Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Возникновение генетической токсикологии, как экспериментальной науки 8
1.1.1. Предпосылки рождения и основные задачи генетической токсикологии 8
1.1.2. Влияние метаболической трансформации соединений на их активность 10
1.1.3. Методы анализа 11
1.2. Использование тест-систем для оценки потенциальной
генетической опасности химических соединений (биотестирование) 12
1.2.1. Существующие тест-системы и их классификация 12
1.2.2. Растительные тест-системы 13
1.2.3. Использование тест-системы, учитывающей соматические мутации в листьях сои при оценке потенциальной генетической опасности химических соединений 16
1.2.3.1. Характеристика теста 16
1.2.3.2. Анализ генотоксического эффекта у представителей различных классов химических соединений 18
1.2.3.3. Мутагенный эффект в листьях сои у соединений с изученной канцерогенной активностью у грызунов 24
1.2.4. Количественные характеристики тест-систем. Понятие чувствительности, специфичности и конкордантности 25
1.3. Организация процедуры биотестирования 29
1.3.1. Общие принципы 29
1.3.2. Необходимость учета затрат при проведении биотестирования ... 31
1.3.3. Этапность процедуры биотестирования 33
1.3.4. Эволюция организации биотестирования 34
1.3.5. Гармонизация процедуры тестирования 41
1.4. Анализ связи между структурой и активностью химических соединений (SAR и QSAR анализ) при оценке их потенциальной генетической опасности 42
1.5. Итоги. 44
2. Материалы и методы 46
2.1. Методика использования теста по учету соматических мутаций в листьях сои 46
2.1.1. Принцип метода 46
2.1.2. Проведение эксперимента 46
2.1.3. Учет результатов 47
2.2. Оценка значимости различий 48
2.3. Компьютерные программы, использованные в работе 48
3. Результаты собственных исследований 49
3.1. Формирование выборки для оценки эффективности тест-системы по учету соматических мутаций в листьях сои 49
3.1.1. Обоснование необходимости формирования выборки 49
3.1.2. Экспериментальная оценка мутагенной активности химических соединений 49
3.1.3. Использование компьютерных баз данных и литературных источников 52
3.1.4. Характеристика выборки 54
3.2. Количественная оценка эффективности тестирования. 56
3.2.1. Вероятностное описание эффективности тест-систем и результатов тестирования 56
3.2.1.1. Параметры, характеризующие эффективность тест-систем (чувствительность, специфичность, конкордантность) 56
3.2.1.2. Формирование батарей тестов и оценка их эффективности 59
3.2.1.2.1. Оценка взаимной статистической зависимости тестов 61
3.2.1.2.2.Кластерный анализ 62
3.2.1.3. Оценка значений апостериорной вероятности соединений в зависимости от результатов их тестирования 64
3.2.2. Информационное описание эффективности тестирования и результатов, достигаемых в ходе его проведения 67
3.2.2.1. Понятие неопределенности состояния и селективной информации об активности химических соединений 68
3.2.2.2. Использование селективной информации для оценки эффективности тест-систем и их сочетаний 68
3.2.2.2.1.Одиночные тесты 68
3.2.2.2.2.Батареи тестов 70
3.3. Уровень доказанности канцерогенной активности соединений, достигаемый при использовании теста по учету соматических мутаций в листьях сои. 72
3.4. Использование SAR - анализа при оценке потенциальной канцерогенной активности химических соединений 74
3.4.1. Создание «структурной» базы данных 76
3.4.2. Генерация дескрипторов 76
3.4.3. Идентификация структурных дескрипторов, статистически значимо влияющих на канцерогенную активность химических соединений 77
3.4.3.1. Эффективность SAR-анализа при использовании одиночных дескрипторов (качественное описание) 77
ЗА.3.2. Эффективность SAR-анализа при использовании компаундных дескрипторов (качественное описание) 79
3.5. Эффективность биотестирования и SAR-анализа при их совместном использовании 83
3.6. Использование теста по учету соматических мутаций в листьях сои при тестировании отходов промышленного производства Тырныаузского горно-обогатительного комбината. 85
4. Итоги 90
5. Выводы 92
6. Список литературы
- Влияние метаболической трансформации соединений на их активность
- Необходимость учета затрат при проведении биотестирования
- Компьютерные программы, использованные в работе
- Параметры, характеризующие эффективность тест-систем (чувствительность, специфичность, конкордантность)
Введение к работе
Актуальность темы. Оценка генетической опасности химических соединений - загрязнителей окружающей среды для человека - возникла как новое направление примерно 35 лет тому назад. За это время были созданы и введены в практику исследований более 200 тест-систем для регистрации генотоксичности химических соединений и их смесей. При этом основное внимание уделялось оценке наличия или отсутствия самого факта такого рода активности у химических соединений для млекопитающих и человека. В этих условиях при создании и отборе тест-систем основными критериями являлись экономичность и филогенетическая близость к человеку. При этом исследования проводились в лабораторных условиях, когда протокол проведения испытаний определялся соображениями простоты, надежности и прогностической эффективности получаемых результатов.
