Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор Литературы 11
1.1. Антиретровирусные препараты и их мишени 11
1.2. Взаимодействие ВИЧ-1 с рецепторами клеточной мембраны 13
2.2. Взаимодействие рецептора CD4 с гликопротеином оболочки ВИЧ-1 gp!20 16
2.3. Рецепторы хемокинов - корецепторы ВИЧ 17
2.3.1. CCR5 - клеточный корецептор ВИЧ. 19
2.3.2. CxCR4 -клеточный корецептор ВИЧ. 23
3. Анти-ВИЧ соединения, действующие на стадии проникновения вируса в клетку 27
3.1. Соединения, блокирующие взаимодействие гликопротеина gpt20 ВИЧ-1 с
клеточным рецептором СD4 28
3.1.1. Соединения, воздействующие па вирусный оболочечный белок gpl'20. 29
3.1.2. Соединения, блокирующие клеточный рецептор CD4 33
3.2. Соединения, воздействующие на хемокиновый рецептор CCR5 35
3.3. Соединения, воздействующие на хемокиновый рецептор CxCR4 41
3.4. Ингибиторы слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны 49
3.5. Соединения комбинированного действия - 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Вирус. 57
2.1.2. Культуры клеток. 58
2.1.3. Исследуемые соединения 55
2.2. Методы 59
2.2.1. Ведение культуры лимфобластоидных клеток МГ-4. 59
2.2.2. Культивирование и определение инфекционное ти штаммов ВИЧ-1 60
2.2.3. Оценка цитотоксичности противовирусных препаратов. 61
2.2.4. Определение анти-ВИЧактивностимембранотропных препаратов. 62
2.2.5. Иммуноферментный анализ ингибирования накопления вирусного АГр24 в культуре клеток, 64
2.2.6. Статистическая обработка данных. 65
Глава 3. Результаты исследований 66
3.1. Токсичность комплексных мембранотропных соединений и их компонентов 67
3.2. Определение фазы жизненного цикла ВИЧ, на котором исследуемые соединения проявляют ингибиругощее действие 69
3.3. Анти-ВИЧ активность базовых полимерных соединений 71
3.4. Анти-ВИЧ активность адамантан-содержащих соединений на базе матриц разных типов 73
3.5. Активность комплексных препаратов в отношении штаммов ВИЧ-1 в зависимости от длины спейсера и типа модификатора 75
3.6. Анализ анти-ВИЧ активности соединений, с включенными в состав пептидами 79
3.6.1. Выбор и синтез пептидов - имитаторов корецепторов ВИЧCCR5, CxCR4.,... 79
3.6.2. Анализ апти-ВИЧ активности пептидов - имитаторов корецепторов ВИЧ, ко.мшексных пептид-содержащих препаратов и смесей их компонентов 80
3.6.3. Анти-ВИЧ активность комплексных препаратов, содержащих гидрофобные агенты и пептидные имитаторы корецепторов ВИЧ. 83
3.6.4. Сравнение бинарных пептид-содержащих соединений с препаратами, модифицированными адамантаном или норборнеиом 86
3.6.5. Исследование анти-ВИЧ эффективности препаратов при многократном внесении их в культуру клеток МТ-4 в течение инкубации. 87
3.6.6. Анти-ВИЧ активность комбинаций мембранотропных препаратов. 89
Глава 4. Обсуждение результатов.. 95
Заключение 105
Выводы 107
Список литературы ...109
Приложение 130
- Взаимодействие ВИЧ-1 с рецепторами клеточной мембраны
- Анти-ВИЧ соединения, действующие на стадии проникновения вируса в клетку
- Иммуноферментный анализ ингибирования накопления вирусного АГр24 в культуре клеток,
- Определение фазы жизненного цикла ВИЧ, на котором исследуемые соединения проявляют ингибиругощее действие
Введение к работе
Актуальность проблемы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), описанный впервые в 1981 году в США, на сегодняшний день является одним из наиболее опасных инфекционныхзаболеваний. Распространение ВИЧ/СПИДприняло характер глобальной эпидемии. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, на конец 2003г. в мире зарегистрировано около 40 млн. человек инфицированных ВИЧ, а 23 млн. человек погибли от СПИДа с начала его распространения [UNAIDS/WHO, 2003]. В течение последнего десятилетия в Российской Федерации также отмечается исключительно резкий рост случаев инфицирования ВИЧ. На 1 января 2004 года, по официальным данным, в стране зарегистрированы более 264 тысяч ВИЧ-инфицированных, которые выявлены практически во всех субъектах Российской Федерации.
