Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблемы оценки потенциальной генетической опасности химических соединений для человека
1.1.История вопроса 13
1.2. Особенности действия химических генотоксикантов 15
1.2.2. Отдаленность последствий 15
1.2.1. Необратимость мутаций 16
1.2.3. Одноударность действия. Зависимость доза-эффект 16
1.2.4 Статистический характер действия 18
1.3.1 Іеобходимость тестирования большого числа химических
соединений 19
1.4. Организация процедуры тестирования 21
1.4.1.Тест-системы и их классификация 21
1.4.2. «Золотой стандарт» в генетической токсикологии 22
1.4.3. Два основных направления в генетической токсикологии 22
1.4.4. Априорный отбор химических соединений для тестирования 23
1.4.5. Этапность тестирования 23
1.5. Проблемы гармонизации тест-систем и процедур тестирования 27
1.6.Прогностическая значимость результатов тестирования 29
1.6.1 Проблема ложных позитивных и негативных результатов 29
1.6.2. Чувствительность и специфичность тест-систем 29
1.6.3. Негативный и позитивный отбор 30
1.6.4. Прогностическая значимость тест-системы 31
1.6.5. Батареи тестов 32
1.7. Исследование связи между структурой и активностью 33
1.8. Ранжирование химических соединений по степени генетической опасности для человека 34
1.9.3аключение 36
Глава 2. Развитие и апробация методов регистрации мутагенной активности химических соединений с помощью бактериальных тест-систем
2.1 .Тест Эймса Salmonella/микросомы 38
2.1.1.Апробация тест-штаммов Salmonella 43
2.1.2.Развитие протокола теста Эймса 46
2.1.2.1 .Индукторы ферментов микросом 47
2.1.2.2.Концентрация S-9 50
2.1.2.3.Кофакторы ферментов S-9 52
2.1.2.4.Применение прединкубации 53
2.1.2.5,Организация контролей 55
2.1.3.Воспроизводимость результатов теста Эймса 59
2.1.4. Проблема регистрации значимого мутагенного эффекта 60 .
2.1.5.Итоги 64
2.2.кес-тест 67
2.3.Тест на индукцию SOS-ответа (SOS-хромотест) 72
2.4. Краткое заключение 76
Глава 3. Исследование мутагенной активности химических факторов окружающей среды
3.1.Первичная оценка мутагенности фармакологически активных соединений с помощью теста Salmonella/микросомы 80
3.1.1.Итоги 89
3.2. Углубленное исследование особенностей мутагенной активности биологически активных соедиііений 90
3.2.1.Диоксидин
3.2.1.1 .Особенности мутагенного действия диоксидина на бактерии 91
3.2.1.2. ДНК-повреждающее действие диоксидина in vivo 94
3.2.2. Бромид этидия
3.2.2.1.Особенности метаболической активации в тесте Эймса 97
3.2.2.2.Специфичность мутагенного действия 101
3.2.2.3. ДНК-повреждающая активность в культуре клеток 103
3.2.2.4.Роль алкильной группы бромида этидия в его мутагенной а к г ивности *. 104
3.2.3. ДДЦТДП
3.2.3.1. Мутагенная активность на тест-штаммах Salmonella typhimurium 106
3.2.3.2. ДНК-повреждающая активность в культуре клеток in vitro 109
3.2.4. Итоги 113
3.3. Изучение суммарной мутагенной активности сложных смесей
3.3.1 .Исследование сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината ЦБК) 115
3.4.Краткое заключение 120
Глава 4. Количественная оценка эффективности тестирования и потенциальной генетической опасности химических соединений .
4.1.Ретроспективный анализ и оценка апостериорной вероятности в Бейсовском приближении 123
4.2. Батарея тестов и неоднозначность получаемых в ходе тестирования результатов 125
4.3.Определение апостериорной вероятности при использовании батареи тестов 128
4.4. Оценка получаемой в ходе тестирования информации 129
4.5. Замечания о величине априорной вероятности наличия или отсутствия мутагенных свойств 131
4.6. Оценка эффективности тест-систем и их батарей
4.6.1 Характеристика выборки 133
4.6.2. Бейсовское приближение 137
4.6.2.1. Учет неопределенных результатов 137
4.6.2.2. Одиночные тесты 139
4.6.2.2.1.Основные характеристики одиночных тестов 139
4.6.2.2.2. Оценка полученной информации 110
4.6.2.2.3. Оценка средней информации в одиночных тестах 143
4.6.2.3. Эффективность батарей тестов
4.6.2.3.1.Распределение химических соединений по результатам испытаний при использовании батарей из двух тестов 179
4.6.2.3.2.Средняя информация 149
4.6.3. Использование дискриминантного анализа для классификации химических соединений 154
4.6.3.1. Оценка апостериорной вероятности с помощью дискриминантного анализа 154
4.6.3.2. Использование правдоподобных оценок отсутствующих результатов при работе с неполными матрицами 156
4.6.3.3. Результаты оценки эффективности тестов и их батарей 158
4.7,Оценка потенциальной мутагенной опасности химических соединений 163
4.7.1. Определение потенциальной генетической опасности в генетической токсикологии. Вес (уровень) доказанности 163
4.7.2.Математическое определение функции уровня доказанности 165
4.7.3. Классификация химических соединений по степени их потенциальной мутагенной опасности 171
4.7.4. Значения уровня доказанности для анализируемой выборки химических соединений 174
