Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Биологические и генетические механизмы жизненного цикла вирусов как основа для выбора перспективных направлений антивирусной химиотерапии 11
1.1.1. Молекулярно-генетическая организация вирусов и реализация вирусной генетической информации. Ингибиторы вирусных ферментов 11
1.1.2. Механизмы взаимодействия вируса и клетки-хозяина и ингибиторы ключевых этапов вирусной инфекции 20
1.2. Характеристические особенности фуллеренов и перспективность их применения в биологии и медицине 32
1.2.1. Строение фуллеренов 32
1.2.2. Химические свойства фуллеренов 35
1.2.3. Воздействие фуллеренов на биологические объекты 45
1.2.3.1. Биохимическая активность фуллеренов 45
1.2.3.2. Антивирусная активность фуллеренов 49
1.2.3.3. Действие фуллеренов на клетки и их цитотоксические свойства 53
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Синтез водорастворимых производных фуллеренов 58
2.2. Клеточные культуры и вирусы 60
2.3. Определение влияния производных фуллеренов на культуры соматических клеток 62
2.3.1. Цитотоксический эффект 62
2.3.2. Исключение трипанового синего 62
2.3.2.1. Приготовление раствора трипанового синего 62
2.3.3. Гемолитический тест 63
2.3.4. Анализ роста бактерий в периодической культуре 64
2.4. Исследование вирулицидного действия производных фуллеренов . 65
2.4.1. Действие на внеклеточный вирус гриппа 65
2.4.2. Действие на внеклеточный вирус полиомиелита 67
2.4.3. Фагоцидное действие 68
2.5. Изучение влияния производных фуллеренов на процесс репродукции вирусов 69
2.5.1. Исследование репродукции вируса гриппа 69
2.5.1.1. Метод ИФА 70
2.5.1.1.1. Приготовление желатины 72
2.5.2. Изучение адсорбции вирусов полиомиелита на клетках НЕр 2 . 72
2.5.3. Изучение влияния производных фуллеренов на адсорбированный вирус полиомиелита 73
2.6. Изучение адсорбции бактериофага /52 на чувствительной культуре 74
2.6.1. Подготовка бактериальной культуры 75
2.7. Изучение длительности латентного периода бактериофага /52 в культуре Escherichia coli С 75
2.8. Электронная микроскопия 77
2.8.1. Подготовка материала для электронной микроскопии 77
2.8.1.1. Приготовление смолы 78
2.9. ИК спектроскопия 78
2.10. Статистическая обработка результатов 78
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 80
3.1. Характеристика производных фуллеренов 80
3.2. Исследование токсичности производных фуллеренов в отношении клеточных линий MDCK, НЕр2 и эритроцитов крови человека . 83
3.2.1. Гемотоксичность производных фуллеренов 83
3.2.2. Цитотоксичность производных фуллеренов в отношении клеток MDCK 87
3.2.3. Действие производных фуллеренов на культуру клеток НЕр2 92
3.2.4. Биологическая активность производных фуллеренов в отношении культуры бактериальных клеток Escherichia coli С 97
3.3. Исследование биологического действия водорастворимых производных фуллеренов на вирусы человека на модели вирус гриппа А/Виктория/3 5/72 (НЗЫ2)-клетки MDCK 107
3.3.1. Влияние водорастворимых производных фуллеренов на внеклеточный вирус гриппа А/Виктория/3 5/72 (H3N2) 107
3.3.2. Воздействие производных фуллеренов на процесс репродукции вируса гриппа А/Викгория/35/72 (H3N2) в культуре клеток MDCK 116
3.4. Исследование влияния производных фуллеренов на вирусы человека на модели вирус полиомиелита-клетки НЕр2 120
3.4.1. Эффект производных фуллеренов на внеклеточный вирус полиомиелита Р712, ch2ab (II) 120
3.4.2. Влияние производных фуллеренов на инфекционный процесс в системе полиовирус -клетки НЕр2 122
3.5. Влияние производных фуллеренов на биологическую систему бактериофаг (52 - Escherichia coli С 128
3.5.1. Действие производных фуллеренов на внеклеточный бактериофаг (52 128
3.5.2. Влияние производных фуллеренов на процесс адсорбции бактериофага (52 на клетках Escherichia coli С 129
3.5.3. Изменение длительности латентного периода и урожая бактериофага (52 в клетках Escherichia coli С в присутствии производных фуллеренов 135
Заключение 140
Выводы 153
Список цитируемой литературы 155
Приложения 172
- Молекулярно-генетическая организация вирусов и реализация вирусной генетической информации. Ингибиторы вирусных ферментов
- Действие фуллеренов на клетки и их цитотоксические свойства
- Изучение длительности латентного периода бактериофага /52 в культуре Escherichia coli С
- Биологическая активность производных фуллеренов в отношении культуры бактериальных клеток Escherichia coli С
Введение к работе
Актуальность проблемы. Последнее десятилетие отмечено большим интересом к одной из аллотропных модификаций углерода - фуллеренам. Начиная с 1990 года, когда был предложен способ получения этого класса веществ в лабораторных условиях, т.е. когда фуллерены стали доступны широкому кругу исследователей, началось детальное изучение их уникальных физических и химических свойств (Мастеров В.Д., 1997). В настоящее время наука о фуллеренах приобрела междисциплинарный характер. Физика, химия, биология, математика, астрономия, геология, медицина - вот далеко не полный перечень научных дисциплин, в рамках которых проводятся исследования свойств фуллеренов (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1995).