В этой связи наибольшее распространение в практике оценки генетической опасности химических соединений получили бактериальные тесты (тест Эймса) и клетки млекопитающих в системах in vivo и in vitro. Однако для целей мониторинга реального загрязнения среды потенциально опасными в генетическом отношении соединениями наиболее подходят растительные тест-системы.
Значимость использования растительных тест-систем определяется тем, что растения играют первостепенную роль в обеспечении стабильности природных экосистем. Они наиболее уязвимы, так как являются первичными звеньями природных трофических цепей и выполняют основную роль в поглощении разнообразных загрязнителей, постоянно подвергаясь их воздействию из-за прикрепленности к почве.
При использовании растительных тест-систем, как правило, учитываются хромосомные аберрации в метафазе или анафазе в меристемных клетках Crepis capillaris, Vicia faba, Allium сера, Hordeum vulgare. Для регистрации генных мутаций созданы и активно используются специальные линии Tradescantia poludosa. Однако использование этих тестов
позволяет учитывать лишь один тип мутационных событий, либо хромосомные аберрации, либо генные мутации.
Исключение, в этом плане, составляет тест по учету соматических мутаций в листьях сои Glycine max (L.) Merrill, который позволяет дифференцировано регистрировать сразу несколько генетических нарушений, а именно, прямые и обратные генные мутации, индуцированный соматический кроссинговер и нерасхождение хромосом. Это преимущество, а также оперативность и экономичность при проведении исследований, делают ее весьма перспективной при анализе генетической опасности загрязнений территорий и производств.
Основным недостатком данной тест-системы, ограничивающим ее широкое использование, является фактическое отсутствие исследований количественного определения связи между результатами тестирования и мутационной и канцерогенной активностью испытуемых соединений для млекопитающих и человека.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является оценка прогностической значимости теста по учету соматических мутаций в листьях сои Glycine max (L.) Merrill в отношении канцерогенной активности химических соединений. Для этого решаются следующие задачи:
1. Создать компьютерную базу данных, включающую в себя химические
соединения, для которых имеются экспериментальные данные в тесте по
учету соматических мутаций в листьях сои и канцерогенной активности у
грызунов, а также результаты их испытаний в исследуемых в работе тест-
системах.
2. Используя селективную информацию об активности химических
соединений в качестве количественной меры, провести оценку
эффективности теста по учету соматических мутаций в листьях сои как
отдельно, так и в составе батарей тестов, SAR-анализа, а также процедуры
оценки, включающей в себя SAR-анализ и биотестирование.
3. Использовать тест по учету соматических мутаций в листьях для оценки
потенциальной мутагенной опасности сложных смесей на примере отходов
промышленного производства Тырныаузского горно-обогатительного комбината.
Научная новизна. На примере теста по учету соматических мутаций в листьях сои впервые проведен количественный анализ эффективности использования растительных тест-систем для оценки потенциальной канцерогенной опасности химических соединений. При этом количественно охарактеризована не только эффективность использования теста на сое отдельно, но и в составе батарей тестов, а также совместно с SAR-анализом. Возможность проведения такой оценки связана с использованием в качестве количественной меры эффективности испытаний селективной информации о наличии либо отсутствии активности испытуемых соединений.