4.8. Краткое заключение 177
Глава 5. Изучение взаимосвязи между мутагенной активностью и структурой химического соединения
5.1.Качественный экспериментальный анализ 179
5.1.1.Взаимосвязь структура-активность в ряду производных бифенила 179
5.1.1.1.Роль нитрогрупгты в пара-позициях ароматических колец 180
5.1.1.2.Факторы, влияющие на мутагенную активность нитрозамещенных бифенилов 183
5.1.2.Взаимосвязь структура-активность ряду производных флуоренона и фенантренхинона 185
5.1.2.1. Тип мутаций, индуцируемых производными флуоренона и фенантренхинона 186
5.1.2.2.0собенности мутагенеза, индуцированного иитрофлуоренонами и фенантренхинонами, в штаммах S.typhmiurium типа +1 и-1 фреймшифт 188
5.1.2.3. Роль «классической» нитроредуктазы в метаболической активации 191
5.1.2.4. Влияние плазмиды рКМІОІ на мутагенную активность производных флуоренона и фенантренхинона 195
5.1.3.Взаимосвязь структура-активность в молекулах производных пирена и его гетероциклических аналогов 196
5.1.3.1.Резонансный и индукционный эффект в молекуле производных нитропирена 197
5.1.3.2. Влияние нитрогруппы в пара-положении на мутагенную активность гетероциклических аналогов пирена 201
5.1.3.3.Вклад «классической» нитроредуктазы в мутагешгую активность гетероциклических аналогов пирена 204
5.1.3.4. Эффект плазмидных генов mucAB 206
5.1.4. Закономерности влияния структурных особенностей ароматических соединений на их мутагенную активность
5.1.4.1. Влияние заместителей в пара-положении и резонансно-индукционный эффект 207
5.1.4.2. Влияние классической нитроредуктазы на метаболическую активацию нитро-ПАС 287
5.1.4.3.Влияние на мутагенную активность плазмидных генов пшсАВ 210
5.1.4.4. Связь между мутагенной активностью и планарностью молекул 212
5.1.5. Итоги анализа 214
5.2. Количественный статистический анализ 215
5.2.1. Модели на основе линейного регрессионного анализа 219
5.2.1.1 Замещенные бифенилы 219
5.2.1.2. Гетероциклические аналоги пирена ифенантрена 223
5.2.1.3. Объединенная выборка 225
5.2.2.Модели на основе методологии нейронных сетей 226
5.2.2.1. Гетероциклические аналоги пирена и производные фенантрена 227
5.2.2.2. Объединенная выборка 230
5.2.3.Модели на основе дескрипторов, отобранных путем экспертного анализа 231
5.2.4.3амечания об особенностях QSAR в анализе мутагенности и канцерогенности 238
5.2.4.1. Размер и однородность базы данных 239
5.2.4.2. Отбор дескрипторов 239
5.2.4.3. Экспертиза баз данных и выработки алгоритма QSAR-анализа 241
5.2.4.4. Метод QSAR в системе оценки мутагенности 244
5.2.5. Итоги анализа 246
Заключение 248
Список литературы 256
Приложения
- Априорный отбор химических соединений для тестирования
- Проблема регистрации значимого мутагенного эффекта
- Углубленное исследование особенностей мутагенной активности биологически активных соедиііений
- Использование правдоподобных оценок отсутствующих результатов при работе с неполными матрицами
Введение к работе
Среди комплекса проблем, связанных загрязнением окружающей среды,
одной из актуальных и вместе с тем наименее разработанной является
проблема оценки потенциальной генетической опасности химических
соединений. Возникшие мутации могут привести к увеличению наследуемых
генетических патологий и лежать в основе злокачественных
новообразований и других соматических патологий, в частности, многочисленных заболеваний, связанных с нарушениями обмена веществ.
Сам факт, что химические соединения - загрязнители окружающей среды, также как и ионизирующая радиация, представляют реальную генетическую опасность для человека был осознан немногим более 30 лет тому назад вначале научным, а вслед за этим и всем обществом. В результате возникло новое направление в генетике - генетическая токсикология, основной задачей которой является создание методологии для классификации химических соединений по степени их потенциальной генетической опасности для человека, с целью осуществления различных регулирующих действий, направленных на предотвращение или уменьшение возможных генетических последствий воздействия химических соединений.
Вторая проблема генетической токсикологии связана с необходимостью постоянного тестирования большого числа химических соединений. В настоящее время число зарегистрированных в международном регистре (CAS - Chemical Abstract Service, ) соединений составляет более 19 миллионов химических веществ. Это число увеличивается каждый день примерно на тысячу соединений. Понятно, что большая часть вновь синтезируемых соединений не попадает в среду в качестве реальных загрязнителей, однако, число «новых» загрязнителей среды также оказывается достаточно велико и составляет величину порядка 3500 в год, то есть примерно 10 соединений в день. Это обусловливает необходимость создания достаточно оперативной и экономичной системы тестирования
химических соединений в отношении их потенциальной генетической опасности для человека.