Эти вещества привлекают внимание уникальной химической структурой и, как следствие, своеобразием свойств. Согласно многочисленным публикациям, посвященным фуллеренам, сфера их перспективного применения также чрезвычайно широка: создание сверхпроводников (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1995; Мастеров В.Д., 1997), синтез алмазов, разработка новых катализаторов и адсорбентов (Давыдов В.Я., Хохлова Т.Д., 2000), синтез экологически чистых источников тока и принципиально новых медицинских препаратов (Елецкий А.В., Смирнов Б.М., 1993; Andrievsky G.V. et al, 1997).
Перспектива использования фуллеренов в биологической и фармакологической практике заслуживает особого внимания. Результаты биологических исследований фуллеренов (Andrievsky G.V. et al., 1997; Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I., 1996; Kotelnikova R.A. et al., 1996) выявили наличие липофильных и мембранотропных свойств у этих веществ. Мембранотропность является чрезвычайно важным свойством. Учитывая, что множество жизненно важных для клеток биофизических и биохимических процессов связано с клеточной мембраной, можно предположить возможность использования фуллеренов для воздействия на эти процессы (Зайдес В.М., Жданов В.М., 1981; Штрауб Р.У.,
7 Болис Л., 1983; Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991; Кукайн Р.А., 1991). Это также может иметь отношение и к взаимодействиям клеток с вирусами - возбудителями различных инфекционных заболеваний, что представляет огромный практический и теоретический интерес как для медицины, так и для экспериментальной биологии.
Следует отметить, что перспектива успешного внедрения фуллеренов в биологическую и медицинскую практику, в частности, в качестве антивирусных препаратов, тесно связана как с неослабевающей потребностью в новых антивирусных химиопрепаратах, так и с проблемой синтеза водорастворимых производных фуллеренов (Lamparth L, Hirsch А., 1994; Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E, 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995; Tsuchiya Т., Yarnakoshi Y.N., Mi-yata N.A., 1995). Наиболее вероятно, что только при этом условии возможно эффективное взаимодействие указанных соединений с биофизическими и биохимическими факторами жизнеобеспечения клеток (Scrivens W.A., Tour J.M., Creek K.E, 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995). Важным обстоятельством для проведения работ в этом направлении является то, что технологии получения водорастворимых производных фуллеренов в настоящее время достаточно немногочисленны.
Одним из наиболее приемлемых в биологическом смысле путей создания водорастворимых соединений фуллеренов является получение их производных на основе матриц - носителей, в частности, поливинилпирролидона (Yarnakoshi Y.N. et al., 1994; Andrievsky G.V. et al., 1995). Вместе с тем, существует перспектива возможного использования в качестве таких матриц различных биомолекул - пептидов (Toniolo С. et al., 1994; Kotelnikova R.A. et al., 1996) и аминокислот (Vol'pin M.E. et al., 1995; Kotelnikova R.A. et al., 1996). В частности, это относится и к молекулам фосфолипидов (Бородин Е.А., Арчаков А.И., Лопухин Ю.М., 1985; Гордиенко А.Д., 1990; Тенанова Г.В., Кушнарева М.В., Светлов СИ., 1992). Есть основания полагать, что использование биомолекул позволит регулировать цитотоксичность синтезируемых соединений и, следо-
8 вательно, расширить спектр их биологической эффективности (Луйк А.И. и со-авт., 1999). Вероятно, осуществляя модификацию фуллеренов путем использования в качестве матриц биомолекул клеточной природы, можно повысить также и мембранотропность соответствующих производных.
Исходя из этого, важной задачей представляется сравнительное исследование эффективности действия производных фуллеренов, полученных с использованием разных матриц, в биологической системе вирус-клетка. Принимая во внимание вышесказанное, а также то, что проблема резистентности вирусов к химиопрепаратам до сих пор остается одной из чрезвычайно важных (Emini Е.А., 1995; Киселев О.И. и соавт., 2000), изучение биологической, в частности, антивирусной активности производных перспективного нового класса веществ - фуллеренов представляется интересной и актуальной задачей.
Цель работы. Целью настоящего исследования явилось изучение биологической активности водорастворимых производных фуллеренов на моделях РНК-содержащих оболочечных и безоболочечных вирусов и клеточных культур, чувствительных к этим вирусам.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: синтез водорастворимых производных фуллеренов; исследование параметров цитотоксичности синтезированных производных фуллеренов; исследование действия этих соединений на внеклеточные вирусы; исследование антивирусного эффекта производных фуллеренов в системе вирус - клетка-хозяин; сравнительная характеристика полученных производных по эффективности биологического действия.
