Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1. Алеутская болезнь норок.
1.1. Общие сведения об инфекции.
1.2. Хроническая форма алеутской болезни норок.
1.2.1. Симптомы и патологоанатомические изменения.
1.2.2. Тканевой тропизм и особенности вирусной репродукции.
1.2.3. Плазмоцитоз и гипергаммаглобулинемия.
1.2.4. Патогенез гломерулонефрита, вызванного инфекцией вируса алеутской болезни норок.
1.2.5. Роль антител в патогенезе алеутской болезни норок.
1.2.6. Возможная роль позднего промотора автономных парвовирусов в определении характера течения заболевания.
1.3. Острая пневмония у новорожденных щенят норок (легочная форма алеутской болезни норок) .
1.3.1. Симптомы и патологоанатомические изменения.
1.3.2. Патогенез легочной формы заболевания.
1.4. Современное состояние диагностики и профилактики алеутской болезни норок.
2. Молекулярно-биологическая характеристика вируса алеутской болезни норок.
2.1. Структура и стратегия репликации вирусного генома.
2.2. Структура и функции вирусных белков.
2.3. Структура и свойства вирионов вируса алеутской болезни норок.
3. Комплементарно адресованные полинуклеотиды как антивирусные агенты .
3.1. Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды.
3.2. Антисмысловые РНК.
3.3. Рибозимы.
Глава 2. Материалы и методы.
1. Материалы.
1.1. Клеточные линии, вирусы и бактериальные штаммы.
1.2. Плазмидные векторы.
1.3. Ферменты и другие реактивы.
2. Методы.
2.1. Основные генноинженерные методы.
2.2. Приготовление компетентных клеток Е. coli и их трансформация плазмидной ДНК
2.3. Электрофорез молекул ДНК в агарозном геле.
2.4. Полимеразная цепная реакция.
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.6. Дот- и блот-гибридизационный анализ ДНК и РНК.
2.7. Реакция транскрипции.
2.8. Реакция расщепления РНК-субстрата рибозимом.
2.9. Культивирование клеточных линий и вируса.
2.10. Нейтрализация инфекционной активности вируса.
2.11. Электронная микроскопия.
2.12. Трансфекция клеточных линий методом кальций-фосфатной преципитации .
2.13. Выявление временной экспрессии гена -галактозидазы в клеточных линиях.
2.14. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
1. Конструирование рекомбинантных плазмид для изучения противовирусного действия антисмысловых РНК и рибозимов.
1.1. Создание плазмидных конструкций с генами антисмысловых и смысловых РНК.
1.2. Создание плазмидных конструкций для изучения каталитической активности рибозимов.
2. Изучение принципиальной способности созданных рибозимов расщеплять РНК-мишень in vitro.
3. Оптимизация условий культивирования вируса алеутской болезни норок в клеточных линиях CRFK и FS.
4. Идентификация вируса, продуцируемого культурой клеток FS.
5. Разработка методики для оценки уровня вирусной репродукции в клетках с использованием метода дот-гибридизации ДНК.
6. Изучение противовирусной активности антисмысловых РНК в культуре клеток FS.
Выводы
Благодарности
Список литературы
Список сокращений.
- Острая пневмония у новорожденных щенят норок (легочная форма алеутской болезни норок)
- Комплементарно адресованные полинуклеотиды как антивирусные агенты
- Трансфекция клеточных линий методом кальций-фосфатной преципитации
- Оптимизация условий культивирования вируса алеутской болезни норок в клеточных линиях CRFK и FS.
Введение к работе
Алеутская болезнь норок (АБН) причиняет большой экономический ущерб зверофермам в связи с высокой смертностью животных (70-80%), ухудшением качества пушнины, резорбцией эмбрионов самок, стерильностью самцов (153, 165). Особенностью этого заболевания является то, что вирус алеутской болезни (ВАБ) вызывает у норок два совершенно разных синдрома. Так, у зрелых норок ВАБ вызывает состояние с фатальными вирус- индуцированными нарушениями иммунных функций, имеющее некоторые общие черты с системной красной волчанкой (9) и ВИЧ-инфекцией у человека (34). У новорожденных щенят, полученных от неиммунных самок, вирус вызывает острую пневмонию с крайне высокой смертностью, напоминающую острую респираторную вирусную инфекцию новорожденных, вызванную респираторно синцитиальным вирусом (11). В связи с вышеизложенным, АБН может представлять интерес для медицинской науки как модель для изучения различных патологических состояний вирусной этиологии.