Невозможность экспериментального исследования генетической активности химических соединений у человека обусловила создание и использование для этих целей различных тест систем. Поэтому результаты, получаемые при использовании тест-систем, представляют интерес не сами по себе, а лишь их прогностическая эффективность в отношении генетических последствий воздействия на человека исследуемых соединений.
'За время существования генетической токсикологии созданы сотни тест-систем, однако немногие из них в результате длительных валидных исследований включены в национальные системы оценки потенциальной мутагенной или канцерогенной опасности химических соединений. Процесс валидизации теста, включающий в себя развитие протокола его использования, расширение баз данных, содержащих результаты использования теста для изучения мутагенной активности широкого спектра веществ, и оценку прогностической значимости этих результатов для разных классов химических соединений, был и остается одной из основных задач, стоящих перед генетической токсикологией.
На первом этапе развития генетической токсикологии основное внимание уделялось исследованиям краткосрочных и экономичных тест-систем in vitro, главным образом, бактериальных. В процессе развития генетической токсикологии было показано, что мутационный процесс, индуцированный химическими соединениями, в значительно большей степени, чем в случае ионизирующего излучения, зависит от особенностей метаболизма в клетках-мишенях и распределения соединения и их метаболитов по органам и тканям многоклеточного организма. Это определяет относительно низкую прогностическую эффективность тест-систем in vitro и обуславливает необходимость комплексного подхода при оценке потенциальной генетической опасности химических соединений. В результате возникает
необходимость использования батарей тестов, а также наряду с биотестированием, применение внеэскпериментальных методов, основанных на анализе связи между структурой и мутагенной активностью химических веществ. Все это в свою очередь определяет необходимость введения единого количественного критерия для оценки эффективности исследований потенциальной генетической опасности химических соединений и определения степени этой опасности по результатам тестирования для человека.
Цели и задачи работы. Цель работы состояла в разработке формализованной количественной системы оценки эффективности анализа мутагенной активности химических соединений, включая биотестирование и исследование связи между структурой и активностью, и достигаемого в ходе испытаний уровня доказанности генетической опасности. Для достижения цели работы решались следующие задачи :
I.Проведение валидных исследований бактериальных тест-систем, направленных на увеличение их прогностической эффективности, включая усовершенствование протокола тестирования химических соединений на мутагенную активность и разработку критериев оценки полученных результатов.
2.Расширение базы данных по мутагенной активности лекарственных препаратов путем оценки их активности в тесте Эймса и исследование потенциальной мутагешюи опасности сложных смесей на примере промышленных стоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината.
3.Углубленные исследования особенностей мутагенного действия препаратов, широко используемых в медицине и в практике научно-исследовательских работ.
4. Обоснование и апробация, на примере шести широко используемых в практике биотестирования методов, селективной информации в качестве количественной меры для оценки прогностической эффективности отдельных тестов и их сочетаний.
5.Разработка системы количественной оценки потенциальной мутагенной опасности химических соединений по результатам их биотестирования.
6. Исследование связи между структурой и мутагенной активностью нитроароматических соединений с использованием экспериментальных и статистических методов анализа.
Научная новизна. Открыты новые классы химических мутагенов:
хиноксалиновые соединения, к которым относятся антибактериальные препараты диоксидин и хиноксалин, и диазапиреиы, к которым относятся ДДЦТДП и его аналоги. Исследованы механизмы мутагенного и генотоксического действия диоксидина, ДДДТДП и бромида этидия. Установлено, что генетическая активность диоксидина зависит от парциального давления кислорода и проявляет органоспецифическую генотоксичность in vivo, вызывая повреиодения ДНК в клетках легких мышей, ДДДТДП относится к бифункциональным агентам, а бромид этидия активируется цитохромом Р-448.
В работе теоретически обоснован, разработан и применён количественный критерий, позволяющий проводить оценку эффективности не только отдельных тестов, но и их батарей, - как в среднем, так и для каждого получаемого в ходе тестирования результата в отдельности. В качестве этого критерия выступает селективная информация наличия (или отсутствия) мутагенных свойств у испытуемых соединений. Для построения шкалы потенциальной мутагенной опасности испытанных химических соединений использована специально введённая функция веса (уровня) доказанности, однозначно связанная со значениями полной информации, достигаемой при проведении биотестирования.
Установлены закономерности связи между мутагенной активностью в тесте Эймса и структурными особенностями нитроароматических соединения от бифенила до полициклических соединений - пиренов и его геіероциклических аналогов. Показано, что мутагенная активность этих
соединений коррелирует с пара- положением нитрогрупп, и фрагменты структуры, способствующие планарной конформации молекулы, увеличивают ее мутагенность. Впервые показано, что увеличение числа атомов кислорода или внедрение его в молекулу в качестве гетероатома в пиреновые структуры приводит к росту мутагенных свойств соединения. Впервые на примере этих соединений для анализа связи между мутагенной активностью и химической структурой использована нейронная сеть и показано, что нейросетевые модели структура-активность обладают большей прогностической эффективностью, чем модели, основанные на множественной регрессии.