Методология и компьютерное обеспечение, позволяющее проводить такого рода оценку эффективности анализа потенциальной канцерогенной активности химических соединений разработаны в лаборатории изменчивости генома ИОГен РАН, в которой проводилась значительная часть исследований, послужившая основой данной работы.
Практическая значимость.
Результаты экспериментальных исследований расширили базу данных по мутагенной активности химических соединений (лекарственных препаратов, пестицидов и др.).
Показано, что тест по учету соматических мутаций в листьях сои может оказаться весьма перспективным при формировании эффективных батарей краткосрочных тестов для оценки потенциальной канцерогенной опасности химических соединений.
Результаты, полученные при генетическом мониторинге мутагенной активности отходов промышленного производства Тырныаузского горнообогатительного комбината, легли в основу обоснования необходимости утилизации отходов, как источника загрязнений окружающей среды и объекта генетической опасности для человека.
1. Обзор литературы
Влияние метаболической трансформации соединений на их активность
В настоящее время при оценке потенциальной мутагенной и канцерогенной активности химических соединений используются экспериментальные и внеэкспериментальные подходы. Экспериментальный подход (биотестирование) связан с использованием различных тест-систем, регистрирующих генотоксическую, включая мутагенную, активность химических соединений при оценке потенциальной генетической опасности для млекопитающих и человека. Этот подход начал развиваться и использоваться с момента рождения генетической токсикологии как науки и в настоящее время он является основным.
Второй, внеэкспериментальный подход для решения этой проблемы заключается в использовании SAR (Structure Activity Relationship) и QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) методологии, т.е. в установлении связи между структурой химических соединений и их активностью. Это направление анализа активности соединений стало использоваться в генетической токсикологии позже, начиная примерно с 80-х годов прошлого столетия, однако роль этого подхода постоянно возрастает в общей процедуре оценки генетической опасности химических соединений. В частности это связано с интенсивным внедрением компьютерных методов анализа в практику научных исследований (Benigni, Zito, 2004; Тарасов и др, 2005).
Генотоксические эффекты в широком смысле включают в себя эффекты, либо прямо связанные с мутагенностью, (генные мутации, хромосомные аберрации, анэуплоидия), либо косвенно. К числу последних относятся репарация, рекомбинация на уровне ДНК или хромосом, гибель клеток, клеточная трансформация и т.д. Иногда понятия мутагенности и генотоксичности разделяют, и в этом случае генотоксичность, в узком смысле, включает в себя лишь косвенные события, сцепленные в большей или меньшей степени с мутагенностью. Сами понятия мутагенности либо генотоксичности не являются абсолютными, а определены лишь в отношении конкретной тест-системы. Действительно, анализ характера ответов в 85 используемых при регистрации генотоксичности тест-системах показал, что лишь в 6 - 8% случаев химических веществ дают либо позитивные, либо негативные ответы во всех тест-системах и, напротив, примерно 85% их показывают ответы в одних системах и негативные в других (Mendelsohn et. al., 1992). Таким образом, мутагены (генотоксиканты) для одной системы являются лишь потенциальными мутагенами (потенциальными генотоксикантами) - для другой.
В настоящее время насчитывается несколько сотен тест-систем для экспериментальной оценки генотоксичности химических соединений, многие из которых разработаны и нашли широкое применение (Тарасов, 1998; Ревазова и др., 1997). Существует несколько систем классификации тестов. Во-первых, тесты можно сгруппировать по регистрируемым генетическим эффектам - генотоксичным или собственно мутагенным. В первую группу относятся тесты, учитывающие повреждения ДНК (разрывы, сшивки, аддукты), внеплановый синтез ДНК, SOS-ответ и другие. Во вторую группу входят тесты, учитывающие индукцию точковых мутаций, или хромосомных аберраций.
Однако учитываемый эффект (генотоксический или мутагенный) интересует нас не сам по себе, а лишь в той степени в какой он прогнозирует мутагенную, либо канцерогенную активность для млекопитающих и человека.
Во-вторых, тест-системы принято делить по филогенетической близости к человеку на методы in vitro и in vivo. Самой многочисленной и постоянно пополняющейся группой являются тесты in vitro, в которых в качестве тест-объектов используются клетки бактерий, низшие эукариоты, культуры клеток млекопитающих и человека. Тесты in vitro обладают высокой чувствительностью к действию мутагенных соединений и используются, главным образом, на первом этапе тестирования.