Многочисленные попытки создания вакцины для борьбы с распространением АБН оказались безуспешными. Описан ряд случаев, когда у вакцинированных инактивированным вирусом норок после инфицирования болезнь протекала в более тяжелой форме (3, 117). Методы химиотерапии АБН также не разработаны. Основным способом контроля за распространением инфекции является ранняя диагностика заболевания, позволяющая вовремя изолировать больных животных (164, 165, 166). Так как традиционные методы лечения и профилактики вирусных заболеваний в отношении АБН оказались неэффективными, для борьбы с ней нужен поиск принципиально новых методов.
Одним из перспективных подходов к созданию искусственной противовирусной резистентности является использование генов комплементарно адресованных полинуклеотидов (КАП), в том числе генов антисмысловых РНК (асРНК) и рибозимов (167, 134). Ранее противовирусная активность различных типов КАП была продемонстрирована в отношении многих вирусов, в частности, вируса иммунодефицита человека (123, 143), вируса лейкоза коров (46, 152 41), вируса иммунодефицита кошек (97), вируса гепатита мышей (127), аденовируса человека 5 типа (98), вируса гепатита В уток (107) как в условиях клеточной модели инфекции, так и в организме лабораторных животных. Среди преимуществ КАП как потенциальных антивирусных агентов можно выделить их высокую специфичность и нетоксичность. В ряде экспериментов на лабораторных животных (in vivo) показана принципиальная возможность генной терапии вирусных заболеваний (107). Для животноводства подобные исследования представляют практическую значимость не столько для разработки методов лечения инфекционных заболеваний, сколько для получения хозяйственно ценных линий животных на основе трансгенных технологий. Надо отметить, что уже получены и описаны первые лабораторные трансгенные животные, несущие в своем геноме ген асРНК и проявляющие повышенную устойчивость к определённым вирусным инфекциям (152, 127, 71).
Исследование противовирусных свойств КАП является одним из актуальных направлений работ, имеющих не только практическую значимость для медицины и ветеринарии, но ценных также с позиций фундаментальной биологии.
Целью настоящего исследования являлось изучение противовирусной активности антисмысловых РНК и рибозимов в отношении инфекции, вызываемой ВАБ, в условиях культуры клеток.
Для реализации поставленной цели требовалось решение следующих
задач:
Создание серии генноинженерных конструкций, содержащих гены рибозимов и асРНК, направленных на матричные РНК ВАБ.
Получение анти-ВАБ рибозимов с помощью реакции транскрипции и изучение их принципиальной способности расщеплять РНК-мишень in vitro.
Разработка высокочувствительного метода для оценки уровня репродукции ВАБ в культуре клеток.
Разработка на основе культуры клеток, пермиссивной для ВАБ, модельной тест-системы для анализа противовирусного действия генов рибозимов и асРНК.
Оценка противовирусного действия генов рибозимов и асРНК в условиях клеточной модели инфекции ВАБ.
Научная новизна работы.
Впервые показана способность асРНК подавлять репродукцию ВАБ в условиях клеточной модели инфекции.
Впервые созданы конструкции для синтеза анти-ВАБ рибозимов и РНК-мишеней для них и показана принципиальная способность одного из рибозимов расщеплять РНК-мишень in vitro.
Впервые показана возможность репродукции непатогенного для норок штамма ВАБ ADV-G в иммортализованной линии клеток селезенки кошки FS и описаны особенности его репродукции в этой культуре клеток.
Обнаруженная способность ВАБ репродуцироваться в культуре клеток FS позволяет рассматривать ее в качестве потенциального продуцента вирусного антигена для диагностических целей. Кроме того, указанная линия может оказаться полезной в научных целях для моделирования острой формы инфекции ВАБ.
Предложена оригинальная методика оценки уровня репродукции ВАБ, основанная на оценке количества ДНК ВАБ в инфицированной культуре клеток с использованием метода дот-гибридизации ДНК. Предлагаемый метод заслуживает внимания как альтернативный для титрования вирусов, не вызывающих цитопатогенного действия в культуре клеток.
Разработана тест-система, позволяющая определять уровень репродукции ВАБ в инфицированных клетках с помощью метода дот- гибридизации ДНК.