Практическая значимость. Результаты валидных исследований теста Эймса и внесенные изменения в протокол его проведения легли в основу материалов, включенных в Методические указания по использованию бактериальных тест-систем для выявления мутагенной активности химических загрязнителей сред, разработанных по заданию Секции генетических аспектов проблемы «Человек и биосфера» МНТС при ГК СМ ССС по науке и технике (1977, 1983, 1985 г.г.), а также в Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов,утвержденных МЗ СССР (1985 г.)
Результаты первичной оценки расширили базу данных по мутагенной активности лекарственных препаратов. Результаты изучения мутагенной активности диоксидина вошли в материалы о генотоксичности этого препарата, на основании которых Фармакологический комитетет СССР принял решение ограничить применение диоксидина на детях.
Результаты, полученные при 6 летнем мониторинге мутагенной активности сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината, легли в основу обоснования необходимости усиления контроля за технологическими процессами очистки сточных вод Байкальского ЦБК.
Разработанные системы количественной оценки эффективности тестирования и определения потенциальной мутагенной опасности
позволяют оптимизировать процедуру тестирования и устранить субъективизм при ее организации и классификации химических соединений по степени потенциальной мутагенной опасности.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлялись на IV Всесоюзном съезде фармакологов (Ленинград, 1976), па IV собрании Ассоциации мутагенных обществ (Гернроде, ГДР, 1976), на Ill-съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. II.И. Вавилова (Ленинград, 1977), на XIV Международном генетическом конгрессе (Берлин, 1978), на заседаниях секции «Генетические аспекты проблемы «Человек и биосфера» госкомитета по науке и технике СССР (Москва, 1975, Киев, 1977, Алма-Ата, 1978, 1989, Караганда, 1990, Ашхабад, 1982), на III конференции по теоретическим вопросам мутагенеза (Вильнюс, 1980), на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы оценки фармакологической активности химических соединений» (Ногинск, 1981), на Всесоюзном симпозиуме «Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ» (Ленинград, 1989), на Всесоюзном симпозиуме «Микробиологоя охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия» (Челябинск, 1990), на межведомственном рабочем совещании «Мутагены и канцерогены в окружающей среде: Новые подходы к оценке риска для здоровья (Санкт-Петербург, 1997), на IV-съезде ВОГИС (Санкт-Петербург, 2001), на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002), на конференции «Химический мутагенез», посвященной 90-летию со дня рождения И.А.Рапопорта (Москва, 2002) и др.
По теме диссертации опубликованы 38 статей, материалы диссертационной работы были использованы при составлений 7 Методических указаний и рекомендаций.
Априорный отбор химических соединений для тестирования
Основным критерием отбора веществ на тестирование на потенциальную генетическую активность является популяционный генетический риск. Поэтому очевидно, что основными показателями для тестирования должны быть объем производства и назначение, характеризующие в первом приближении величину поглощенной популяционной дозы человеком. В этой связи в приоритетном порядке должны испытываться 3 категории химических соединений: 1.Вещества, производимые в больших количествах (многотоннажные промышленные реагенты и пестициды); 2.Стабильные химические соединения, способные накапливаться в биосфере (хлорсодержащие ароматические соединения); 3. Вещества целевое назначение которых - это потребление человеком (лекарства, пищевые добавки, косметические средства и т.д.)
Необходимость учитывать затраты на проведение тестирования привело к развитию процедуры тестирования, состоящей из этапов, когда на начальном этапе используются оперативные и относительно "дешевые" тест-системы, и лишь в том случае, если результаты, полученные на этом этапе, свидетельствуют о наличии мутагенной активности у испытуемых соединений, процедура тестирования продолжается на следующем этапе, который включает в себя более эффективные, но и более дорогостоящие тест-системы. Как правило, базовая схема тестирования на генотоксичность включает в себя три этапа. Ее основные принципы были заложены в самом начале становления генетической токсикологии как науки (Bridges, 1974; Flamm, 1974; Бочков и др.,1975) и не претерпели изменений и сегодня. Однако, конкретные тесты в этой базовой схеме, использующиеся на каждом из ее этапов, менялись с течением времени и, более того, сама схема тестирования модифицировалась и пересматривалась по мере накопления данных (Тарасов, 1994).
Несмотря на то, что проблема оценки генетической опасности химических соединений для человека возникла более 25 лет тому назад, базовая схема тестирования включает в себя преимущественно тесты, перешедшие "по наследству" из радиационной генетики. Это относится к методам учета хромосомных аберраций и генных мутаций в системах in vitro и in vivo в клетках млекопитающих, учета СХО, учета рецессивных и доминантных летальных мутаций, соответственно, у дрозофилы и грызунов и т.д. Первым тестом, созданным специально для анализа потенциальной мутагенной, в том числе и промутагенной, активности химических соединений, явился так называемый тест Эймса Salmonella/микросомы (Ames et.al., 1973). Позже, в результате использования технологии рекомбинантной ДНК, появились бактериальный SOS-хромотест (Quillardet et.al., 1982), а также ряд трансгенных мышиных моделей (Shephard et.al., 1993; Mirsalis et.al., 1995; Ashby et.al., 1997). Последние позволяют исследовать органоспецифичность мутагенного действия химических соединений и находятся на стадии валидных исследований.