9 Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод синтеза, с помощью которого впервые получено качественно новое водорастворимое производное фуллеренов. В качестве амфифильной матрицы для этого были использованы фосфолипиды клеточного происхождения — кефалины. Определены оптимальные весовые соотношения компонентов «фуллерен» : «матрица», при которых фуллерены наиболее полно переходят в водный раствор.
Обнаружен ингибирующий эффект производных фуллеренов, синтезированных на основе разных по химической природе молекулярных матриц (PVP, кефалинов и твина 20), на процесс репродукции РНК-содержащих вирусов человека и бактерий. Впервые проведены исследования биологической активности фуллеренов на моделях РНК-содержащих безоболочечных вирусов полиомиелита и бактериофага Escherichia coli /52.
На основании результатов проведенных вирусологических и электронно-микроскопических исследований выявлено, что фуллерены обладают способностью блокировать вирусную репродукцию на уровне мембранозависимых процессов - адсорбции и проникновения вируса в клетку.
В результате выполненной работы получены данные, доказывающие антивирусную эффективность фуллеренов в отношении различных вирусных инфекций. Работа на данном этапе имеет фундаментальное значение и позволяет расширить объем информации, касающейся медико-биологического аспекта науки о фуллеренах, в частности, их антивирусной активности. По результатам работы получен патент Российской Федерации № 2162819 «Способ получения водорастворимых производных фуллеренов», что свидетельствует о практической перспективности настоящей работы.
Положения, выносимые на защиту.
Возможность создания эффективных водорастворимых производных фуллеренов с использованием бифильных матриц различной химиче-
10 ской природы;
Параметры цитотоксического действия водорастворимых производных фуллеренов имеют дозозависимый и матрично-специфический характер. Фуллерены снижают токсичность веществ, использованных в качестве матриц;
Характеристики действия синтезированных производных фуллеренов на внеклеточные оболочечные и безоболочечные РНК-содержащие вирусы;
Протективное действие производных фуллеренов в системе вирус-клетка-хозяин в значительной степени реализуется на этапе мембрано-зависимых стадий вирусной репродукции.
Молекулярно-генетическая организация вирусов и реализация вирусной генетической информации. Ингибиторы вирусных ферментов
В соответствии с современными взглядами вирусы представляют собой особое царство микроорганизмов ультрамикроскопических размеров (от 15-18 до 300-450 нм (Лурия С. и соавт., 1981; Букринская А.Г., 1986; Агол В.И., 2000)), обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и генерирования энергии и являющихся, вследствие вышесказанного, абсолютными внутриклеточными паразитами (Коротяев А.И., Бабичев С.А., 1998). Основным структурным компонентом вириона является нуклеокапсид, внутри которого заключена нуклеиновая кислота - ДНК или РНК, которая выполняет функции вирусного генома. Следует отметить, что вирусные нуклеиновые кислоты отличаются большим разнообразием форм структурной организации (см. приложение 1 (Букринская А.Г., 1986)).
Вирусные капсиды построены в соответствии с принципом наименьшего уровня свободной энергии и имеют либо спиральную (орто-, парамиксовирусы, рабдовирусы (Букринская А.Г., 1986;; Бахов В.И., Майчук Ю.Ф., Корнев А.В., 1999)), либо изометрическую (пикорнавирусы, реовирусы, герпесвирусы и др. (Букринская А.Г., 1986)) симметрию. Каждый из этих видов формируется в процессе самосборки белков капсидов и нуклеиновых кислот вирусов (Филдс Б., Найп Д., 1989; Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991). Реальная форма и размеры вирусного капсида определяются специфической формой молекул белка, из которых строится капсид (Arsardi D.S., Porter D.C., Morrow CD., 1991), a также характером связей, которые эти белки образуют друг с другом (Быков В.Л., 1999).
Многие сложноорганизованные вирусы (представители групп миксовиру-сов, поксвирусов, герпесвирусов) имеют дополнительную внешнюю липопро-теидную оболочку - липидный бислой со встроенными в него типичными внутримембранными белками, чаще всего представленными гликопротеидами (Филдс Б., Найп Д., 1989). Благодаря особенностям вирусной репродукции вирусные белки имеют много общего с клеточными мембранными белками (Быков В.Л., 1999; Агол В.И., 2000).
Как известно, гликозилирование белков осуществляется клеточными ферментами (Альберте Б. и соавт., 1994; Быков В.Л., 1999), поэтому в зависимости от вида клетки-хозяина у одних и тех же вирусов может варьировать как состав углеводов, так и длина углеводной цепочки, и место прикрепления ее к полипептидному остову (Букринская А.Г. и соавт., 1982; Альберте Б. и соавт., 1994; Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., 1998). Посредством гликопротеидов вирион прикрепляется к клетке, при этом часто наблюдается высокоспецифичное взаимодействие с соответствующими рецепторами клетки-хозяина (Корнилаева Г.В., Слепушкин В.А., Букринская А.Г., 1986; Быков В.Л., 1994). Кроме того, вирусные гликопротеиды могут обладать ферментативной, в частности, нейрамини-дазной активностью (Харитоненков И.Г., Климов Э.Д., Каверин Н.В, 1978; Корнилаева Г.В., Слепушкин В.А., Букринская А.Г., 1986), а также способностью вызывать слияние клеток или лизис мембран эритроцитов.