Учитывая скорость распространения ВИЧ-инфекции и отсутствие лекарств, способных излечивать СПИД, очевидна актуальность поиска какэффективных препаратов для терапии ВИЧ/ СПИД, таки средств защиты от инфекции, в частности, вакцины и микробицидов, предотвращающих половую передачу ВИЧ.
Возможно, основой для создания эффективных ингибиторов ВИЧ станут достижения последнего десятилетия по детальному изучению механизма многостадийного взаимодействия вирус-клетка. Новые возможности для блокады ВИЧ-инфекции открывает установление роли клеточных хемокиновых рецепторов CCR5 и CxCR4 в механизме проникновения вируса в клетку [Brelot et al., 2000; Chabot et al., 1999; Farzan et al, 1998; 2002] и обнаружение конформационных изменений, происходящих с белками оболочки вирусаgp 120 и gp41 [Moore et al., 1993; Root et al., 2001; Sullivan et al., 1998; Wyatt et al., 1998]. Мишенями для ингибиторов ВИЧ-1 могут стать как трансмембранные клеточные корецепторы ВИЧ: CCR5 и CxCR4, так и консервативные участки белка оболочки вируса gpl20, отвечающие за связывание с корецепторами, или структурные элементы вирусного гликопротеина gp41, задействованные в трансформации данного белка. Препараты, обладающие мембра-нотропными свойствами, в настоящее время находятся в стадии разработки и в клинической
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка и исследование высокоэффективных анти-ВИЧ препаратов, действующих на стадии адсорбции и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки. В задачи работы входило:
Исследовать цитотоксичность и анти-ВИЧ активность (in vitro) мембранотропных полимеров различного строения и комплексных соединений типа Матрица-Гидрофобный Агент (МГА), полученных путем модификации полимеров известным противовирусным агентом адамантаном. Определить наиболее подходящий полианион для последующих модификаций.
Выявить принципиальные особенности структурной организации комплексных мембранотропных соединений, обеспечивающие достижение наибольшего противовирусного эффекта.
Определить этап жизненного циклаВИЧ, на котором соединения реализуют противовирусную функцию.
Провести литературный поиск функционально важныхдоменов корецепторов ВИЧ-1/2 CCR5 и CxCR4, выбрать фрагменты, обеспечивающие взаимодействие с белком оболочки ВИЧ-1 gpl20 для синтеза пептидов - имитаторов данных участков корецепторов ВИЧ.
Изучить цитотоксичность и противовирусную активность (in vitro):
а) выбранных пептидов, как самостоятельных противовирусных агентов, так и в смеси с изучаемыми мембранотропными соединениями;
б) новых мембранотропных соединений типа Матрица-Пептид (МП) и Матрица-Гидрофобный Агент-Пептид (МГАП), содержащих ковалентно связанные пептиды.
Оценить влияние комбинаций полученных соединений на репродукцию ВИЧ-1 на модели лимфобластоидных клеток человека.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Впервые предложены и изучены перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа на основе полианионных матриц, модифицированных низкомолекулярными гидрофобными агентами карбоциклического строения (производными адамантана и норборнана) и/или пептидными имитаторами фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На комплексные пептид-содержащие соединения подана заявка на патент Российской Федерации № 2004117904 приоритет от 11 июня 2004г.
Подтверждена целесообразность применения полианионных соединений, несущих упорядочение расположенные карбоксильные группы, в качестве «сборочных молекулярных платформ» для конструирования комплексных анти-ВИЧ препаратов.
Выявлены принципиальные особенности структурной организации исследуемых соединений, обеспечивающие реализацию противовирусной активности. Доказана эффективность включения в состав комплексных противовирусных препаратов пептидов, тропных к сайтам гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, участвующих в связывании с клеточными кэрецепторами ВИЧ.