Антисмысловые РНК против ВАБ обеспечивают существенное снижение репродукции вируса (штамм АЭУ-О) в культуре клеток (в 6-8 раз), однако их противовирусный эффект является кратковременным.
Практическая ценность.
Основные положения, выносимые на защиту.
1) Перевиваемая культура клеток селезенки кошки (FS) является пермиссивной клеточной системой для непатогенного для норок штамма ВАБ ADV-G.
Острая пневмония у новорожденных щенят норок (легочная форма алеутской болезни норок)
Известно, что сыворотка, полученная от больных АБН животных, является заразной для них, так как находящийся в составе иммунных комплексов вирус сохраняет инфекционность (131). Однако та же сыворотка способна нейтрализовать вирус для культуры клеток (35). Это наблюдение наводит на мысль о возможном вовлечении в патогенез заболевания механизма, названного антителопосредованным усилением инфекции (ADE - antibody-dependent enhancement of the infection), ранее описанного для вирусов ВИЧ-1, респираторно-синцитиального вируса, Денге, гриппа А и ряда других (62, 66, 99, 135, 136). В основе явления ADE лежит способность вируса, находящегося в составе иммунного комплекса, проникать в Fc+ клетку посредством рецептора Fc или рецепторов комплемента. Эти рецепторы связывают иммуноглобулин или комплемент на поверхности иммунного комплекса и образуют суррогатный вирус-рецепторный лиганд, обеспечивающий проникновение вируса в клетку при отсутствии истинного вирусного рецептора. Еще в конце 60-х годов прошлого века предположение о способности иммунных комплексов, циркулирующих у больных норок, инфицировать макрофаги и таким образом усиливать инфекцию высказал Porter с соавторами (120). Однако только в последние годы появились доказательства участия механизма ADE в патогенезе АБН. В отношении инфекции ВАБ явление ADE было продемонстрировано in vitro на первичных макрофагах норок и на иммортализованной человеческой моноцитарной линии К-562 (57, 83). Если штамм ADV-G преинкубировать с сывороткой от инфицированных норок, то его инфекционность для К-562 возрастает более чем в 10 раз (). Комплекс ВАБ (штамм Utah-1 ) с антителами, полученный инкубацией вируса с сывороткой больных норок, обеспечивал инфицирование 0.5-12% клеток линии К-562, тогда как вирус без антител не инфицировал клетки. Эти данные, полученные in vitro, согласуются с наблюдениями, сделанными на взрослых норках, где методами молекулярной гибридизации и иммуногистохимии была четко продемонстрирована ограниченная инфекция ВАБ Fc+ клеток - макрофагов, ФДК, В-лимфоцитов (7, 34, 84, 85, 141). Вовлечением механизма ADE скорее всего объясняется и тот факт, что вакцинация норок не защищает их от инфекции ВАБ, а, напротив, ведет к развитию более острой формы заболевания у иммунизированных животных после заражения (3). Пассивное введение норкам антивирусных антител на пике вирусной репродукции также усиливает тяжесть заболевания, вызывая острые некротические и воспалительные поражения органов (117). Стоит отметить, что вирус иммунодефицита человека обладает сходным тропизмом вируса к клеткам лимфатических узлов, а ФДК предположительно являются одним из возможных резервуаров для этого вируса во время интенсивной антивирусной терапии (141).
Далее, надо подчеркнуть, что только малая субпопуляция макрофагов способна поддерживать репродукцию ВАБ и экспрессию его генов. Около 2030% фагоцитарных клеток, выделенных из инфицированных лимфатических узлов, содержали вирусную ДНК, и только 1-2% - вирусную мРНК. У 2% инфицированных in vitro перитонеальных макрофагов норки обнаруживались вирусные антигены в ядре, что свидетельствует о вирусной экспрессии de novo в макрофагах (34, 83, 84).