В зависимости от типа репродукции вирусов и вида клетки-хозяина наблюдаются различия и в составе липидной фракции вирусных суперкапсидов (Бахов В.И., Майчук Ю.Ф., Корнев А.В., 1999). Например, почкующиеся вирусы (орто-, парамиксовирусы, рабдовирусы, тогавирусы, аренавирусы, корона-вирусы) имеют состав липидов, близкий к липидам плазматической мембраны клетки-хозяина. В составе вируса герпеса присутствуют липиды ядерной оболочки, а в составе вируса гепатита А - компонент мембраны эндоплазматиче-ской сети клетки-хозяина (Филдс Б., Найп Д., 1989). В липидной фракции вирусов содержится до 20-30% холестерина (Букринская А.Г., 1986) и 50-60% фос-фолипидов (фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфаитидилэтаноламин, сфингомиелин, фосфатидилглицерин и проч.) (Бородин Е.А., Арчаков А.И., Лопухин A.M., 1985), которые стабилизируют структуру вирусной частицы.
Информация об архитектуре и физико-химической организации конкретного вириона очень важна для прогнозирования возможных способов репродукции данного вируса (Агол В.И., 2000) и, как следствие, для поиска направлений и мишеней антивирусной химиотерапии. На современном этапе химиотерапия вирусных инфекций является прогрессивно развивающейся областью медицинской науки (Киселев О.И. и соавт., 2000). Тем не менее, существует ряд проблем: с одной стороны, общая токсичность существующих эффективных антивирусных препаратов и их достаточно ограниченный ассортимент, с другой - процессы формирования вирусной резистентности к этим химиопрепара-там и наличие выраженной природной изменчивости вирусных популяций вследствие высокой вариабельности вирусных геномов (Агол В.И., 1999; Киселев О.И. и соавт., 2000). Принимая во внимание вышеперечисленные обстоятельства, при конструировании антивирусных препаратов следует выделять поиск перспективных вирусных мишеней и поиск соответствующих ингибиторов, избирательно блокирующих функциональную активность вируса на различных стадиях его репродукции (Юркевич A.M., Швец В.И., 1999). Важно, что при наличии существенных различий в стратегии вирусных геномов, все же имеются и некоторые общие этапы вирусной репродукции, как таковой.
Как известно, вирусы являются генетическими паразитами, и в основе их взаимодействия с организмом хозяина лежит инфекционный процесс на уровне клетки, реализуемый путем взаимодействия клеточного и вирусного геномов (Альберте Б. и соавт., 1994). Этот процесс может носить разнообразный характер. Взаимодействие двух геномов может быть антагонистическим (Букринская А.Г., Жданов В.М., 1991). В этом случае вирусный геном исключает функционирование генетического аппарата клетки-хозяина и, соответственно, ингиби-рует синтезы клеточных макромолекул (Агол В.И., 1990). При таком взаимодействии в системе клетка - вирус осуществляются процессы, направленные в основном на воспроизводство вируса. В конечном итоге это приводит к гибели клетки-хозяина, что является обычным исходом цитоцидной вирусной инфекции (Лурия С. и соавт., 1981). Вирус может длительно размножаться в клетке, не всегда приводя к гибели последней (ВИЧ, вирус гепатита В). Такой тип взаимодействия вирусного и клеточного геномов называется персистентным (Медведева М.Н., Петров Н.А., 1990). Одни и те же вирусы, например, вирус гриппа, кори, бешенства, герпеса, аденовирусы, могут вызывать как цитоцид-ную, так и персистентную инфекцию. Кроме того, взаимодействие двух геномов может носить интегративный характер. Этот тип взаимодействия характерен для большинства умеренных бактериофагов (Гольдфарб Д.М., 1961; Лурия С. и соавт., 1981), ДНК - содержащих онкогенных вирусов, ретровирусов и др. В этом случае вирусная нуклеиновая кислота ковалентно встраивается в хромосомы клетки-хозяина и передается при делении последних как составная часть клеточного генома. Интегративный тип взаимодействия может сопровождаться нарушением характера роста клеток и их деления (Анджапаридзе О.Г. и соавт., 1962).
Действие фуллеренов на клетки и их цитотоксические свойства
Все исследователи, чьи работы посвящены синтезу и изучению активности фуллереновых производных, нацеленных на перспективу применения этого класса веществ в биологических системах, сталкиваются с необходимостью дополнительных исследований, касающихся токсичности (Nelson М.А. et al., 1993; Irie К. et al., 1996; Jensen A.W., 1996; Tsushiya T. et al., 1996; Yamago S. et al., 1998).