Показано, что ингибирующее действие испытанных соединений локализовано на этапе проникновения ВИЧ в клетку-мишень.
Установлено, что большинство изученных бинарных препаратов проявляют независимый и синергичный характер действия при совместном применении, что создает хорошие предпосылки для их комбинированного использования в качестве агентов, блокирующих проникновение вируса в чувствительные клетки.
Разработанные комплексные соединения являются перспективными анти-ВИЧ препаратами, и могут быть использованы как микробициды, т.е. средства, предохраняющие от передачи ВИЧ-инфекции половым путем при местном применении.
Положения, выносимые на защиту:
-
Изучена анти-ВИЧ активность четырех поликарбоксилатов различного строения и их производных, модифицированных аминоадамантаном. Среди исследованных соединений полимер As470 (синтетический сополимер малеиновой кислоты) является лучшим кандидатом для получения на его базе комплексных анти-ВИЧ препаратов.
-
Выявлены принципиальные особенности структурной организации комплексных мембранотропных соединений, обеспечивающие достижение максимального противовирусного эффекта препаратами. Наиболее важными факторами являются гибкость полианионной матрицы (за счет включения дополнительных метиленовых групп в мономерное звено) и тип стереоизомера гидрофобного агента.
-
Исследованы перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа- МП (As641, As643, As645), полученные путем модификации полимерной матрицы As470 пептидами - имитаторами фрагментов корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На модели острой ВИЧ-инфекции (in vitro) определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений.
-
Изучена анти-ВИЧ активность новых трехкомпонентных соединений (тип МГАП), содержащих как пептидные фрагменты корецепторов ВИЧ, таки известные мембранотропные гидрофобные агенты (адамантан, норборнен). Определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений в культуре клетокМТ-4, инфицированной ВИЧ-1.
-
Определен этап жизненного цикла ВИЧ, на котором исследованные соединения реализуют противовирусную функцию.
-
Выявлен аддитивный эффект при совместном применении бинарныхсоединенииАз337,Аз504,А8б32 (типМГА)иAS643,AS645 (тип МП) в соотношениях - 1:1; 5:1; 10:1 (МГА:МП). Обнаружен синергизм анти-ВИЧ действия препаратов As337 и As504 с бинарным соединением As641, содержащим пептид Р5 - имитатор N-концевого фрагмента корецептора ВИЧ CCR5, в соотношении 1:1 и аддитивность их совместного действия в соотношении 10:1.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 5 опубликованных статей, были представлены и обсуждены на следующих конференциях и семинарах: II научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); международных семинарах «New Technologies in Medicine and Ecology, Integrative Medicine» (Высокие Татры, Словакия, 2002; 2003); международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002); I международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Крым, Украина, 2002); X международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Феодосия, Крым, Украина, 2002); конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Крым, Украина, 2003); XTVнаучной конференции - конкурсе молодыхученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, 2003).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах, состоит из Введения, Обзоралитературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения полученных результатов, Заключения, Выводов, Приложения 1 и Списка литературы, представленного 296 работами отечественных и зарубежных авторов. Основная часть работы изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 12 таблиц.
Взаимодействие ВИЧ-1 с рецепторами клеточной мембраны
Проникновение вируса иммунодефицита человека в пермиссивные клетки начинается с адсорбции вириона на клетки-мишени путем связывания белка оболочки gpI20 ВИЧ-1 с отрицательно заряженными молекулами клеточной мембраны (гепарин- сульфат) и далее с клеточным рецептором CD-4. Это взаимодействие является пусковым механизмом для всего последующего цикла репродукции вируса. Однако долго оставался без ответа вопрос - почему большинство животных не чувствительны к этому вирусу, хотя имеют клетки с рецепторами CD4. В 1996 году несколько независимых групп исследователей показали, что в процессе проникновения вируса участвуют хемокиновые рецепторы CCR5 и CxCR4 [Alkhatib et al, 1996; Choe H. et al., 1997; Deng et aL, 1996; Doms & Peiper, 1997; Doranz et al., 1996; Dragic et al., 1996; Feng et al., 1996]. Некоторые другие хемокиновые рецепторы также могут способствовать проникновению ВИЧ-1/2 в клетки, но делают это менее эффективно и, в конечном счете, их роль в патогенезе инфекции существенно меньше [Berger et al., 1999; Bjomdal et al., 1997; Ross & Cullen, 1998; Zhang etal., 1998]. Процесс проникновения вируса иммунодефицита человека в пермиссивные клетки с участием комплекса вирусных белков gp41 и gpl20, клеточного рецептора CD4 и одного из корецепторов ВИЧ (рассмотрим процесс на примере CCR5) схематически можно представить как цепь последовательных событий (см. рис. 1.1. и 1.2.). 1. Взаимодействие растворимой единицы гликопротеина вируса gp 120 (области VI/V2 и V3 петля, вместе образующие "карман") с константным доменом клеточного рецептора CD4 [Kwong et al., 1998; Wyatt et al., 1998].