До сих пор до не получил исчерпывающего объяснения тот факт, что одни автономные парвовирусы, такие как вирус энтерита собак (ВЭС), мелкий вирус мышей (МВМ), вызывают острую инфекцию с накоплением высоких титров вируса и выраженными гистопатологическими изменениями, тогда как заболевание норок при инфекции ВАБ имеет хронический характер с низкими вирусными титрами. Только в особых условиях инфекция ВАБ может вызывать острое заболевание - у новорожденных серонегативных щенят норок. Но и в этом случае уровень репликации ВАБ остается гораздо ниже, чем у ВЭС. Реплицируется ВАБ в культуре клеток CRFK значительно слабее, чем в той же линии реплицируется ВЭС. Изучение промоторов, ответственных за синтез мРНК структурных белков р36 (ВАБ) и р38 (ВЭН, МВМ), дало возможное объяснение этим наблюдениям (52, 132). В условиях клеточной линии CRFK промотор р38 обеспечивал уровень синтеза мРНК в 20-100 раз более высокий, чем р36 (133). Для объяснения пониженной транскрипционной активности промотора ВАБ р36 рассматривается роль многофункционального неструктурного белка NS1 как трансактиватора указанного промотора. Сравнение нуклеотидных последовательностей энхансерного участка перед р38 ВЭС и МВМ и р36 ВАБ показало, что ответственный за трансактивацию недействующий мотив TTGGTT у ВАБ присутствует в количестве 1-й копии и нарушен, представляя собой TTGGTA. Следовательно, слабый конститутивный промотор р36 ВАБ характеризуется ослабленным по сравнению с р38 уровнем трансактивации (133). Эта гипотеза объясняет также и то, что при инфицировании ВАБ в клетках CRFK на всех стадиях инфекции доминируют транскрипты, кодирующие вирусные неструктурные белки, тогда как при инфицировании клеток CRFK ВЭС преобладают транскрипты, кодирующие структурные вирусные белки.
В свете вышеизложенного можно предположить, что слабость промотора р36 определяет слабый характер репродукции ВАБ, что, возможно, и препятствует развитию острого заболевания у взрослых норок. У новорожденных щенят норок, полученных от неиммунных самок, инфекция ВАБ протекает в острой форме (11, 12, 19). Важной особенностью этой формы заболевания является то, что ей подвержены только серонегативные щенята норок. Первые сведения об острой форме ВАБ датируются 1982 годом, когда на четырёх датских фермах была зарегистрирована совершенно новая ВАБ-ассоциированная болезнь (42,88). Инфекция вызывала интерстициальную пневмонию у щенят в возрасте до 2,5 месяцев. В тот год четыре фермы потеряли 5000-6000 щенят при высочайшей смертности у щенят 3-8 недельного возраста. Попытки воспроизвести легочную форму АБН экспериментально увенчались успехом весной и летом 1983 года (10). Материал для инокуляции, был приготовлен гомогенизацией объединённых тканей лёгкого, печени и селезёнки щенят, павших во время вспышки 1982 года в Дании. Независимо от метода инфицирования все щенята, полученные от ВАБ-негативных самок, зараженные сразу после рождения, через 10-20 дней после инокуляции погибли от пневмонии. Дальнейшие исследования показали, что этиологическим агентом пневмонии у щенят является ВАБ.
Комплементарно адресованные полинуклеотиды как антивирусные агенты
Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции. Гидролиз ДНК (0,1-15 мкг) рестриктазами проводили в течение 1-3 часов при 37 С или 25С в присутствии 1-30 единиц активности фермента. Объем реакционной смеси составлял 10-300 мкл. Реакции проводили в соответствующих буферах.
Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в течение 16 часов при 14С в объеме 20-30 мкл при следующих условиях: 50мМ Трис-HCl (рН7,6), ЮмМ MgCl2 , 1мМ АТР, 1мМ DTT, 5% ПЭГ 8000, 5 ед. Т4 ДНК-лигазы. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli. После трансформации клетки высевали на чашки с LB-агаром (на 1л агаризованной среды: бакто-триптона - 10 г., дрожжевого экстракта - 5 г., NaCl - Юг., бакто- агара - 20 г., рН7,5), содержащим 100 мкг/мл ампициллина, при необходимости 32 мкг/мл X-gal и 0,15 мМ IPTG. Выращивали бактериальную массу изолированных колоний, выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее различными методами (электрофорез, ПЦР, рестрикционный анализ, секвенирование) с целью отбора искомого рекомбинанта.
Фосфорилирование и дефосфорилирование ДНК производили с помощью ферментов полинуклеотидкиназы фага Т4 и щелочной фосфатазы в соответствующих буферах при 37 С в течение ЗОмин.
Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах проводили методом кипячения, а в препаративных количествах методом щелочного лизиса (160). Очистку ковалентно замкнутой плазмидной ДНК, предназначенной для трансфекции эукариотических клеток, проводили равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием (160). Определение концентрации ДНК проводили спектрофото- метрическим методом. При этом исходили из того, что оптическая плотность А=1 при длине волны, равной 260 нм, соответствует 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. О чистоте нуклеиновой кислоты в изучаемой пробе судили по величине отношений А260/А280 и А260/А230. Для чистых препаратов ДНК эти отношения должны составлять соответственно 1,7-1,9 и 2,1-2,3.
Бактерии (Е. coli) выращивали в среде LB (на 1л: бакто-триптона - 10 г, дрожжевого экстракта - 5 г, NaCl - Юг, рН7,5). Твердую среду получали добавлением в жидкую среду бакто-агара (на 1л - 15-20г). Среды и растворы стерилизовали автоклавированием или фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Для селекции ампициллин-устойчивых клонов бактерий в среду добавляли ампициллин до концентрации 50-150 мкг/мл. Приготовление компетентных клеток Е. coli и их трансформацию плазмидной ДНК проводили, согласно стандартной методике по Ханаану (155). Стерильной вольфрамовой петлей отбирали несколько свежих колоний Е. coli диаметром 2-3 мм, выращенных на чашке с агаризованной средой SOB (бакто-триптон - 2%; дрожжевой экстракт - 0,5%; ЮмМ NaCl; 2,5 мМ KCl; 10MM.MgCl2; 10 мМ MgS04). Засевали клетками колбу со средой SOB (30-100 мл на колбу объемом 1л). Инкубировали при 37С до тех пор, пока титр культуры не достигнет 4-7 107 жизнеспособных клеток/мл. Затем клеточную культуру переносили в полипропиленовые пробирки, охлаждали во льду 10-15 мин. и центрифугировали при 750-1000g в течение 12-15 мин при 4С. Далее клетки ресуспендировали в буфере RF1 (ЮОмМ RbCl, 50мМ МпС12, ЗОмМ ацетат калия, 75мМ СаСЬ, 15% глицерин, рН 5.8) и инкубировали во льду 15 мин. Снова осаждали центрифугированием при 750-1000g, ресуспендировали в буфере RF2 (ЮмМ MOPS, ЮмМ RbCl, 75мМ СаС12, 15% глицерин, рН 6.8) и инкубировали во льду 15 мин. Приготовленные таким образом клетки разливали по 200 мкл и хранили при -70 С. Для трансформации в клетки во льду добавляли раствор ДНК в объеме менее 20 мкл, инкубировали 10-60 мин, подвергали тепловому шоку при 42С в течение 90 секунд и быстро охлаждали на льду. Добавляли 800 мкл среды SOC (аналогична SOB, но содержит дополнительно 20мМ глюкозы) и инкубировали 30-60 минут при 37С. Затем трансформированные клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB и ампициллином и проводили отбор трансформантов.
Электрофорез ДНК проводили в горизонтальных пластинах с 0,6-2% агарозой ("Sigma", США), приготовленной на буфере, содержащем 0,05М трис- НС1, 0,05М ацетат натрия, 0,5 мкг/мл бромистого этидия, 5мМ ЭДТА, рН 8,0. Перед нанесением на гель в пробы добавляли 0,25% раствор бромфенолового синего и 0,25% раствор ксилолцианола в 30% глицерине до 10% от общего объема. Электрофорез проводили в режиме 5-10 вольт/см геля в течение 0,5-2 часов. ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм и фотографировали.
ПЦР проводили в амплификаторе фирмы "Терцик" (Россия). Реакции ставили в объеме 20 мкл для аналитических целей и 100 мкл для препаративных целей под слоем вазелинового масла в пробирке на 0,5 мкл. Условия реакции: 10 мМ Трис-HCl (рН8,4 при 20С), 50 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 200 мМ каждого dNTP, 0,25 мМ каждого праймера, 0,01-0,001 мкг ДНК-матрицы, 5 ед. Taq- полимеразы. Температуру отжига для праймеров длиной 20 нуклеотидов определяли по формуле Tnr A+T G+C) . Длительность циклов отжига и денатурации составляла 40-60 сек. Длительность цикла элонгации определяли в зависимости от длины ожидаемого ПЦР-продукта из расчета 1 минута на 1000 нуклеотидов.