Анализ экспериментальных данных показал, что большинство синтезированных производных фуллеренов не вызывают выраженных токсических реакций в биологических системах. Однако вопрос о продолжительности наблюдений и до сих пор остается открытым. Авторы (Sakai A., Yamakoshi Y.N., Miyata N.A., 1995; Tsushiya Т. et al., 1996) с целью обнаружить возможную канцеро-генность Сбо и смеси Сбо/С7о, включая стимуляцию образования опухоли, исследовали влияние этих веществ на трансформацию клеток линии BALB/3T3 клона A31 и СЗН/10Т1/2 клона 8 in vitro. При этом было установлено, что Сбо и Сбо/С7о, переведенные в водный раствор с помощью поливинилпирролидона, не оказывали влияния на способность клеток BALB/3T3 образовывать колонии, что очевидно демонстрировало отсутствие цитотоксичности при концентрациях, превышающих значение 37,5 цг/мл. Особым обязательным условием при этом было проведение эксперимента в отсутствии света. Однако, аналогичные исследования, в которых клетки, инкубируемые в присутствии производных фуллеренов (рис. 19), дважды облучали 6W флуоресцентным светом, показали ингибирование роста клеток Hela S3 фуллереновыми дериватами. В качестве примера можно привести производное фуллеренов (рис.19) и его триэтилами-новую соль, которые в темноте не проявляли цитотоксичности в отношении клеток Hela S3 (1С5о ЮО иМ). В то же время, при экспонировании во флуоресцентном свете обнаруживалась значительная цитотоксичность этих соединений (IC50= 6,3 и 6,6 цМ соответственно)
Замечено, что фуллерены способны ассоциироваться с кератиноцитами и фибробластами человека, не оказывая влияния на их пролиферацию. Тем самым, утверждается, что накопление фуллеренов в клетках человека не приводит к острому токсическому эффекту (Minkovsky L.A. et al., 1995). Кроме того, показано, что фуллерены и их производные, накапливаемые в гепатоцитах, по-видимому, не метаболизируются и долго остаются в печени неизменными. Однако существует мнение, что, несмотря на отсутствие острой токсичности, накапливаемые в организме в течение долгого времени, фуллерены могут проявлять хроническое токсическое действие (Yamago S. et al., 1998).
С целью изучения цитотоксичности производных фуллеренов СбО и С70 с поливинилпирролидоном авторы (Yamakoshi Y.N. et al., 1994 - 1997) провели гемолитический тест с использованием бараньих эритроцитов, который показал, что суспензии производных Сбо и С70 в ФСБ после 30 минут соинкубирова-ния с бараньими эритроцитами не индуцировали гемолиз. Для сравнения: НД50 дигитонина, который был использован в качестве позитивного контроля, составляла 4 цг/мл, а НД5о Сбо и С70 превышали 200 дг/мл. Исследования токсикологических характеристик фуллеренов, проведенные in vivo на белых мышах и крысах (Nelson М.А. et al., 1993), продемонстрировали отсутствие токсического эффекта у этих веществ. В ходе эксперимента мышам подкожно вводили Сбо в количестве 200 цг. Показано, что в течение 72 часов не было выявлено влияния Сбо на синтез ДНК и активность орнитин-декарбоксилазы. Повторное введение Сбо на протяжении 24 недель также не привело, как можно было ожидать, к формированию злокачественной опухоли кожи лабораторных животных.
Отдельной графой следует выделить специфические генетические исследования, проведенные авторами (Захаренко Л.П. и соавт., 1997), которые выявили отсутствие генотоксичности фуллеренов Сбо в прокариотических клетках в условиях in vivo и in vitro. Эти исследования также показали отсутствие генотоксичности фуллеренов Сбо в отношении бактериальной культуры клеток Escherichia coli штамма PQ37 и соматических клеток крыла Drosophila melanogaster в концентрациях, не превышающих 2,24 иг/мл среды. В то же время при экспонировании на свету производные Сбо с поливинилпирролидо-ном проявляют мутагенную активность (Yamakoshi Y.N., Yagami Т., Mijata N.A., 1996) в отношении Salmonella штаммов ТА102, ТА104, YG3003.
Особого внимания заслуживают эмбриологические исследования активности фуллеренов и их производных. Изучая влияние Сбо на развитие эмбрионов в условиях in vivo и in vitro Tsushiya Т. и др. впервые обнаружили эффект фуллеренов, представляющий серьезную опасность для организма (Tsushiya Т., Yamakoshi Y.N., Mijata N.A., 1995). Фуллерен С6о, растворенный в воде с поливи-нилпирролидоном ингибировал дифференциацию и пролиферацию клеток среднего мозга 11-дневных мышиных эмбрионов в концентрациях IC50 фулле-рена 0,43 и 0,47 мг/мл соответственно (Tsuchiya Т. et al., 1996; Tsai М.С., Chen Y.N., Chiang L.Y., 1997). Эти результаты ярко продемонстрировали токсические свойства исследуемых фуллереновых соединений.