Это взаимодействие сопровождается также неспецифическими взаимодействиями между белками и другими молекулами клеточной поверхности, как, например, гепарин сульфат, протеогликаны, галактозилированные керамиды, рецепторы маниозы и адгезивные молекулы [Ugolini, 1999] или гликосфинголипиды, которые рассматриваются как возможные «платформы - перевозчики» (raft domens) вириона по внешней поверхности плазматической мембраны [Fantini et al., 2000]. 2. Связывание вириона с CD4 индуцирует конформационные перестройки V1/V2, V3 петель gpl20 и ориентации N, С концов гликопротеина gpl20 ВИЧ в направлении мембраны пермиссивной клетки [Sattentau et al., 1993; Sullivan et al., 1993]. Пространственная трансформация молекулы gpl20 открывает доступ сайтов связывания ко второму клеточному рецептору - CCR5 [Rizzuto et al., 1998; Salzwedel et al., 2000; Sullivan et al., 1998]. 3. Взаимодействие комплекса gpl20-CD4 с молекулой CCR5 на поверхности клеточной мембраны. Возможно и взаимодействие между участками клеточного рецептора CD4 и корецептора CCR5. [Dragic, 2001; Kwong et al., 1998; Xiao et al., 1999]. 4. Перестройка третичной структуры гликопротеина gpl20 за счет образовавшегося комплекса CD4-gpl20-CCR5 и дестабилизация ассоциации вирусных гликопротеинов gpl20-gp41 [Moore et al., 1993]. 5. Диссоциация комплекса gpl20-CD4 и обнажение структуры внешнего домена трансмембранного гликопротеина ВИЧ gp41. 6. Конформационная перестройка внешнего домена gp41, в частности нарушение взаимодействия между гидрофобными участками эктодомена - N-спиралью (HR-1 участок) и С-спиралью (HR-2 последовательность), что ведет к формированию интермедиата, содержащего пептид слияния на своем конце, обращенном в сторону клетки-мишени. 7. Пептид слияния внедряется вглубь клеточной мембраны и инициирует процесс фузии [Bieniasz et al., 1997; Chan et al., 1997; Root et al., 2001; Wyatt et al., 1998]. 8. Далее gp41, представляющий собой тример, сворачивается и формирует «шпильку», сближая спирально скрученные HR-1 и HR-2 гидрофобные участки молекул белка. Это приводит к близкому расположению вирусной и клеточной мембраны, позволяя им слиться, а вирусному содержимому проникнуть внутрь клетки [Chan et al., 1997; Rootetal., 2001J.
Наглядно процесе формирования «шпильки» белком gp41 и слияния липидных мембран вируса и клетки можно представить согласно рис. 1.2. В процессе инфицирования клетки белок ВИЧ gp41 обеспечивает не только слияние вирусной мембраны с мембраной клетки, но также определяет слияние мембран соседних инфицированных клеток с образованием одной многоядерной синцитиальной клетки (синцитий), обреченной на гибель. Установлено, что продолжительность жизни синцитиальных клеток не превышает 3-7 дней, а вирулентность ВИЧ коррелирует с возможностью образовывать синцитий [Змушко Е.И. и Белозеров Е.С., 2000].