Вторую группу представляют тесты in vivo, в которых в качестве тест-объектов используются мелкие грызуны, например мыши и крысы. При этом генетические эффекты могут учитываться как в соматических, так и в половых клетках. Тесты in vivo используются на втором и третьем этапах оценки потенциальной мутагенной опасности. (Абилев, Порошенко, 1986; Белицкий, Худолей, 1986; Худолей, 1999).
Применение тестов in vivo на поздних этапах тестирования связано с их высокой стоимостью.
Необходимость учета затрат при проведении биотестирования
При проведении массового скрининга сотен тысяч веществ -загрязнителей среды на мутагенную активность возникают дополнительные трудности, о которых мы уже упоминали выше и которые связаны с временными и материальными затратами на проведение одного измерения (или тестирования одного соединения). В результате, использование прямых, но, вместе с тем, более длительных и дорогих тестов резко сокращает число тестируемых в реальных условиях химических веществ - загрязнителей среды. С другой стороны, в настоящее время описано более сотни тест-систем, которые используются в качестве тестерных при проведении скрининга веществ на их мутагенную активность.
В таблице 1 дан пример оценки временных и материальных затрат при проведении тестирования для некоторых широко используемых в настоящее время тест-систем. Следует сразу сказать, что по экономичности представленные в таблице системы превосходят прочие, такие, как например система учета летальных мутаций в половых клетках мышей и дрозофилы, не говоря уже о так называемом прямом тесте на канцерогенность у грызунов, который длится в течении 2-4 лет и затраты на его проведение исчисляются суммой порядка 1-2 млн. долларов США. (Buzzi, Wurgler, 1990).
На первом этапе используются наиболее экономичные в плане материальных затрат тест-системы и по результатам тестирования принимаются решения. В случае отрицательного результата тестирование прекращается, в случае положительного результата мы переходим ко второму этапу тестирования. В результате, объём выборки тестируемых веществ сокращается при переходе от первого ко второму, от второго к третьему и т.д. этапам, однако увеличивается точность оценки потенциальной генетической опасности испытуемых соединений. С учётом того, что стоимость тестирования возрастает при переходе от первого ко второму и т.д. этапам, общие затраты при проведении массового скрининга уменьшаются. Строгое проведение в жизнь этого подхода требует, чтобы в нашем распоряжении были высокочувствительные краткосрочные тест-системы. В противном случае уже на первом этапе могут "проскальзывать", показывая отрицательные результаты, вещества, являющиеся мутагенами либо канцерогенами для человека. Практически сразу же стало ясно, что системы с высокой чувствительностью, особенно если речь идет о регистрации канцерогенной активности, отсутствуют в нашем распоряжении. В связи с этим кажется естественной замена одного теста на группу комплементарных тестов (батарею тестов). Процесс биотестирования в каждой тест-системе, входящей в батарею, проводится не последовательно, а одновременно и лишь затем оценивается прогностическая значимость процедуры тестирования в целом для батареи тестов. В общем виде идея замены последовательного тестирования на фактически параллельное тестирование с использованием различных тест-систем и оценки значимости результатов тестирования для всего ансамбля использованных тестов предложена Брюсиком (Brusick, 1988). Логическое развитие этой идеи выразилось в предложенном позже методе, позволяющем учитывать всю доступную информацию о генотоксичности химических веществ (Lohman et al., 1992; Moore II et al., 1992; Mendelsohn et al., 1992).
По мере развития новых тест-систем и количественной оценки существующих происходит пересмотр принятых в различных странах схем биотестирования химических соединений на генотоксичность. При этом происходит изменение требований к протоколу проведения традиционных тестов и замена одних тестов на другие в составе предлагаемых батарей. Однако, главное, связано с изменением критериев оценки получаемых в ходе тестирования результатов. Рассмотрим более подробно последние изменения в процедуре тестирования на примере США и Европы.
В США Агентство по защите окружающей среды (USEPA) регулярно опубликовывает требования для оценки мутагенного риска загрязнителей окружающей среды (Duesberg, 1987; Auletta et al., 1993).