Секвенирование ДНК осуществляли методом терминации цепи по Сэнгеру с помощью Taq-полимеразы по протоколу фирмы "Promega". Использовали фирменный набор реактивов "fmolR DNA Cycle Cequencing System". Радиоактивное мечение производили с помощью a-32PdATP или y-32PdATP, соответственно, прямым встраиванием меченого нуклеотида или 5 -концевым мечением праймера. В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды ICP- 1, ICP-2, Forvard, Revers (см. таб. на стр. 50). Полимеразную реакцию проводили в амплификаторе фирмы "Терцик" с использованием программы: 1) 94С - 3 мин. (1 цикл); 2) денатурация - 94С - 30 сек., отжиг - для праймеров Forvard и Revers - 42С, для праймеров ICP-1 и ICP-2 - 60С - 30 сек., синтез - 70С - 1 мин. (30 циклов); 3) 4С - хранение. К полученным образцам добавляли равный объем буфера с формамидом (95%) и прогревали их 2-5 мин при 80-90С. В каждый слот 5-7% полиакриламидного денатурирующего геля наносили по 3 мкл соответствующего образца. Электрофорез проводили с помощью камеры фирмы "LKB" при постоянном напряжении (25-30 вольт/см) при температуре 55С. По окончании электрофореза проводили фиксирование геля в 10% уксусной кислоте, затем гель сушили на стекле при температуре 120С. Экспонирование с радиографической пленкой проводили в течение 24-48 часов.
Трансфекция клеточных линий методом кальций-фосфатной преципитации
Опыт зарубежных авторов свидетельствует о том, что создание рибозима, эффективно расщепляющего РНК-мишень in vitro является непростой задачей, и стандартного алгоритма для этого не существует. Соблюдение всех необходимых условий и самые тщательные расчеты при создании рибозима не являются полной гарантией его эффективности. Большинство полученных в разное время и в разных лабораториях рибозимов были способны полностью расщеплять РНК-мишень in vitro только при условии превышения молярной концентрации рибозима над РНК-мишенью. Иногда для этого требовался даже 500-1000-кратный молярный избыток рибозима (55). Для достижения высокого процента расщепления в условиях приблизительно эквимолярного соотношения рибозима и РНК-мишени реакционную смесь перед началом реакции приходится нагревать до 70-80С с целью освобождения сайта связывания рибозима на РНК-мишени от собственных шпилек. Это, безусловно, является отходом от принципа соблюдения физиологических условий при проведении реакции, однако без предварительного прогрева реакционной смеси достижение высокого уровня расщепления РНК-мишени in vitro становится проблематичным.
Реакцию расщепления РНК-субстрата рибозимом проводили в 50Мм Трис- НС1 при значении рН 7.5. Реакционную смесь, содержащую рибозим и РНК- мишень (молярное соотношение 1:3, 1:1 и 3:1), прогревали при 80С 2 мин, постепенно, в течение 10 минут, охлаждали до 37С и, после добавления MgCl2 и плацентарного ингибитора рибонуклеаз, инкубировали 24 часа. Для того, чтобы выявить динамику расщепления РНК-мишени во времени, через 5 мин., 30 мин., 2 часа и 5 часов из реакционной смеси отбирали и замораживали пробы для электрофореза. Продукты реакции денатурировали формамидом и нагреванием, затем разделяли в 6% денатурирующем ПААГ. Результаты реакции выявляли радиоавтографией. В отношении 1-го рибозима мы не получили свидетельства о расщеплении РНК-мишени in vitro. 2-й рибозим частично расщеплял 2-ю РНК-мишень. Наиболее эффективное специфическое В качестве клеточной модели инфекции, вызываемой ВАБ, в научных исследованиях, а также для получения культурального антигена в нашей стране и за рубежом широко используется перевиваемая линия клеток почки кошкщ (CRFK) (34, 115). Штамм ADV-G в клетках CRFK достигает титров 107 флюоресцирующих фокусобразующих единиц/мл. Выраженное цитопатогенное действие в зараженных клетках отсутствует, поэтому титрование вируса проводят с помощью метода иммунофлюоресценции. Репродукция ADV-G в клетках CRFK имеет температурночувствительный характер - инфекция является продуктивной лишь при температуре 32С. Первоначально для проведения экспериментов планировали использовать культуру клеток CRFK и адаптированный для размножения в этой культуре клеток штамм ВАБ ADV-G.