Анти-ВИЧ соединения, действующие на стадии проникновения вируса в клетку
Как вытекает из изложенных выше современных представлений о молекулярных механизмах CCR5- и CxCR4-onocpenoBaHHoro ВИЧ-инфицирования, центральными молекулярными мишенями препаратов, блокирующих проникновение вируса в пермиссивные клетки, оказываются сами корецепторы CCR5 и CxCR4, клеточный рецептор CD4, вирусные белки gpI20 и gp41, а также иные молекулярные объекты, вовлекаемые в данный процесс. Весьма перспективной выглядит идея регулирования биосинтеза и экспрессии рецептора CCR5 и, возможно CxCR4, как с помощью факторов естественной эндогенной модуляции экспрессии, так и на генетическом уровне.
Рассмотрим наиболее яркие примеры, подразделяя ВИЧ-ингибиторы по их специфичности к молекулярным мишеням (gpl20, gp4l, CD4, CCR5, CxCR4) и располагая их в порядке очередности, согласно принятой схеме поэтапного взаимодействия поверхностных белков ВИЧ-1/2 с рецепторами клеток-мишеней в организме человека.
Первым вектором ориентации вириона в сторону клеток является электростатическое притяжение. Поверхность клеток имеет избыточный отрицательный заряд, а вирионы, как частицы ориентированные на атаку клеток, обычно несут противоположный (положительный) заряд. Так, на внешней поверхности клеточных мембран животных и человека широко представлены отрицательно заряженные молекулы гепарин сульфата, во многом определяющие адгезивную активность клеток и их неспецифическое связывание с оболочечными вирусами, предшествующее вирус-специфическим взаимодействиям клеточных рецепторов [De Clercq, 2002а]. Еще более высокую плотность отрицательного заряда имеют внешние N-концевые участки клеточных рецепторов CCR5 и CxCR4, выполняющих важные корецепторные функции связывания gpl20. Указанные молекулярные фрагменты корецепторов ВИЧ характеризуются повышенной плотностью анионогенных аминокислот (Asp, Glu, Туг и, особенно Туг-ЭОз )- Сайтом повышенной плотности противоположного (положительного) заряда вирионов ВИЧ является V3 петля гликопротеина gpl20, имеющая избыточное содержание основных (катионогенных) аминокислот аргинина и лизина [De Clercq, 2002а]. Не случайно уже в ранних работах по изысканию ингибиторов ВИЧ инфекции были выявлены активные соединения анионогенного типа (в частности сульфатированные полисахариды), имитирующие градиент отрицательного заряда клеточной поверхности. При этом переориентация вирионов на взаимодействие с такими соединениями за счет электростатического притяжения сайта V3 gp!20 препятствует адсорбции вириона на поверхности клетки [Batinic et al., 1992].
Очевидно, что блокировать взаимодействие вириона с клеточным рецептором CD4 можно либо агентами, нацеленными на вирусный белок gp!20, либо препаратами, имеющими своей мишенью сайты рецептора CD4, отвечающие за связывание с gpl20.
На сегодняшний день известен весьма широкий спектр анти-ВИЧ активных соединений, самой разнообразной химической природы (пептиды, белки, полисахариды, полинуклеииовые кислоты, синтетические полимеры, неорганические поликислоты), молекулярная структура которых обретает желаемую функциональную активность (против gpl20) при обеспечении главного фармакофорного вектора - отрицательно заряженных функциональных групп (карбокси-, фосфорно-, сульфокислоти ых и т.п.). В частности, продемонстрирована анти-ВИЧ активность гомопептида, состоящего из сульфотирозинов [Ueki et al., 2001]. Высокополимерные полианионные соединения, такие как пептидогликаны, декстраны и полисахариды, проявляют значительную анти-ВИЧ активность, являются малотоксичными и могут обладать свойствами адсорбции вирусных частиц. Последнее подтверждено, например, на полисахариде из Rizophora mucronata Роіг (RMP). Этот полисахарид ингибирует ранние стадии жизненного цикла вируса, особенно вирусную адсорбцию на клетки и формирование синцитиев [Premanathan et al., 1999]. Сообщение об анти-ВИЧ активности синтетических сульфатированиых полисахаридов дало толчок к довольно широкому изучению различных сульфатированных природных полисахаридов как потенциальных противовирусных препаратов [De Clercq, 1986]. Были изучены декстрансульфат, сульфатированные олигоксиланы, а также сульфатированные хитин и хитозан. Установлено, что в случае хитина для проявления анти-ВИЧ активности важно сульфатирование по положению 0-2 и/или 0-3. Синтезирован полимерный продукт, аналог хитина, ингибирующий взаимодействие вируса и Т-лимфоцитов за счет блокирования gpl20 [Nishimura et al., 1998]. Более 10 лет назад в качестве антитромботических средств, успешно заменяющих гепарин, были разработаны сульфатированные ксиланы, которые представляют собой смесь модифицированных олигосахаридов с молекулярной массой от 1,5 до 22 kDa. Некоторые из них проявили анти-ВИЧ-1 активность (ингибирование образования синтициев), при том наибольшей активностью обладали олигосахариды с молекулярной массой 4,5 Ша [Larack-Stone et al., 1988].
