЧ, а также легкую дисплазию (то есть CIN1). Точная цитологическая дифференцировка ВПЧ-эффекта и CIN 1 затруднена.
Плоскоклеточные интраэпителиальные поражения высокой степени (HSIL) часто связаны с вирусной персистенцией, высоким риском прогрессии и включают в себя умеренную, тяжелую дисплазию и CIS (т.е. CJN2HCIN3).
При выявлении признаков атипии железистых клеток ТБС предполагает отнесение образца к одной из четырех групп:
«Атипичные железистые клетки» (AGC) с указанием их происхождения (эндоцервикальные, эндометриальные ) или точно не определенные. В большинстве случаев, возможно провести дифференцировку между атипичными эндометриальными и эндоцервикальными клетками. Обнаружение AGC клинически важно, так как за ними часто скрываются заболевания высокой степени тяжести. «Атипичные эндоцервикальные клетки, похожие на неопластичные» — в случае если отсутствуют другие признаки, свидетельствующие о наличии аденокарциномы in-situ. Эндоцервикальная аденокарцинома in situ (AIS). Часть случаев, интерпретированных цитологом как AIS, может демонстрировать инвазию при гистологической оценке, поскольку имеется значительное морфологическое сходство между AIS и хорошо дифференцированной инвазивной эндоцервикальной аденокарциномой;
Выделение нуклеиновых кислот из клинического материала
Цитологические исследования соскобов эпителия цервикального канала проводились в лабораториях патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии (зав. лаб. профессор Кветной И.М.) и НИИ онкологии (зав/ лаб. профессор Мацко Д.Е.). Препарат окрашивали по Папаниколау согласно стандартной методике. Предварительно фиксированный в 96% этаноле цитологический микропрепарат насыщали водой, помещая поочередно в растворы спирта убывающей крепости (80%, 70% и 50%) и дистиллированную воду на 30 секунд. Затем препарат окрашивали квасцовым гематоксилином в течение 10 минут с последующей промывкой водой до появления синей окраски. После обезвоживания препарата в растворах спирта возрастающей крепости (50%, 70%, 80% по 30 секунд), препарат окрашивали красителем оранжевым G в течение 4 минут. Затем препарат промывали в 95% спирте трижды, после чего окрашивали красителем ЕА 50 в течение 4 минут с последующей троекратной промывкой 95% спиртом. На заключительном этапе препарат обезвоживали в 100% спирте, спирт-ксилоле (1:1), ксилоле. Затем препарат заключали в синтетический бальзам с покровным стеклом. Исследование цитологических микропрепаратов проводили в иммерсионной системе при 100-кратном увеличении. Для представления результатов цитологического исследования была использована терминологическая система Бетесда [30, 36], которая предполагает деление всех плоскоклеточных интраэпителиальных поражений (SDL - Squamous Intraepithelial Lesion) на две группы: SIL низкой степени (LSDL - low SIL) и SIL высокой степени (HSIL-highSIL).
Выделение нуклеиновых кислот из клинических проб проводили с применением тест-системы NucliSens Isolation Reagents (BioMerieux, Netherlands), основанной на методе R. Boom и соавт. [140], в соответствии с инструкцией производителя. Образцы встряхивали на вортексе, затем 100 мкл каждого образца смешивали с 900 мкл лизирующего буфера. Смесь еще раз встряхивали и центрифугировали несколько секунд, после чего добавляли 50 мкл диоксида кремния и инкубировали еще 10 мин, встряхивая каждые 2 мин. Осадок промывали один раз в 1 мл промывочного буфера, дважды в 1 мл 70% этанола и, последний раз, в 1 мл ацетона. После подсушивания при 56С в течение 10 минут нуклеиновые кислоты элюировали в 50 мкл элюирующего буфера при 56С в течение 5 минут.