Первый этап. Наиболее экономичные и быстрые тесты, использующиеся на первом этапе процедуры биотестирования, как правило, связаны с учетом генных мутаций в клетках бактерий и цитогенетических нарушений, в основном, хромосомных аберраций и генных мутаций в клетках млекопитающих, культивируемых in vitro. В настоящее время именно этим тестам, регистрирующим прямо два основных мутагенных события (генные мутации и хромосомные аберрации), отдается предпочтение по сравнению с тестами, учитывающими генотоксические эффекты, например, сестринские хроматидные обмены (СХО), SOS- хромотест и др.
Наибольшее применение для первичной оценки потенциальной мутагенной активности химических соединений получил тест Эймса. Вместе с тем большое количество исследований было посвящено возможностям самого теста Эймса, его применению, модификациям, калибровке по отношению к другим тестам (в основном по отношению к тестам на грызунах). Все это сделало тест Эймса абсолютным лидером в изучении мутагенной активности химических загрязнений окружающей среды, как индивидуальных соединений, так и сложных смесей. Кроме того тест Эймса широко применяется для исследования зависимости мутагенной активности от химической структуры и антимутагенных факторов (Любимова и др., 1993, 1995; Воробьева и др., 1993, 1995, 1996; Воробьева, Абилев, 2002; Hir.iyamaet.al. 1986, 1988; Choi et.al., 1994;)
В том случае, если результаты, полученные на первом этапе тестирования, оказываются позитивными, то веществу присваивается статус мутагена in vitro. Решение о продолжении или прекращении тестирования принимается с учетом его целевого назначения и уровня воздействия на популяцию человека.
Второй этап. На втором этапе биотестирования учитывается способность индуцировать мутации в соматических клетках мышей или крыс. Однако в настоящее время не существует достаточно простого и экономичного теста, способного регистрировать генные мутации соматических клетках млекопитающих. Более того, хромосомные аоеррации можно надежно регистрировать только в клетках костного мозга и крови. Для клеток других органов и тканей ведутся работы по валидизации различных вариантов микроядерного теста (Сычева, Журков, 1997; Cliet et.al.,1989; Zhuikov et.al., 1996). В связи с этим, при регистрации потенциальной мутагенной активности химических соединений в клетках различных тканей грызунов в настоящее время используются косвенные методы, регистрирующие внеплановый синтез ДНК или индукцию первичных повреждений, таких как разрывы ДНК и мутационные аддукты (Абилев, Порошенко, 1986; Ashby, Beije ,1985; Working et. al.,1984; Bradley, Dysant, 1985; Scare, Schotel, 1985; Kassie et.ai., 2000).
Проблема регистрации значимого мутагенного эффекта
При тестировании химических загрязнителей на мутагенность в тесте Эймса могут иметь место три ситуации: 1) количество ревертантных колоний в опытных вариантах по всем исследованным дозам не отличается от контрольных; 2) количество колоний в опытных вариантах существенно (на порядок и более) больше, чем в контрольных, и наблюдается возрастание числа колоний с увеличением дозы вещества; 3) количество колоний в опытных вариантах больше, чем в контроле, в 1,3-2,5 раза.
Основная сложность возникает при интерпретации пограничных эффектов, т.е. в определении границы, при которой мутагенный эффект считался бы доказанным. Существует несколько подходов к оценке мутагенности в тесте Эймса. Вначале нами (Фонштейн и др., 1977) было пре;шожено считать установленным эффект в том случае, когда соотношение числа колоний-ревертантов в опытных и контрольных вариантах составляет 2,5 и более, причем слабый эффект считать при соотношении опыт/контроль от 2,5 до 10, средний-от 10 до 100 и сильный-более 100.
Наибольший вопрос вызывает критерий отсутствия мутагенной активности. Проблема достоверности различия между числом колоний-ревертантов в контрольном и опытных вариантах является проблемой статистики. В этой связи нами были апробированы несколько подходов статистической обработки результатов, полученных в тесте Эймса.
Оценка мутагенных эффектов методом попаршлх сравнений опытных и контрольных вариантов приводит к значительной зависимости результатов статистического анализа от колебаний числа колоний на каждой дозе (Fridrich et.al., 1982; Nean et., 1982). Чтобы избежать этого недостатка, Бобринев и соавт. (1983) предложили способ статистической обработки первичных данных методом множественных сравнений Шэффе. В последующем нами для снижения ложноположительных результатов было рекомендовано проводить статистическую обработку первичных данных методом множественных сравнений по Даннету ( Фонштейн и др., 1983, Лбилев и др., 1985). Этот метод оказался более эффективным и рациональным по сравнению с методом Шэффе, так как снижается частота регистрации ложноположительных результатов, поскольку вероятность ошибки первого рода (обычно принимаемая за 5%) задается для всего эксперимента, а не для каждой отдельной группы. Метод предполагает оценивание случайной дисперсии (о2) по всем исследованным дозам в вариантах с полной (ПМАС) и неполной (НМАС) системой метаболической активации для каждого штамма. Степень мутагенного эффекта определяется кратностью повышения числа колоний-ревертантов при данной дозе над таковым в контроле. При отсутствии статистически значимых различий степень мутагенного эффекта оценивается знаком «-». При наличии статистически значимых различий и превышении числа колоний при данной дозе над контролем до 10 раз мутагенный эффект оценивался как слабый, от 10 до 100 раз - средний и более чем в 100 раз - сильный.