Иммуноферментный анализ ингибирования накопления вирусного АГр24 в культуре клеток,
Для количественного определения антигена р24 ВИЧ-1 использовали высокоспецифичную иммуноферментную тест-систему «ВектоВИЧ-1 р24-антиген» производства "Вектор-Бест" (Россия). Тест система работает по принципу твердофазного непрямого иммуноферментного анализа. Чувствительность анализа к специфичному белку р24 ВИЧ-1 - 20 пг/мл. Тестирование проводили в соответствии с инструкцией к тест-системе. Во все лунки вносили по 50 мкл раствора для разведения образцов и по 150 мкл исследуемых проб. Перед проведением анализа в дополнительном планшете готовили разведения образцов (ВИЧ-инфицированные клети линии МТ-4, обработанные различными дозами исследуемых препаратов) на Іхфосфатно-солевом буфере. В качестве рабочих образцов использовали разведения в 1000-100000 раз от исходных (получали их путем 10хкратных разведений). Дія количественной оценки результатов включали в каждый планшет ряд разведений стандартного положительного образца (К ст.), с известным содержанием р24 антигена ВИЧ-1. Стрипы закрывали липкой плёнкой, помещали на шейкер (600 обУмин) и инкубировали при температуре 37,0±0,5С в течение 60±3 мин. После окончания инкубации стрипы 5 раз промывали раствором ФСБ-Т. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора конъюгата. Стрипы закрывали липкой плёнкой и помешали на шейкер (600 обУмин). Инкубировали при температуре 37,0±0,5С в течение 60±3 мин. За 5-10 мин до окончания инкубации готовили раствор ТМБ согласно инструкции к тест-системе.
По окончании инкубации стрипы промывали раствором ФСБ-Т. Вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора ТМБ и инкубировали в темноте в течение 25 мин при 18-25С. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 100 мкл стоп-реагента (1М серная кислота). Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра "Labsystems Multiskan PLUS" (Финляндия), измеряя оптическую плотность (ОП) на длине волны 450 нм. Количество антигена р24 в пробах определяли по калибровочной кривой, построенной по данным ОП ряда разведений стандартного положительного образца с известной концентрацией антигена, 2.2.6. Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ "ELISA" и "LAV", созданными В.В. Неклюдовым (ГНЦ ВБ "Вектор") на базе прикладного пакета "MatLab 6.5" (The Math Works, Inc.). Программа "ELISA" позволяет обрабатывать данные ИФА: вычислять средние геометрические значения количества антигена р24 ВИЧ-1 в образцах (Р), находить величины отклонений каждого измерения от среднего геометрического значения, определять значение ошибки средней величины, строить графики зависимостей (доза-эффект), по их линейным участкам вычислять эффективные концентрации ICso» ICgo и их погрешности [Ашмарин И.П. и Воробьев А..А., 1962; Неклюдов В.В., 2003]. Программа "LAV" позволяет обсчитывать данные вирусологических тестов: вычислять средние арифметические значения количества жизнеспособных клеток (V), находить величины отклонений каждого измерения от среднего арифметического значения, определять значение ошибки средней величины, строить графики зависимостей (доза-эффект), по их линейным участкам вычислять эффективные концентрации ЕС50, ЕСчо и находить их погрешности [Ашмарин И.П. и Воробьев А.А., 1962].