Компьютерные программы, использованные в работе
Для оценки значимости различий средних значений, полученных в ходе экспериментальной оценки мутагенной активности химических соединений в тесте по учету соматических мутаций в листьях сои использовался критерий Стьюдента.
Компьютерные программы, использованные в работе.
При оценке апостериорной вероятности использовался модуль «дискриминатный анализ» пакета программы «Statistica 6.0».
Для определения значений информации и уровня доказанности канцерогенной активности соединений использовалась программа Union 1001.
Генерацию и отбор одиночных и компаундных структурных дескрипторов осуществляли с помощью программ NASA и Biogenic. Для оценки эффективности описания и прогноза канцерогенной активности использовалась программа Piter.
Компьютерные программы Union 1001, Biogenic, Piter были разработаны в лаборатории изменчивости генома ИОГен РАН.
Невозможность проведения прямой оценки мутагенной опасности химических соединений непосредственно у человека привела к созданию целого ряда косвенных методов оценки этой опасности. Понятно, что при использовании косвенных методов мы не гарантированы от ошибок, т.е. между результатами испытаний и интересующими нас последствиями у человека существует не однозначная, а вероятностная зависимость. Количественное определение этой зависимости проводится в ходе ретроспективного анализа или так называемых валидных исследований тест-систем.
Для проведения ретроспективного анализа необходимо иметь хорошо охарактеризованную выборку химических соединений, которые включают в себя как активные соединения, в данном случае канцерогены, так и неактивные соединения у которых не зарегистрирована канцерогенная активность у грызунов. Кроме того, у химических соединений, входящих в эту выборку должны существовать данные по результатам испытаний в исследуемых тестах, в нашем случае, в тесте по учету соматических мутаций в листьях сои. В результате первый этап при количественной оценке прогностической эффективности тест-систем заключается в формировании выборки пригодной для проведения ретроспективного анализа. Источником информации при формировании такой выборки служили как литературные данные, так и результаты собственных исследований.
Как известно, тест по учету соматических мутаций на листьях сои позволяет учитывать разные типы генетических нарушений. Оценка мутагенного действия вещества ведется путем учета и анализа пятен, появляющихся на листьях сои, вследствие обработки семян мутагенами (рис. 9). Эти пятна имеют четкие границы, что позволяет довольно легко отличить их от пятен, появляющихся в результате физиологических процессов.
На первом этапе нами были проведены эксперименты по изучению на сое мутагенных эффектов некоторых химических соединений и препаратов, используемых человеком в быту. Это лекарственные вещества, среди которых противоопухолевый препарат циклофосфан, противотуберкулезный препарат изониазид, антибактериальный препарат нитрофуразон, психотропный препарат диазепам, диуретический препарат фуросемид, витамин С (аскорбиновая кислота), а также пестицид карбофос. Кроме того, на сое были протестированы гидроксиламин и нафтиламин - а.
В таблице 3 представлены итоговые результаты этих исследований. Видно, что все соединения, за исключением аскорбиновой кислоты, изониазида и карбофоса, индуцировали у сои соматические мутации. Аскорбиновая кислота снижала спонтанный уровень появления пятен на листьях, то есть проявила антимутагенную активность, что согласуется с данными и на других тест-системах (Anderson et al., 1995). Изониазид, как известно, проявляет мутагенную активность только in vivo на клетках млекопитающих (Шапиро и др., 1978).
Параметры, характеризующие эффективность тест-систем (чувствительность, специфичность, конкордантность)
Как видно из таблицы 4 выборка химических соединений, тестированных на канцерогенную активность на грызунах и на мутагенную активность сое, содержит как простые (мочевина, азид натрия, гидроксиламин и др.), так и сложные (актиномицин D, дауномицин, митомицин С, телеоцидин и др.) по своей структуре вещества. При этом можно выделить ряд групп соединений, отличающихся друг от друга
структурными особенностями. Группа фосфорорганических соединений включает пестициды байцид, экатин, карбофос и цитостатик циклофосфан. Группа алкилированных сульфонатов включает диэтилсульфат, метилметансульфонат, этилметансулфонат. К полициклическим ароматическим углеводородам можно отнести бензпирен, 1-нитропирен, 1,3-динитро- и 1,6-динитронитропирены. Выборка содержит как простые ароматические амины, как нафтиламин-а и орто-аминоазотолуол, так и гетероциклические ароматические амины, как - 3-амино-1,4-диметил-5Н-пиридо-(4,3-Ь) индол (TRP-P-1) и IQ (2-амино-3-метилимидазо-[4,5-і]-хинолин). Группа нитрозированных соединений включает диметилнирозамин, динитрозопиперазин, метил- и этилнитрозомочевины, а также метилнитронитрозогуанодин (МННГ).