Позже нами совместно с Журковым B.C. был проведен анализ экспериментов по оценке мутагенной активности химических загрязнителей воды. Всего поставлено 76 опытов со штаммом ТА 1535, 90-е ТА 1538, 84 - с ТА 98 и 80 - с ТА 100. При статистической обработке результатов (по Даннету) отмечено существенное колебание их дисперсии, что в значительной мере влияло на уровень значимости при разной величине превышения среднего числа колоний ревертантов в опытном варианте над контрольным. Результаты анализа распределения опытов в отношении кратности превышения среднего числа колоний ревертантов в опытном варианте над контрольным, при которой это превышение было статистически значимым представлено в таблице 2.11. Как видно, превышение числа колоний ревертантов на чашку в опыте над контролем от 1,20 до 1,39 дает 1,4% статистически значимых результатов в опытах со штаммом ТА 1535 и 2,9% в опытах со штаммом ТА 1538. Эти величины существенно не отличаются, что объясняется примерно одинаковой степенью вариабельности дисперсий опытов для этих штаммов.
Тот факт, что уже при таком незначительном превышении появляются скпистически значимые результаты, говорит о малой дисперсии результатов омыга в отдельных экспериментах. Значительно более высокий процент статистически значимых результатов при данном превышении числа колоний ревертантов в опыте над контролем отмечается у плазмидных штаммов (13,7% для ТА 98 и 17,3% для ТА 100). Это связано с тем, что дисперсия результатов опыта при работе со штаммами ТА 98 и ТА 100 существенно меньше, чем у бесплазмидных штаммов.
Если проанализировать все соотношения Хо/Хк и соответствующие им величшгы процентов статистически значимых результатов, то можно видеть увеличение процента значимых результатов с возрастанием величины cooi ношения. При соотношении 1,80-1,99 статистически значимые результаты для штамма ТА 100 появляются в 100% случаев. При соотношении 2,00-2,19 более 90% значимых результатов было в опытах с ТА 9S. Для штаммов ТА 1535 и ТА 1538 90% и более статистически значимых результатов отмечено при соотношении Хо/Хк 2,20 и более.
Приведенные данные показывают, что при статистической обработке по Даннету результатов испытаний мутагенной активности химических веществ в тесте Эймса возможен большой процент ложноположительных результатов в случаях с низкой общей дисперсией результатов опыта. Для минимизации эюго эффекта нами (Дугам и др.,1990) было предложено установить минимальную величину превышения среднего числа колоний ревертантов на чашку в опытном варианте над контрольным, при которой мутагенный эффект тестируемого вещества будет считаться доказанным независимо от величины дисперсии опыта. Граничной величиной соотношения Х0/Хк предлагается та, при которой в 90% и более вариантов отмечается скпистически значимое превышение показателя в опытном варианте над контрольным: для штаммов ТА 1535 и ТА 1538 - 2,2; для штамма ТА 98 -2,0; для штамма ТА 100 - 1,8. Предложенный подход позволяет избежать значительного числа ложных результатов, особенно в тех случаях, когда мутаген относится к группе слабых и нет выраженной зависимости эффекта от дозы. Таким образом, установлено, что в 90% и более случаях значимый мутагенный эффект достигается при превышении числа ревертантов в опыте над контролем для штаммов ТЛ 1535 и ТА 1538 в 2,2 раза, для штамма ТА 98 в 2 раза, для штамма ТА 100 в 1,8 раз.
Углубленное исследование особенностей мутагенной активности биологически активных соедиііений
Диоксидин-1,4-ди-М-окись 2,3-ди (оксиметил) хиноксалина является антимикробным препаратом широкого спектра действия. Препарат обладает высокой химиотерапевтической активностью при гнойно-воспалительных процессах: плевриты, абсцесс легкого, перитониты, циститы, раны с наличием глубоких гнойных полостей (Машковский, 2002). Мутагенная активность диоксидина, как было отмечено в предыдущей главе, была впервые обнаружена нами в ходе первичной оценки мутагенной активности различных лекарственных средств (табл.3.3).
Учитывая отсутствие данных о мутагенной активности диоксидина, а также его значение в медицинской практике, нами была проведена серия экспериментов, направленных на исследование ряда особенностей его мутагенного действия на бактерии и органоспецифичности ДНК-повреждающей активности в условиях in vivo.