При вычислениях учитывалась ошибка воспроизводимости, оцененная по трем независимым постановкам эксперимента. Для каждого значения концентрации препарата в эксперименте было проведено одновременно три различных измерения, нормальность распределения проверялась по критерию Шапиро-Уилка в программе "OriginPro 7.5" (OriginLab Corp.). Сопоставление эффективности препаратов проводилось путем сравнения эффективных концентраций препаратов (ЕС$о, ЕС90 ICj0, IC90) и эффектов при фиксированной концентрации препаратов методом оценки существенности различий [Ашмарин И.П. и Воробьев А.А., 1962] и методом Стьюдента-Фишера в программе "Excel 9.0" (Microsoft Inc.). В целях создания высокоэффективных анти-ВИЧ препаратов принципиально нового типа сосредоточим наше внимание на двух ключевых моментах: о вмешательство в инфекционный процесс на самых ранних этапах проникновения вируса в клетку; о разработка препаратов, способных блокировать несколько молекулярных мишеней в цепи жизненного цикла ВИЧ. Последнее позволит приблизиться к решению проблемы возникновения мутантов, резистентных к терапевтическим агентам. В работе представлены результаты изучения противовирусной активности ряда полимерных соединений, у которых неспецифическая противовирусная активность анионогешюго полимера [Сербии А.В. и соавт., 1988] сочетается с избирательным действием низкомолекулярных гидрофобных агентов карбоциклического строения и/или пептидных имитаторов корецепторов ВИЧ [Тимофеев Д.И. и соавт., 2003b; Тимофеев И.В. и соавт., 2002]. Мишенями данных модификаторов являются объекты, задействованные в стартовых событиях вирусной агрессии, а именно белки оболочки вируса gp41 и gpl20 [Сербии А.В. и соавт., 2002]. В качестве базового компонента соединений (полианионной матрицы) были использованы карбоксикислотные полимеры различного типа и строения. Конформационнуїо подвижность разрабатываемых соединений обеспечили за счет введения аминотерминальных «спейсеров» - метиленовых групп различной длины, связывающих полианионную матрицу и активные низкомолекулярные группировки.
Определение фазы жизненного цикла ВИЧ, на котором исследуемые соединения проявляют ингибиругощее действие
Для подтверждения теоретических предпосылок об активности соединений изучаемого класса на этапе проникновения вируса в клетку были выполнены сравнительные эксперименты, где соединения добавляли в культуру МТ-4: 1. за 1 час до инфицирования клеток вирусом; 2. одновременно с внесением вируса; 3. через 1 час после инфицирования клеток вирусом. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 -го часа после инфицирования культуры, затем несвязавшийся вирус отмывали и вновь вносили препараты (в 1 и 2 случае), как описано в разделе Методы. Таким образом, препарат присутствовал в культуре клеток в течение всей инкубации. Результаты экспериментов представлены на рисунке 3.2. и в таблице 3.2. на примере соединений As470 (полианионная матрица типа 1с, которая является базовым компонентом большинства сконструированных и исследованных комплексных соединений) и As504 (полианионная матрица As470, модифицированная норборненом). При внесении соединения As470 в культуру клеток после адсорбции вируса (через 1 час после инфицирования), 50% уровень защиты клеток от гибели (ЕС50) достигается только при концентрации 500 мкг/мл.
Тогда как при добавлении препарата за 1 час до адсорбции или одновременно с вирусом наблюдаем уровень защиты ЕС50 уже при 100 мкг/мл. Очевидно, что противовирусная эффективность полианионной матрицы As470 проявляется на начальных этапах ВИЧ-инфицирования клеток (адсорбции и проникновения в клетку), что согласуется с ранее опубликованными данными о ВИЧ-ингибирующей активности многих полианионных соединений на этапах адсорбции и фузии вируса [De Clercq, 2002а; Harrison et al., 2003]. Из рисунка 3.2. видно, что данное соединение более эффективно при внесении его в клеточную культуру непосредственно перед заражением. Дополнительно этот вывод подтверждают результаты экспериментов, проведенных с соединением As504 (поликарбоксилат типа 1с с включенным в состав норборненом), таблица 3.2. Так, As504, при внесении его в клеточную культуру одновременно с вирусом, проявляет анти-ВИЧ активность (IC50 и ЕС50) в 1,5-3 раза большую, чем при проведении часовой предобработки клеток препаратом, и на два порядка большую, чем при внесении соединения после адсорбции вируса. Возможно, причина несколько меньшей защиты клеток от инфицирования при предварительной обработке их препаратами в образовании малоактивного комплекса с каким-либо субстратом. Как можно видеть из полученных данных, модификация исходной полимерной матрицы гидрофобным агентом (норборненом) приводит к резкому усилению ВИЧ-ингибирующей активности. Так, в случае внесения препарата одновременно с вирусом активность As504 более, чем в 100 раз, превосходит активность As470 (сравнение по ЕСзо)- Кроме того, показано, что предобработка клеток или интактного вируса препаратом в течение 1 часа не приводит к увеличению анти-ВИЧ активности.