Работая над оптимизацией условий культивирования ADV-G в культуре клеток CRFK, мы решили определить чувствительность к ВАБ другой культуры клеток кошки. Поскольку ВАБ обладает лимфотропностью (34, 79) и в высоком титре размножается в лимфатических узлах, селезенке, В-лимфоцитах норок, нам представилось целесообразным изучить взаимодействие вируса с перевиваемой линией клеток селезенки кошки FS (158, 162). Культура клеток FS характеризуется эпителиоподобной морфологией и монослойным способом культивирования. Кроме того, клетки FS являются чувствительными к парвовирусам плотоядных, в частности, к вирусу энтерита собак, вирусу энтерита норок и вирусу панлейкопении кошек.
Проведенные нами эксперименты впервые показали возможность репродукции непатогенного для норок штамма ВАБ ADV-G в клеточной линии FS. Вируссодержащим клеточным лизатом, полученным из зараженной ADV-G линии CRFK, была инфицирована культура клеток FS. За развитием инфекционного процесса наблюдали в течение 10 пассажей. Было отмечено, что вирус размножался в испытуемой культуре, вызывая выраженное цитопатогенное действие, которое характеризовалось гибелью части клеток и появлением многоотростчатых форм среди выживших клеток. Для выявления вируса в клетках использовали два метода - дот-гибридизацию ДНК и электронно-микроскопическое исследование.
Метод дот-гибридизации ДНК позволял не только выявлять вирус- специфическую ДНК, но также оценивать накопление этой ДНК в клетках. В качестве "плюс"- контроля использовали разведения смеси из 3 плазмид с известной концентрацией со встроенными в них фрагментами ДНК АОУ-О., "Минус"-контролями служила ДНК, выделенная из неинфицированных клеток. Результаты экспериментов, представленные на радиоавтографе (рис.12), позволили сделать заключение о высокой специфичности этого анализа, а также о быстрой адаптации вируса к новой клеточной системе. Данные, представленные на рисунке, свидетельствуют также о том, что вирус, продуцируемый культурой клеток не теряет инфекционности для культуры клеток СКРК.
Оптимизация условий культивирования вируса алеутской болезни норок в клеточных линиях CRFK и FS.
Как видно из рисунка 20, интенсивность радиоактивного сигнала в точках с 6 по 10 изменяется непропорционально количеству нанесенной вирусной ДНК. Так разведение вирусной ДНК в 10 раз обеспечивает снижение радиоактивного сигнала в 2-4 раза. Для более адекватной оценки количества специфической ДНК в пробе необходимо произвести следующий пересчет. На основе данных о радиоактивности контрольных проб с известным количеством вирусной ДНК (рис. 20) строится калибровочная кривая (рис. 21). С помощью такой калибровочной кривой значения радиоактивного сигнала в опытных точках переводятся в значения количества ДНК (например, в пг ДНК). Таким образом можно определить, что в точку 1 (рис. 20) нанесено в составе общей клеточной ДНК примерно 8000 пг, или 8 нг ДНК ВАБ. В дальнейших экспериментах определение количества вирусной ДНК в пробе выделенной из инфицированных клеток ДНК проводили с помощью построения калибровочных кривых.
Далее надо отметить, что накопление вирусной ДНК в инфицированной клетке может быть не связано с накоплением инфекционного вируса. Инфицирование ВАБ клеток разного тканевого происхождения показало, что присутствие в них детектируемого количества вирусных нуклеиновых кислот еще не свидетельствует о накоплении инфекционных вирионов (57, 83). Возникает вопрос - как, используя метод дот-гибридизации ДНК, оценить инфекционность вирусного материала ВАБ?
Из литературных источников известно, что на использовании дот- гибридизации основан один из методов определения титра ретровирусов в культуральной среде (156). Он заключается в выделении геномной РНК из предварительно сконцентрированного вируса, проведении ее гибридизации с меченным 32Р ДНК-зондом на фильтре и оценке радиоактивного сигнала. Количественное определение вируса достигается путем сравнения полученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов точно титрованного вируса или известных количеств РНК или ДНК, нанесенных на фильтр. Одним из недостатков этого метода, является то, что с его помощью определяется вся вирионная нуклеиновая кислота, независимо от инфекционности вирионов. Другой недостаток, определяемый чувствительностью дот-гибридизации, заключаются в том, что с его помощью можно определить РНК вируса, собранную только с большого объема культуры, что неудобно при работе с большим количеством проб.
