Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитический обзор литературы 8
1.1 Вредоносность и распространение болезней сои . 8
1.2 Влияние экологических факторов на развитие инфекции сои . 27
1.3 Ферменты инфицированных растений 32
2 Условия, объекты и методика проведения исследований 44
2.1 Агроклиматические и почвенные условия Амурской области 44
2.2 Материалы и методы исследований 53
3 Энзиматическая активность в корнях и листьях сои при поражении почвенными (корневыми) инфекциями 61
3.1 Видовой состав возбудителей корневой гнили сои и динамика развития болезни 61
3.2 Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в корнях сои при поражении возбудителями корневой гнили ... 66
3.3 Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в листьях сои при поражении возбудителями корневой гнили 72
4 Энзиматическая активность в листьях сои при поражении листо- стеблевыми инфекциями . 75
4.1 Динамика развития грибных и бактериальных заболеваний и оценка болезнеустойчивости сои 75
4.2 Участие ферментов в ответных реакциях сои на поражение листо-стеблевыми инфекциями 84
4.2.1 Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в листьях сои при поражении грибной и бактериальной инфекциями в естественных условиях 85
4.2.2 Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в изолированных листьях сои при искусственном заражении септориозом . 98
5 Энзиматическая активность в семенах сои при поражении фитопатогенами . 105
5.1 Влияние зараженности семян сои болезнями на их биохимический состав и продуктивность растений . 105
5.2 Изменение активности каталазы, пероксидазы и кислой фосфатазы в семенах сои при поражении грибной и бактериальной инфекциями . 111
Выводы . 117
Практические рекомендации . 118
Список литературы . 119
Приложения 148
- Влияние экологических факторов на развитие инфекции сои
- Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в корнях сои при поражении возбудителями корневой гнили
- Участие ферментов в ответных реакциях сои на поражение листо-стеблевыми инфекциями
- Изменение активности каталазы, пероксидазы и кислой фосфатазы в семенах сои при поражении грибной и бактериальной инфекциями
Введение к работе
Актуальность темы. Растения живут в постоянно изменяющихся условиях внешней среды, подвергаются действию различных факторов абиотической и биотической природы. Им приходится адаптироваться к этим факторам и формировать механизмы противодействия их негативному влиянию. Одними из самых серьезных и универсальных биотических воздействий, которым подвергаются растения, являются патогенные микроорганизмы. Это могут быть вирусы, бактерии, простейшие и грибы (Чесноков, 2007).
Урожаи сои в значительной степени зависят от влияния целого ряда
различных факторов, в том числе поражения болезнями и вредителями.
Особенно вредоносны воздушно-капельно-семенные инфекции:
пероноспороз, септориоз, церкоспороз, бактериоз, которые освоили в качестве дополнительной экологической ниши семена и в связи с этим приспособились к передаче инфекций из года в год (Заостровных, Дубовицкая, 2003).
Наиболее экономически выгодным и экологически безопасным методом борьбы с заболеваниями является возделывание устойчивых сортов, что позволит существенно улучшить экологическую ситуацию. Изучение биохимических особенностей инфицированного растения представляет важный этап на пути познания природы устойчивости к патогенным микроорганизмам. Взаимодействие возбудителя и хозяина вызывает значительные изменения в функциональном состоянии растений, что прежде всего отражается на уровне ферментативной активности (Савич, 1989).
В последнее время большое внимание уделяется изучению роли пероксидазы в формировании устойчивости к возбудителям болезней (Минибаева, Гордон, 2003; Максимов и др., 2006, 2010; Граскова, 2008), однако недостаточно данных об участии каталазы и кислой фосфатазы в защитных реакциях растений, отсутствуют сведения о влиянии патогенных микроорганизмов на активность ферментов в онтогенезе сои.
Поэтому данное исследование, направленное на изучение ферментов в системе «растение-хозяин – патоген» как возможных биохимических факторов устойчивости, является актуальным и имеет большое научное и практическое значение.
Цель работы: исследовать влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и G. soja Sieb. et Zucc., сопоставить изменения этого показателя с устойчивостью к ряду грибных и бактериальных заболеваний.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить динамику развития грибных и бактериальных заболеваний, оценить болезнеустойчивость G. max и G. soja.
2. Определить удельную активность пероксидазы, каталазы и кислой
фосфатазы в корнях и листьях сои при инфицировании возбудителями
корневой гнили.
3. Выявить постинфикционные изменения удельной активности
пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в листьях G. max и G. soja при
поражении листо-стеблевыми болезнями в естественных условиях.
4. Установить динамику удельной активности пероксидазы, каталазы и
кислой фосфатазы в изолированных листьях G. max и G. soja при
искусственном заражении S. glycines.
5. Определить биохимические показатели семян сои при поражении
фитопатогенами.
Научная новизна. Впервые проведено многостороннее исследование
изменения активности ферментов в растениях G. max и G. soja под влиянием
грибной и бактериальной инфекций. Установлено, что устойчивость сои к
фитопатогенам (S. glycines, P. manshurica, Ps. glycineum) не зависит от
изначальной активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в
листьях сои, а связана с изменением активности ферментов в ответ на
внедрение патогена. Определена динамика активности ферментов в
изолированных листьях сои при искусственном инфицировании
септориозом. Выявлено, что активность пероксидазы и каталазы на начальном этапе, а кислой фосфатазы на поздних сроках развития заболевания может служить критерием устойчивости к S. glycines.