Это говорит о доступности мишени для атаки именно во время проникновения вируса в клетку. Таким образом, очевидно, что противовирусная активность исследуемых соединений проявляется на этапе инфицирования клеток ВИЧ (стадия адсорбции и проникновения вируса в клетку). Для выявления зависимости анти-ВИЧ активности от структурных параметров базовых соединений исследована сравнительная противовирусная активность полимерных карбоксикислотных матриц различного типа и строения {рис., 3.3., табл.3.3.): I тип - синтетические полимерные карбоновые кислоты с регулярно чередующимися фурановыми циклами (подобными структурным фрагментам фурановых полисахаридов, а также фрагментам ДНК и РНК макромолекул). По химической природе матрицы I типа относятся к синтетическим сополимерам малеиновой кислоты, трансформирующейся в 2,3-полимерсвязанные остатки янтарной кислоты. lb: As282 - синтетическая поликарбоксилатная. матрица: без дополнительных карбоксильных групп на фурановом кольце и без дополнительных метиленовых мостиков; la: As386 - изомерный аналог соединения As282 (с асимметрично включенными фурановыми кольцами); Сравнительный анализ противовирусной активности этих образцов в отношении штаммов ВИЧ-І (Z и Evk) на клетках линии МТ-4 показал преимущество полимерного соединения As282 и его аналогов, по сравнению с конформационно более подвижным поликарбоксилатом As470. Как видно из результатов представленных в таблице 3.3., для подавления репродукции ВИЧ-1 (штамм ВИЧ-IEVK) на 50% требуются сравнительно невысокие 2,5-6,5 мкг/мл концентрации жестко каркасных матриц типа 1а и lb (As282, As386), в то время как соединение As470 (тип Іс) в несколько раз менее эффективно. Соединение As485 на полисахаридной основе (II тип) не оказывает значимого воздействия на репродукцию ВИЧ-1 во всем диапазоне исследованных концентраций (0,1-100 мкг/мл). Результаты экспериментов на штамме ВИЧ-lz аналогичны данным, приведенным для штамма ВИЧ-1 Evk, и подтверждают выявленные преимущества соединений As282 и As386 относительно более гибкого полимера As470, который проявил уровень зашиты клеток от гибели ЕСзо 40 мкг/мл ( 1700 нМ). Представлялось интересным проследить возможные изменения ВИЧ-ингибирующей активности базовых соединений 1-го и П-го типа при модификации их гидрофобными агентами. Эти исследования были проведены с адамантан-модифицированными соединениями. Результаты анализа представлены на рисунке 3.4., в таблице 3.4. и в таблице 1 приложения 1. Как видно из полученных данных, модификация базовых соединений адамантаном привела к резкому увеличению противовирусной активности препаратов. Самый показательный тому пример - соединение As488 (производное карбоксиметилированного декстрана). Так, если исходная матрица As485 не проявляет значимой анти-ВИЧ активности минимум до 100 мкг/мл, то As488 действует в отношении штамма ВИЧ-lEvk на уровне близком к уровню действия препарата As347 на базе высокоактивной жесткокаркасной матрицы As282. Однако в отношении штамма ВИЧ-IZ As488 проявил активность на порядок меньшую, чем все прочие соединения (см. рис. 3.4.). Возможно, это отражает межштаммовые различия в структуре поверхностных белков ВИЧ-1.