Учитывая химические особенности фуллеренов, а также тот факт, что негативное влияние этих веществ в биологических системах может быть в той или иной степени устранено при введении в систему антиоксидантов (Tsuchiya Т. et al., 1996; Tsai М.С., Chen Y.N., Chiang L.Y., 1997), токсичность фуллеренов чаще всего связывают с генерированием синглетного кислорода (Sera N., Tokiwa Н., Miyata N., 1996; Кулинский В.И., 1999; Чекнев СБ., 1999; Шепелев А.П. и соавт., 1999). В частности, авторы (Tsuchiya Т. et al., 1996) исследовали влияние Сбо-поливинилпирролидона и поливинилпирролидона на клетки среднего мозга 11-дневных эмбрионов мышей SLC-ICR в присутствии антиоксидантных ферментов - каталазы и супероксиддисмутазы. Исследования практически не выявили различий в дифференциации клеток, наблюдаемой в присутствии и без этих ферментов. Однако пролиферация клеток, ингибируемая Сбо, была частично восстановлена при введении антиоксидантных ферментов. Таким образом, напрашивается вывод, что Сбо способен уменьшать пролиферацию клеток через формирование соединений активного кислорода. Кроме того, обнаружено неблагоприятное действие С60 на эмбрионы в условиях in vivo. В экспериментах наблюдали гибель эмбрионов спустя 18 часов после внутрибрюшинного введения беременным мышам С60 в дозе 137 мг/кг. В противоположность этому введение поливинилпирролидона (18 г/кг) и дистиллированной воды (25 мл/кг) в качестве контроля не вызывало токсического эффекта в условиях эксперимента. Введение внутрибрюшинно беременным мышам дозы С6о 50 мг/кг и 25 мг/кг приводило к аномалиям в развитии эмбрионов. Исследования in vivo подтвердили описанные выше результаты, полученные in vitro с клетками среднего мозга: аномалии развития наблюдались в области головы мышиного эмбриона. Как и во всех вышеописанных случаях проявления токсичности фуллере-нов, наиболее вероятной причиной служит генерирование ими активного кислорода (Sera N., Tokiwa Н., Miyata N., 1996; Кулинский В.И., 1999; Чекнев СБ., 1999; Шепелев А.П. и соавт., 1999).
Изучение длительности латентного периода бактериофага /52 в культуре Escherichia coli С
Бактерии Е. coli С отмывали от питательной среды. Для этого в пробирку помещали 5 мл исходной бульонной бактериальной культуры Е. coli С и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин. После осаждения бактерий осторожно сливали супернатант. Осажденные клетки ресуспендиро-вали в 5 мл теплого раствора Хэнкса (t = 37 С) и снова центрифугировали со скоростью 3000 об/мин в течение 5 мин. Процедуру повторяли трижды. На последнем этапе отмытую и ресуспендированную в 10 мл раствора Хэнкса бактериальную культуру помещали в стабильные температурные условия (tu = 37uC). Ориентировочно концентрацию бактериальной взвеси определяли с помощью нефелометрии.
Одновременно для определения точной концентрации бактерий отбирали пробу объемом 0,1 мл, титровали 10-кратными разведениями в ЗФР (рН 7,2) и осуществляли прямой посев на среду Эндо. Посевы инкубировали в течение 24 часов при t = 37С. После инкубации подсчитывали число колоний и определяли концентрацию бактерий по формуле (1).
Исследования проводили на модели фага Е. coli /52, в качестве чувствительного штамма-индикатора использовали 8-часовую бульонную культуру Е. coli С. Весь эксперимент проводили в МПБ. Растворы производных фуллеренов также готовили на МПБ. Длительность латентного периода определяли в опытах с одним циклом размножения по методу Эллиса и Дельбрюка (Адаме М., 1964). В качестве контроля использовали бульонную культуру E.coli С в МПБ. Эксперимент проводили при t = 37 С. Множественность инфекции составляла 0,1. В зісспері" іепте Y. 9,9 ЛІГП Яуттр.готпй irvTTvrvnbT E. coli С добавляли 0,1 мл фага. Через 5 минут из первичной смеси брали 0,1 мл и разводили в 100 раз раствором Хэнкса, охлажденным до 4С с целью прекращения процесса адсорбции (Гольдфарб Д.М., 1961). Разведенные смеси центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин для отделения адсорбированного на бактериях фага от неадсорбированного. Затем осторожно удаляли надосадочную жидкость, ресуспендировали бактерии в 10 мл раствора Хэнкса и повторно центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин для удаления остаточного неадсорбированного фага. Супернатант осторожно удаляли. Осажденные бактерии с адсорбированным бактериофагом ресуспендировали в 10 мл МПБ (t = 37С) и 10-кратными разведениями титровали в МПБ (t = 37С) до значений концентрации клеток 10 КОЕ/мл и 1 КОЕ/мл. Контроль: взвесь клеток в МПБ без препарата. Опыт: взвесь клеток в МПБ, содержащем исследуемое производное фуллеренов в определенной концентрации. Через каждые 2 минуты, начиная с 15 минут от момента инокуляции фага, из двух последних пробирок пипеткой отбирали пробы по 0,1 мл. Количество бактериофага определяли титрованием по методу агаровых слоев (Гольдфарб Д.