Для выявления и дифференциации ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59, 66) в соскобах эпителия цервикального канала использовали тест-системы «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Тест-система является коммерческой, поэтому последовательность типоспецифических праймеров не приводится. Метод основан на одновременной амплификации в одной пробирке участков ДНК четырех типов ВПЧ и участка р-глобинового гена, используемого в качестве внутреннего контроля. ПНР-анализ на наличие двенадцати типов ВПЧ проводится в трех пробирках. Каждая реакционная смесь содержит одну пару праймеров к р-глобиновому гену человека и четыре пары праймеров к четырем типам ВПЧ. ПЦР-смесь «16-35» содержит типоспецифические праймеры к ДНК ВПЧ 16, 31, 33 и 35 типов, ПЦР-смесь «18-59» - к ДНК ВПЧ 18, 39, 45 и 59 типов, ПЦР-смесь «52-66» - к ДНК ВПЧ 52, 56, 58 и 66 типов. Все амплифицируемые фрагменты имеют разную длину, что позволяет определять генотип обнаруженного ВПЧ высокого оцкогенного риска. Р-глобиновый ген является участком генома человека и должен всегда присутствовать в пробе в достаточном количестве, эквивалентном количеству клеток в мазке (103 — 105 геномов). В случаях, есди материал взят неправильно, полоса амплификации р-глобинового гена будет отсутствовать на фореграмме.
Реакцию проводили в программируемом термостате Терцик (ДНК-технология, Москва) при следующем температурном режиме: 95С — 15 мин; 95С - 30 с, 63С - 30 с, 72С - 40 с (42 цикла); 72С - 1 мин. Разделение и идентификацию продуктов реакции осуществляли в 3% агарозном геле, приготовленном на трис-боратном буфере, который окрашивали бромистым этидием; в ультрафиолетовом свете наблюдали амплифицированные специфические фрагменты, длины которых представлены в таблице 3.
Методика определения физического статуса днк вирусов папилломычеловека 16 и 18 типов
Клинический материал (соскобы эпителия цервикального канала) был получен от 538 пациенток с патологией шейки матки: эрозией шейки матки, эктопией шейки матки, диспластическими изменениями эпителия шейки матки и РШМ. ВПЧ высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59 и 66 типов) был выявлен в 435 пробах, что составило 80 %. Электрофореграмма продуктов амплификации с типоспецифическими праймерами представлена на рисунке 7.
В анализ было включено 412 проб, полученных от пациенток с патологией шейки матки (эктопией, лейкоплакией, диспластическими изменениями эпителия шейки матки и РШМ), в которых была обнаружена ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58 и 59 типов.
ВПЧ 16 типа был обнаружен у 236 пациенток (57%). Остальные типы распределились по распространенности следующим образом: 31 (24%), 33 (24%), 56 (18%), 52 (14%), 45 (12%), 18 (10%), 58 (7%), 39 (5%), 35 (4%), 59 (3%) (рис.8).
Результаты определения типов ВПЧ высокого онкогенного риска у пациенток с различной степенью тяжести цервикальных поражений представлены в таблице 6. Для анализа ассоциации частоты встречаемости с тяжестью цервикальных интраэпителиальных неоплазии использовали критерий %2 со степенью свободы к=3. Частота встречаемости 16 типа ВПЧ была ассоциирована со стадией заболевания (р 0,001): при цитологической норме она составила 40% (63 случая из 157), при LSIL 62% (33 случая из 53), при HSIL - 70% (77 случаев из ПО), при плоскоклеточной карциноме — 68% (63 случая из 92). Частота встречаемости ВПЧ 33 типа также значимо возрастала с ростом тяжести заболевания (р=0,0183). Частота встречаемости ВПЧ 39 типа, наоборот, значимо убывала с ростом тяжести заболевания (р=0,0291). Для остальных типов ВПЧ не было отмечено значимого изменения частоты встречаемости.
Таким образом, частота выявления 16 и 33 типов ВПЧ существенно увеличивается с увеличением степени дисплазии эпителия шейки матки, при этом частота выявления 39 типа существенно уменьшается. У 50% пациенток (207 из 412) было обнаружено два и более типа ВПЧ (рис.9). Инфицирование несколькими типами ВПЧ не было ассоциировано с тяжестью цервикальных поражений (%2=2, к=3, р=0,57): если в группе пациенток без атипии частота одновременного выявления нескольких типов вирусов составила 43% (67 из 157), то в группах пациенток с LSIL, HSIL и раком она равнялась 53% (28 из 53), 56% (62 из 110) и 54% (50 из 92), соответственно.