Для оценки инфекционности ВАБ в культуре клеток мы модифицировали описанную выше методику. Известно, что заражение клеток ВАБ сопровождается накоплением в них значительного количества вирусной ДНК - среднем на одну клетку на 3-4-й день после инфицирования приходится 105 копий ДНК ВАБ (34). Зная об этом, мы предположили, что если приготовить разведения вирусного материала и инфицировать ими клетки, то можно косвенно, по накоплению в них вирусной ДНК, определить инфекционность внесенной в клетки пробы с вирусом. Таким образом, теоретически, в результате заражения клетки одним инфекционным вирионом, в ней на 3 сутки п.и. (до появления выраженного ЦПД) должны накопиться десятки тысяч копий генома ВАБ. В соответствующее количество раз должна увеличиться и чувствительность метода, при последующем учете накопившейся ДНК с помощью гибридизации. Кроме того, преимуществом такого подхода для титрования вируса, по сравнению с простым количественным учетом вирионной ДНК, является то, что с его помощью выявляется только инфекционный вирус. Недостаток метода заключается во введении в исследование дополнительного этапа, который увеличивает трудозатраты и погрешность.
Для того чтобы экспериментально подтвердить эти предположения, инфицировали равные количества клеток линии Б Б 5-кратными разведениями вирусного материала, на 3-й сутки выделяли из них тотальную ДНК и изучали ее с помощью дот-гибридизации и радиоавтографии. Рис. 22 демонстрирует зависимость накопления в клетках вирусной ДНК от количества внесенного в лунку вирусного материала. Интенсивность сигнала, как видно из рисунка, изменяется в зависимости от разведения вируса. С помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика можно оценить интенсивность радиоактивного сигнала в каждой точке, а с помощью построения калибровочной кривой - выразить полученные значения в нанограммах вирусной ДНК. Представленные данные свидетельствуют о возможности использования описанного подхода для приблизительной оценки инфекционности вирусного материала. Хотя метод титрования вируса не позволяет оценить количество инфекционных частиц в единице объема препарата вируса, он дает возможность косвенно сравнить количество инфекционного материала разных пробах. Для решения задач диссертационной работы этих возможностей достаточно.
Эксперименты по изучению противовирусного действия асРНК в культуре клеток проводили в трех повторностях по схеме, представленной на рис. 23. На основе культуры клеток ББ были получены клеточные линии, стабильно трансфецированные плазмидами с генами асРНК и сРНК, а также исходной плазмидой. Для этого культуру клеток Б8 трансфецировали исходной и рекомбинантными плазмидами с использованием кальций-фосфатного метода.
В качестве маркера эффективности временной трансфекции использовали плазмиду рСМУ-(}-Оа1-8Р(ЖТ, несущую ген р-галактозидазы под контролем предраннего СМУ-промотора. Экспрессию гена Р-галактозидазы выявляли окрашиванием фиксированных клеток раствором, содержащим хромогенный субстрат Х а1 (рис. 24). С помощью микроскопического исследования оценивали количество яркоокрашенных синих клеток на фоне бесцветного монослоя через 48 часов после трансфекции. Эффективность экспрессии определяли делением числа окрашенных клеток на общее количество трансфецированных клеток и выражали в процентах. Эффективность временной трансфекции культуры клеток СШ К составляла 4-10%, а культуры клеток Б8 - 2-5%. На рис. 24 представлены фотографии клеток СИРК, трансфецированных плазмидой рСМУ-р-Оа1-8РСЖТ и нетрансфецированных, после специфической окраски раствором с хромогенным субстратом Х а1.
Селективным маркером для получения стабильно трансфецированных клеточных линий служил ген неомицинфосфотрансферазы, имеющийся в составе плазмиды рС1пео. Трансфецированные плазмидами популяции клеток получали селекцией клеток в присутствии генетицина (0-418) в концентрации 250 мкг/мл. В среднем под "генетициновым прессом" клетки культивировали от трех недель до одного месяца. После получения монослоя устойчивых к генетицину клеток для закрепления результатов трансфекции проводили, по меньшей мере, еще два пассажа клеток в присутствие антибиотика. Долговременная устойчивость клеток, полученных в результате стабильной трансфекции, являлась свидетельством интеграции гена неомицинфосфо- трансферазы в геном клетки.
![Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс]](/i/i/4440/193595.png "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна")