Независимость от системы метаболической активации in vitro. Данные, полученные в чашечном тесте Salmonella/микросомы, показали, что мутагенный эффект диоксидина не отличается в вариантах с ПМАС и НМЛС (табл.3.3). Для подтверждения этого факта нами было проведено исследование с помощью количественного метода учета мутагенеза в условиях наличия (вариант ПМАС) и отсутствия (вариант с НМАС) метаболической активации. Для этих экспериментов использовали бактерии штамма S.typhimurium ТА 1950, которые выращивали до плотности 1x10 клеток/мл, дважды центрифугировали и суспендировали в буфере. В этих условиях обработки частота индуцированных мутаций у бактерий при концентрации диоксидина 4,5 мкг/мл в вариантах с ПМАС и НМАС составила, соответственно, 165x10 и 172x10 .
Таким образом, было количественно показано, что мутагенная активность диоксидина не зависит от функционирования системы микросомного окисления. Полученные данные согласуются с результатами экспериментов, показавших, что диоксидин выводится из организма в неизмененном виде (Рудзит и др., 1974).
Влияние фазы роста бактерий. При проведении опытов по изучению влияния системы метаболической активации было замечено, что при обработке диоксидином клеток тест-штамма в среде без S-9 мутагенная и бактерицидная активности препарата ниже, чем в опытах с S-9. Эти данные указывают на то, что наличие в инкубационной среде S-9 фракции гомогената печени крыс обеспечивает течение процессов, связанных с делением бактерий, которое является необходимым условием для проявления эффекта исследуемого препарата. В таком случае должно быть выявлено различие в бактерицидном и мутагенном действии диоксидина на бактерии, находящиеся в различных фазах роста. В этой связи были поставлены специальные эксперименты с использованием клеток тест-штамма, находящихся в растущей и стационарной стадиях роста культуры. В результате при обработке бактерий, выращенных до густоты 2x10 клеток/мл (до стационарной фазы роста), диоксидин проявил более слабую бактерицидность и мутагенность, чем при обработке бактерий растущей культуры, выращенной до плотности 1x108 клеток/мл (рис.3.1., показана мутагенная активность). Эти данные свидетельствуют о том, что бактерицидная и мутагенная активности диоксидина зависят от условий подготовки к опыту бактериальной суспензии.
Таким образом, было установлено, что мутагенная и бактерицидная активности диоксидина зависят от физиологического состояния бактерий. Влияние проницаемости бактериальной стенки. На рис.3.2 представлены результаты сравнительного изучения мутагенной активности диоксидина на трех штаммах S.typhimurium. Данные, полученные на штаммах ТА 1950 и ТА 1535, показали более высокую мутагенность диоксидина на последнем штамме с мутацией rfa, повышающей проницаемость бактериальной стенки. Таким образом, обнаружено, что уровень мутагенного эффекта диоксидина в бактериальной клетке зависит от проницаемости клеточной стенки. Зависимость диоксидин-индуцированного мутагенеза от RecA. В предварительных экспериментах было обнаружено, что мутагенная активность диоксидина при одних и тех же концентрациях на штамме G-46 ниже, чем на штамме ТА 1950. Штамм ТА 1950 отличается от G-46 наличием мутации uvrB. Дополнительные эксперименты показали, что при эквилетальных концентрациях диоксидина уровни индуцированных мутаций на этих штаммах сходны. Это привело к предположению об обусловленности мутагенного действия препарата от recA-зависимого процесса репарации. Поэтому были проведены эксперименты на изогенных штаммах E.coli К-12, отличающихся по генам uvrA и гесА. Опыты проводились в диапазонах эквилетальных концентраций для каждого штамма. При равной выживаемости у штамма дикого типа и штамма uvr А наблюдался сходный уровень индуцированных мутаций, тогда как на гее А-штамме индукции мутаций не было. Полученные результаты подтвердили наше предположение о том, что диоксидин-индуцированный мутагенез является следствием ошибочной recA-зависимой репарации. Таким образом, было установлено, что диоксидин относится к группе мутагенов, действие которых зависит от гее А-гена.
Использование правдоподобных оценок отсутствующих результатов при работе с неполными матрицами
При проведении количественных оценок основной проблемой в настоящее время является недостаточная развитость существующих баз данных. Использование Бейсовского приближения опирается на полную матрицу результатов без пропусков, которая содержит данные о мутагенной активности в половых клетках грызунов и результаты испытания в исследуемых тестах. Из таблицы 4.6 следует что, число таких соединений уменьшается по мере увеличения числа тестов, входящих в оцениваемую батарею тестов. Вместе с тем, число возможных исходов испытаний увеличивается при увеличении числа тестов в батерее. В результате для батереи состоящей из 5 тестов число возможных испытаний равно 32, если учитываются только 2 однозначных исхода испытаний. При учете, наряду с позитивными и негативными, и неоднозначных результатов число возможных исходов испытаний возрастет до 243. В этой связи возникает проблема использования неполных матриц результатов тестирования. Она может быть решена ( по-крайней мере, частично ) при использовании дискриминантного анализа.