Оценка вирусной нагрузки у женщин с патологией шейки матки показала, что ВПЧ 16 типа присутствует в цервикальных образцах в большем количестве, чем другие типы (рис. 10). Доля цервикальных образцов содержащих менее 10 копий ДНК на 10 клеток для 16 типа составила 2%, доля образцов содержащих 102-104 копий ДНК на 105 клеток 16%, 104-106 - 36%, более 106 - 46%. На рисунке 10 представлены показатели вирусной нагрузки для ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 типов. Очевидно, что распределение числа копий ДНК ВПЧ имеет ассиметричный вид, поэтому для описания данных вирусной нагрузки использовалось понятие медианы.
Для оценки значения определения количества вируса мы определяли вирусную нагрузку для каждого типа ВПЧ в группах женщин с разной степенью патологии шейки матки.
Медиана числа копий ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 и 56 представлена в таблице 7. Для анализа зависимости медианы количества ДНК ВПЧ от тяжести заболевания использовали критерий Джонкхиера J с уровнем значимости р и степенью свободы к. Медиана количества копий ДНК ВПЧ 16 типа возрастала с увеличением степени дисплазии (J=6, р=0,0204, к=4,4): если в случаях цитологической нормы она составляла 1,1x105 копий вирусной ДНК, то у пациентов с LSIL — 2,8x10 , а у пациенток с HSIL и раком — 1,2x106 и 4,7x106, соответственно. Для остальных типов зависимости тяжести поражений от вирусной нагрузки не установлено.
Физический статус днк вируса папилломы человека при различных стадиях заболевания шейки матки
Уже в ранних работах по изучению статуса генома ВПЧ было показано, что интеграция ВПЧ в клеточный геном может происходить на ранних стадиях заболевания, и эписомная и интегрированная формы вируса могут выявляться одновременно [165, 166]. Согласно нашим данным, в 26 из 63 проб, полученных от женщин без атипии, и в 20 из 33 проб, полученных от женщин с легкой дисплазией, часть ВПЧ 16 типа находилась в эписомной форме, часть — в интегрированной. Для ВПЧ 18 типа: при цитологической норме в трех из 15 проб и при CIN 1 - в 4 из 7 ДНК определялась как в эписомной, так и в интегрированной форме.
Существует мнение, что характер интеграции ВПЧ 16 типа отличается от характера интеграции ВПЧ других онкогенных типов. Так, для ВПЧ 18, 31, 33, 35, 52 и 58 типов показано, что в случаях дисплазии и РШМ вирусный геном почти всегда интегрирован в геном хозяина, тогда как геном ВПЧ 16 типа может существовать в эписомной форме даже при карциноме [167, 168]. Pirami L. с соавт. обнаружили только эписомную форму ВПЧ 16 типа в 6 из 23 (26%) случаях карциномы, тогда как во всех 8 случаях обнаружения ВПЧ 18, 31 или 35 типов в тканях карциномы вирусная ДНК находилась исключительно в интегрированной форме. Авторы предположили, что для ВПЧ 16 типа интеграция в клеточный геном и последующая инактивация регулятора транскрипции Е2 не является обязательным событием для развития опухоли [167]. К такому же выводу пришли Hudelist G. с соавт., которые исследовали физический статус нескольких онкогенных типов ВПЧ в нормальных и диспластически измененных клетках эпителия цервикального канала [168]. Они показали, что различные уровни интеграции вирусной ДНК коррелировали со степенью заболевания. В неизмененных эпителиальных клетках и в случаях легкой и умеренной дисплазии ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 52Ь и 58 типов была выявлена только в эписомной форме. В случаях карциномы in situ вирусная ДНК была полностью интегрирована в клеточный геном в 16 из 17 случаев (94%) инфицирования ВПЧ 18 типа, в 4 из 5 случаев (80%) инфицирования ВПЧ 31, 33, 52Ь и 58 типов и только в 15 из 30 случаев (50%) инфицирования ВПЧ 16 типа.