М., 1961; Ансова М.Г., Бонев М.Н., Данилов В.И., 1985) путем прямого подсчета негативных колоний бактериофага. При этом в нижний слой МПА добавляли стрептомицин (Sm). В качестве чувствительной культуры в верхний слой 0,5% МПА вводили бактериальную культуру Е. coli Csmr- Уровень резистентности культуры Е. coli С sm составлял 5000 мкг/мл. Концентрация Sm в МПА составляла 125 мкг/мл. Антибиотик был введен во избежание искажения результатов при подсчете БОЕ. Фаг, адсорбированный на бактериях, а также находящийся внутри бактериальных клеток, погибал при этом вместе с чувствительной культурой Е. coli С. Таким способом получали возможность по методу агаровых слоев выявлять только вновь синтезированный, вышедший из клеток бактериофаг /52, что отвечало задачам исследования. Посевная доза бактериально-фаговой смеси составляла 0,1 мл. Результаты опыта отражали в виде кривых репродукции фага, представляющих собой графическую зависимость lg числа БОЕ от времени инкубирования. Электронно-микроскопические изображения вирусов и клеток были получены с помощью электронного микроскопа JEM-100S (JEOL, Japan). Методики описаны в литературе (Пехов А.П.. 1962; Хэм А., Кормак Д., 1982; Harris J.R., Home R.W., 1986; Авцын А.П., Шахламов В.А., 1994). Исследуемую плотную суспензию клеток центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 20 мин и удаляли супернатант. Плотный осадок из клеток фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) при температуре 0-4С. После этого материал промывали физиологическим раствором и проводили контрастирование. Для этого материал обрабатывали 1% раствором Os04 на веронал - ацетатном буфере (рН 5,2)в течение 1,5 часа при tK0MH, промывали физиологическим раствором и дополнительно контрастировали 1,5% раствором уранилацетата в ацетатном буфере (рН 5,2) в течение 45 мин при tK0MH. Далее проводили обезвоживание и заливку материала в смолу по следующей схеме: клетки — этанол (10, 10 мин) — этанол (30, 10 мин) — этанол (50, 10 мин) -» этанол (70, 10 мин) -» этанол (70, 10 мин) — этанол (80, 10 мин) — этанол (96, 10 мин) — этанол (96, 10 мин) — (2 ч) этанол (96) + (1 ч) пропиленоксид (20 мин) — (1 ч) этанол (96) + (1 ч) пропиленоксид (20 мин) - (1ч) этанол (96) + (2 ч) пропиленоксид (20 мин) — пропиленоксид (15 мин) — пропиленоксид (15 мин) -» (2 ч) пропиленоксид + (1 ч) смола (60 мин) — (1 ч) пропиленоксид + (1 ч) смола (60 мин) - (1 ч) пропиленоксид + (2 ч) смола (60 мин) - смола (90 - 120 мин или на ночь) - термостат (60С, 1 сутки).
Биологическая активность производных фуллеренов в отношении культуры бактериальных клеток Escherichia coli С
Присутствие CCph в МПБ в количестве 100 мкг/мл приводило к уменьшению среднего времени генерации культуры Е. coli С на 2,36±0,10 мин (р=0,02), а присутствие кефалинов в той же концентрации - к увеличению этого показателя на 0,92±0,18 мин в сравнении с контролем. Бактериальная культура Е. coli С достигала максимальной концентрации клеток в течение 390,00±0,11 и 525,00±3 0,00 мин при инкубировании в присутствии CCph и кефалинов соответственно, в концентрации 1000 мкг/мл, и в течение 450,00±34,64 и 525,00±30,00 мин соотвественно, в концентрации исследуемых веществ 100 мкг/мл (табл. 7). Отличительным для кефалинов было то, что увеличение их концентрации в ростовой среде не влияло на показатели роста и размножения бактериальной культуры.
Параметры роста периодической культуры Е. coli С в присутствии производного фуллеренов CTw сильно отличались от вышеуказанных. В присутствии CTw в концентрации 1000 мкг/мл средняя скорость деления клеток Е. coli С снижалась в 1,7 раз (р=0,02). Среднее время генерации культуры при этом увеличивалось на 8,10±0,13 мин по сравнению с контролем и составляло 19,28±1,61 мин (р=0,02). Уменьшение концентрации CTw в МПБ до 100 мкг/мл приводило к уменьшению ингибирующего действия исследуемого производного фуллеренов на процесс деления клеток Е. coli С. В этих условиях среднее время генерации культуры увеличивалось на 9,54±0,13 мин по сравнению с контролем (р=0,02).