Если результаты испытаний в каждой тест-системе, входящей в батарею, представить в форме вероятности получения позитивного результата, тогда при позитивном и негативном исходе испытаний эта вероятность оказывается равной 0 или 1, соответственно, а при отсутствии испытаний эта вероятность может быть представлена её правдоподобной оценкой.
При проведении анализа конкретной выборки возможна прямая оценка доли химических соединений показавших позитивный результат для данной тест-системы. В общем случае для выборок характеризующихся различным соотношением между мутагенами и немутагенами вероятность получения позитивного результата оказывается равной: чувствительности и специфичности данного теста. Первый член этого равенства представляет собой долю правильных позитивных результатов, 2-й член -долю ложных позитивных результатов. В таблице 1 представлены значения чувствительности, специфичности и рассчитанные на их основе/jf+J для всех анализируемых 5 тест-систем.
Приведенные выше значения р(+) использовались в качестве правдоподобных оценок отсутствующих данных. В приложении 5 представлены трансформированные таким образом данные для ро 0,5, которые служили основой для проведения дискриминантного анализа. При проведении дискриминантного анализа, как отмечалось выше, из рассмотрения был исключен тест по учету рецессивных летальных мутаций у дрозофилы. Результаты оценки эффективности тестов и их батарей. При проведении дискриминантного анализа в качестве обучающей была использована выборка химических соединений, у которых определена мутагенная активность в половых клетках грызунов и отсутствующие результаты тестирования заменены их правдоподобными значениями. В результате было получено каноническое уравнение дискриминантной функции следующего вида: и немутагенов равны 0,61 и 0,92, соответственно. Канонические значения этих координат и рассчитанные на их основе значения апостериорной вероятности для каждого соединения приведены в таблице 4.18. Тесты in vitro. Анализ результатов количественной оценки средней информации, получаемой при использовании как одиночных, так и батарей тестов in vitro показали, что эти тесты и их батареи проявили низкую эффективность при оценке потенциальной мутагенной активности химических соединений в отношении половых клеток млекопитающего. Показательно то, что батереи их 2-х тестов Эймс+ГМ и ГМ+ХА обладают такой же эффективностью, как и батарея из 3-х тестов Эймс+ГМ+ХА (1-0,06). Тесты in vitro + цитогенетика in vivo. Включение в батерею тестов in vitro метода учета цитогенетических нарушений in vivo повышает эффективность батереи. Наиболее эффективными сочетаниями оказались ГМ+ХА+Цит и Эймс+ГМ+ХЛ+Цит (1=0,21). Обращает на себя внимание тот факт, что методы учета мутаций в клетках млекопитающих (ГМ+ХА+Цит) проявляют наибольшую эффективность и включение в эту батарею теста Эймса ее не увеличивает.
Тесты in vitro + доминантные летали in vivo. Комбинации тестов in vitro и метода учета доминантных летальных мутаций у мышей оказались более эффективными, чем комбинации тестов in vitro + цитогенетика in vivo. Тест ДЛТ учитывает генетические нарушения в половых клетках самцов, приводящих впоследствии к гибели плода. Последнее может быть результатом цитогенетических нарушений. Таким образом, тест ДЛТ наиболее эффективно прогнозирует потенциальную генетическую активность в отношении половых клеток млекопитающего. Как и в предыдущем случае, результаты, полученные на клетках млекопитающих (ГМ+ХА+ДЛТ) проявили наибольшую информативность (1=0,33) и включение в эту батарею теста Эймса не привносит дополнительной информации. Батарея тестов in vitro + in vivo. Включение в батерею обоих тестов in vivo (Цит и ДЛТ) повысило информативность результатов, получаемых при использовании батареи из нескольких тестов in vitro + in vivo. Однако это повышение не является существенным по отношению к батереям тестов in vitro+ ДЛТ. Наибольшую эффективность показали батареи из 4-х тестов ГМ+ХА+Цит+ДЛТ и Эимс+ХА+Цит+ДЛТ (1=0,36). Батарея из 5 тестов Эймс+ГМ+ХА+Цит+ДЛТ (1=0,36) не имела преимущества перед батареями из 4-х тестов.
Таким образом, результаты анализа информативности тестов и их батарей по отношению к прогнозированию мутагенной активности химических соединений в половых клетках млекопитающих показали, что эффективность батареи почти не зависит от количества тестов, включенных в нее. Важны качественные характеристики тестов, например, тесты на клетках млекопитающих in vitro (ХА, ГМ), более эффективны, чем бактериальный тест Эймса. Тесты in vivo, более эффективны, чем тесты in vitro. Тест на доминантные летали более эффективен, чем тест на цитогепетические нарушения в соматических клетках. То есть эффективность тест-системы определяется близостью регистрируемых эффектов к тем генетическим нарушениям в половых клетках по отношению к которым проводится оценка.
Таким образом, показано, что тесты in vitro обладают низкой эффективностью и их комбинация в батареи не увеличивает существенно эффективность прогноза. Заметное увеличение эффективности имеет место при переходе от дешевых тестов in vitro к более дорогим и трудоемким тестам in vivo. Это относится к тестам но учету цитогенетических нарушений в соматических клетках грызунов и в большей степени к тесту учета доминантных летальных мутаций у грызунов.