Эта выборка служила основой для последующего проведения оценки эффективности использования теста по учету соматических мутаций в листьях сои как отдельно, так и в составе батарей тестов.
Количественная оценка эффективности тестирования. 3.2.1. Вероятностное описание эффективности тест-систем и результатов тестирования.
Параметры, характеризующие эффективность тест-систем (чувствительность, специфичность, конкордантность).
Отсутствие однозначной зависимости между мутагенной или канцерогенной активностью химических соединений и их ответами в тест-системах связано с тем, что в процессе тестирования, наряду с правильными позитивными и негативными результатами (ответами), возникают и ложные позитивные и негативные результаты. Понятно, что соотношение между долей ложных и правильных результатов характеризует эффективность тест-систем. Для количественного определения этой эффективности введены и используются понятия чувствительности, специфичности и конкордантности тест-систем. Чувствительность теста представляет собой долю позитивных результатов при испытании заведомых мутагенов или канцерогенов.
Специфичность - это доля отрицательных результатов при тестировании заведомо немутагенов. Таким образом, чувствительность и специфичность теста представляют собой условные вероятности правильного определения мутагенов или немутагенов, если тестируемая выборка химических соединений состоит из мутагенов или немутагенов, соответственно.
В свою очередь конкордантность (С) представляет собой долю соединений, у которых правильно предсказана их активность, независимо от того, положительный это или отрицательный результат. Этот показатель непосредственно связан с чувствительностью и специфичностью тест-систем, и эта связь выражается простой функциональной зависимостью: С=роа + (1-р0)Р (1) где ро - значения априорной вероятности активности соединений, характеризующие долю активных соединений в анализируемой выборке или генеральной совокупности; а, /? - чувствительность и специфичность тест-системы, соответственно.
В таблице 5 приведены данные тестирования 55 отобранных соединений в 6-й тест-системах и результаты расчета чувствительности, специфичности и конкордантности этих тест-систем.
Однако если рассматривать характеристики чувствительности и специфичности, то ситуация меняется (рис. 9). Видно, что все рассматриваемые тест-системы обладают относительно высокими значениями чувствительности. Во всяком случае, чувствительность во всех тестах превосходит по своему значению специфичность. В результате основное различие между рассматриваемыми тест-системами связано со значением их специфичности. При этом наиболее чувствительные тест-системы (ГМ, ХА, СХО) обладают низкой специфичностью. Особенно эта тенденция проявляется в случае теста по учету сестринских хроматидных обменов (СХО). Следует еще раз отметить, что рассматриваемые тесты являются в определенном смысле каноническими - они на протяжении десятков лет рекомендуются и активно используются в базовых схемах оценки потенциальной генетической опасности химических соединений. При этом в ходе проведения такого рода оценок абсолютный приоритет принадлежит тесту Эймса.
Как видно из рисунка 9, в случае теста Эймса значения чувствительности и специфичности оказываются примерно одинаковыми. И в этом плане наиболее близким по сбалансированности соотношения между значениями чувствительности и специфичности к тесту Эймса оказывается тест по учету соматических мутаций в листьях сои.
Таким образом, сравнение эффективности теста по учету соматических мутаций в листьях сои с эффективностью пяти наиболее широко используемых в настоящее время краткосрочных тестов показало, что исследуемый тест превосходит по своей эффективности четыре теста, приближаясь к тесту Эймса.
Для увеличения эффективности тестирования в настоящее время используются не одиночные тесты, а батареи тестов. В первую очередь использование батарей тестов связано с первым этапом общей процедуры тестирования. При использовании батарей тестов тестирование представляет собой сложные испытания, когда число возможных его исходов оказывается равным 2К, где к - число тестов, входящих в батарею.