В присутствии твина20 в ростовой среде МПБ наблюдалось снижение средней скорости деления клеток Е. coli С в 2,06 и 1,9 раз соответственно. Число клеточных удвоений, происходящих за 1 час, в этих условиях уменьшалось до значений 2,61±0,35 и 2,83±0Д7 час" соответственно. Среднее время генерации бактериальной культуры в присутствии твина 20 в изученных концентрациях увеличивалась на 12,09±0Д 8 и 1 ОД 1±0,11 мин соответственно в сравнении с контролем (р=0,02).
Культура бактерий Е. coli С достигала максимальной концентрации клеток в течение 600,00±48,99 мин в присутствии твина 20 в количестве 1000 мкг/мл и в течение 585,00±57,44 мин в присутствии производного фуллеренов CTw в аналогичной концентрации. Снижение концентрации CTw до 100 мкг/мл практически не изменяло этот интервал времени, который составлял 585,00±30,00 мин (табл. 7). В то же время, уменьшение концентрации твина 20 в ростовой среде до 100 мкг/мл, приводило к ускорению процесса роста периодической культуры (табл. 7).
Эксперименты показали, что влияние производных фуллеренов и соответствующих им матриц на физиологию роста периодической бактериальной культуры Е. coli С проявлялось не одинаково. Соединение CPVP в изученных концентрациях увеличивало скорость деления клеток по сравнению с контролем.
Присутствие в питательной среде PVP в аналогичных концентрациях незначительно отражалось на процессе генерации. Сравнение констант скорости деления клеток Е. coli С (рис. 35) в присутствии CPVP и PVP при условии равенства их концентрации в МПБ выявило следующую закономерность. Константа скорости деления клеток в присутствии соединения CPVP в 1,2 - 1,1 раза превышала константу скорости деления в присутствии молекулярной матрицы PVP (рЮ,02).
Тенденция к увеличению скорости деления наблюдалась и в присутствии CTw. Скорость деления бактериальных клеток в ростовой среде, содержащей 1000 мкг/мл и 100 мкг/мл CTw, была в -1,2 - 1,1 раза выше скорости деления клеток в МПБ, содержащем твин 20 в тех же концентрациях (р=0,1).
Влияние производного CCph на процесс роста периодической бактериальной культуры носило иной характер. Константа скорости деления бактериальной культуры Е. coli С в присутствии высоких концентраций кефалинов, равная 6,64±0,14 час"1, превышала аналогичный показатель для CCph в -1,1 раз, однако различие было не достоверно. В присутствии CCph в количестве 100 мкг/мл наблюдался более интенсивный рост бактериальной культуры Е. coli С, чем в присутствии кефалинов в той же концентрации, о чем свидетельствует увеличение константы скорости деления в -1,4 раза (р=0,02).
Таким образом, было выявлено, что фуллерены в составе исследуемых водорастворимых производных изменяли эффект влияния, оказываемого на процесс роста периодической бактериальной культуры Е. coli С в сторону увеличения средней скорости деления, в случае CPVP, CCph и CTw. В высоких концентрациях CCph снижал скорость деления бактериальной культуры относительно аналогичного показателя в присутствии кефалинов.
Эффект, вызываемый более высокими концентрациями изучаемых производных фуллеренов и соответствующих матриц на поверхностные структуры бактериальных клеток, был исследован с помощью методов электронной микроскопии. Клетки инкубировали в присутствии изучаемых производных и матриц в концентрации, составляющей 5000 мкг/мл в течение 60 мин при температуре 37С. Результаты представлены на рис. 37-41 .
Как видно из представленных ниже электронных микрофотографий, по степени цитотоксичности исследуемые соединения распределились следующим образом: твин 20 СТ\у кефалиньі РУР ССр1і СРУР::=контроль. Воздействие высоких концентраций твина 20 на бактериальные клетки приводило к полной деструкции клеточной оболочки и, как следствие, к гибели клетки (рис. 38). В то же время дериват фуллеренов CTw с той же концентрацией не вызывал такого сильного эффекта.
На рис. 39 показано, что форма клетки в основном была сохранена, хотя и сильно деструктурирована. Отчетливо видны повреждения наружных слоев клетки, которые на фотографии выглядят более темными. Вполне закономерно, что и твин 20, и кефалины, являясь поверхностно-активными веществами, воздействовали именно на наружные слои клеток. Это могло привести к нарушению избирательной проницаемости плазматической мембраны.
Складчатость мембран, отраженная на рис. 39 - 41 как раз свидетельствовала о понижении поверхностного натяжения наружных слоев клетки и, соответственно, о понижении внутриклеточного осмотического давления. Воздействие высоких концентраций кефалинов в клетки E.coli С характеризовалось именно таким эффектом.
Как видно из рис. 42 инкубирование бактериальной культуры в присутствии CPVP не оказывало токсического действия на клетки Е. coli С. Форма клетки и рельеф клеточной поверхности был полностью идентичен контролю. Кроме того, после инкубирования в присутствии производного CPVP клетки не утрачивали репродуктивных функций.