В свете полученных нами данных большой интерес вызывают результаты работы, авторы которой изучали связь между физическим статусом вируса папилломы 16 и 18 типов и клиническими параметрами в 86 случаях дисплазии высокой степени и карцином [169]. В 40 случаях был обнаружен ВПЧ 16 типа (46,6%), в 7 - 18 типа (8,1%), и в 39 случаях были обнаружены оба типа ВПЧ (45,3%). ДНК ВПЧ 16 типа была выявлена как в интегрированной (35,4%), так и в эписомной (36,7%) формах; в 27,8% случаев были обнаружены обе формы ДНК. В противоположность этому, во всех 46 случаях выявления ВПЧ 18 типа ДНК вируса присутствовала исключительно в интегрированной форме. Интеграция ВПЧ 16 типа была ассоциирована со стадией заболевания. Особенно интересным представляется наблюдение авторов, что ДНК вируса 16 типа чаще обнаруживалась в эписомной форме в случаях, когда имела место инфекция обоими типами вируса, чем в случаях, когда присутствовала ДНК только 16 типа. Авторы работы заключили, что определение типа вируса в сочетании с оценкой его физического статуса могут обеспечить лучшую диагностическую и прогностическую оценку заболевания. Полная интеграция ВПЧ 18 типа в клеточный геном, по мнению авторов [169], может свидетельствовать о возможных различиях в поведении разных типов вируса при онкогенной трансформации и особой «агрессивности» некоторых типов ВПЧ. Авторы предположили существование своего рода конкуренции за клеточные сайты интеграции: в случаях инфицирования несколькими типами вируса в геном хозяина встраивается тип вируса, изначально представленный в большем количестве.
В нашем исследовании степень интеграции ВПЧ 16 и ВПЧ 18 типа была ассоциирована со стадией заболевания. Однако ДНК ВПЧ 16 типа содержалась в эписомной форме в 22 из 77 случаев дисплазии высокой степени (CIN 2-3) ив 17 из 63 случаев плоскоклеточной карциномы. В случае инфицирования только ВПЧ 16 типом в 4 из 35 случаев дисплазии высокой степени и в двух из 26 случаев РШМ ДНК была обнаружена в эписомной форме. Интересно отметить, что ни в одном случае цитологической нормы и только в одном случае легкой дисплазии ДНК ВПЧ 16 типа была обнаружена в интегрированной форме. В этом случае наблюдалась прогрессия заболевания до CIN 2 в течение года.
В случаях инфицирования только ВПЧ 18 типа при цитологической норме в двух из 4 случаев ДНК была выявлена в эписомной форме, в смешанной - в одном, в интегрированной — в одном. При этом случаях эписомной и смешанной наблюдалась транзиторная ПВИ, а в случае интегрированной формы, наоборот наблюдалась персистенция ВПЧ 18 типа. При легкой степени дисплазии ВПЧ 18 типа была обнаружена в эписомной форме, а при тяжелой дисплазии и РШМ - в интегрированной.
Противоречивость данных, полученных при анализе статуса ДНК ВПЧ в случаях дисплазии и РШМ, может зависеть от разных факторов, таких как гетерогенность клеточной популяции в опухоли, гетерогенность самих вирусов папилломы высокого риска, анализ различных контингентов пациентов. Подавляющее большинство работ, посвященных изучению статуса вирусной ДНК в опухолевых клетках, выполнены с использованием Саузерн-блот-гибридизации, ПНР и двумерного электрофореза, и в случае значительного преобладания одной формы другая форма может быть пропущена. Метод ПЦР в реальном времени позволяет с высокой точностью определить как вирусную нагрузку, так и физический статус вирусной ДНК — два параметра, которые наряду с типом ВПЧ рассматриваются в настоящее время в качестве критериев, позволяющих прогнозировать течение ВПЧ инфекции и ассоциированных с нею злокачественных изменений.