Практическая значимость. Полученные результаты и сделанные на их основе выводы расширяют представление о защитных механизмах растений к действию фитопатогенов и могут быть использованы в практической селекции на устойчивость, позволяющей снизить влияние биотических стрессоров на агроценоз. Результаты исследования могут быть использованы как в лекционных курсах, так и практикумах по сельскохозяйственной экологии и защите растений.
Положения, выносимые на защиту:
– постинфекционные изменения активности ферментов определяются генотипом, фазой развития сои и видом возбудителя;
– устойчивость сои к фитопатогенам не зависит от изначальной активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в листьях сои, а связана с изменением активности ферментов в ответ на внедрение патогена;
– активность ферментов можно использовать в тестовых системах для селекционного отбора устойчивых сортов сои.
Личный вклад автора. Получение результатов, изложенных в диссертации, выразилось в результате экспериментальных исследований, проведнных в 2008-2011 гг. Автором проведены полевые опыты, дана аналитическая оценка и сделано обобщение полученных результатов, написание работы выполнены лично автором.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на научных конференциях ФГБОУ ВПО «ДальГАУ» (г. Благовещенск, 2009, 2010, 2012 гг.), на международной научно-практической конференции «Аграрные
проблемы соесеющих территорий Азиатско-тихоокеанского региона», на координационном совещании зоны Дальнего Востока и Сибири «Итоги координации НИР по сое за 2006-2010 гг. и направления исследований на 2012-2015 гг.» в ГНУ ВНИИ сои Россельхозакадемии (г. Благовещенск, 2010 г., 2012 г.); на II-м «Амурском региональном фестивале науки» (г. Благовещенск, 2012 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, 35 приложений. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста, иллюстрирована 47 рисунками и 19 таблицами. Список цитируемой литературы включает 293 источник, в том числе 81 на иностранных языках.
Влияние экологических факторов на развитие инфекции сои
Экологические условия играют важную роль, как в возникновении заболевания, так и его развитии. Интенсивность распространения и развития болезней культурных растений определяется характером взаимоотношений трех компонентов: возбудителя болезни, растения-хозяина и внешней среды. Среди комплекса факторов среды решающая роль принадлежит ее абиотическим элементам – климату и погоде (Гофман, 2007).
Абиотические факторы оказывают огромное влияние на взаимоотношения растения-хозяина – патоген, на возникновение и течение патологических процессов в нём (Стэкмен, Харрар, 1959). На заражение патогенами, споры, которых переносятся по воздуху, наибольшее воздействие оказывают температура и влажность, а в некоторых случаях – свет и атмосферное давление. Характер поражения растений возбудителями, передающимися через почву, определяется также величиной рН субстрата, аэрацией и общим содержанием питательных веществ (Эванс, 1971). Температура, влажность воздуха и почвы, кислотность субстрата, аэрация, освещенность – все эти факторы существенно влияют на развитие возбудителей. В то же время в зависимости от этих факторов формируется устойчивость растений к заражению патогенами, их восприимчивость и выносливость к заболеваниям в различные периоды вегетации. Температура среды является одним из основных факторов, определяющих возможность возникновения заболевания растений и степень его вредоносности. Влияние этого фактора начинает проявляться уже на первых этапах инфекционного процесса, обусловливая жизнеспособность возбудителя болезни и возможность его сохранения к началу вегетационного периода (Гофман, 2007). Основные грибные болезни в дальневосточном регионе – септориоз, пероноспороз, церкоспороз, фузариоз, аскохитоз, склеротиниоз. Из бактериальных чаще всего встречается бактериальная угловатая пятнистость (Дега, 2012). Наиболее полно исследовано воздействие экологических условий на Peronospora manshurica (Корецкий, 1967; Mckenzie, Wyllie, 1971; Dunleavy, 1982), Septoria glycines (Hemmi, 1940; Mullens, Hilty, 1979; Peterson, 1982). Влияние условий среды на развитие Ascochyta sojaecola ранее не изучалось (Наумов, 1986).
Возбудитель септориоза развивается при температуре от 5 до 36С (Hemmi, 1940). Спороношение гриба происходит при температуре не ниже 18-20С и относительной влажности воздуха 95-100%. Частые дожди, обильные росы и высокая температура во второй половине июля и августа способствуют усилению развития септориоза. Условия, способствующие эпифитотийному развитию септориоза, следующие: температура воздуха в пределах 26-28С и относительная влажность в период заражения 80-90%. Очень благоприятны для распространения заболевания частые дожди, высокая температура во второй половине июля – августа и обильные росы (Возбудители…, 1980). В литературе имеются сведения о поражении сои септориозом в первой половине её вегетации (фаза второго настоящего листа) (Jonson, Kochler, 1943; Kurata, 1960), но для успешного развития патогена в этот период необходима тёплая и влажная погода (Овчинникова, 1971а; Mullens, Hilty, 1979; Young, Ross, 1979; Ross,1982). При обильном количестве осадков, частых росах и туманах происходит интенсивное распространение болезни (Корецкий, 1967). На формирование пикноспор не влияют свет и темнота. Существует тенденция ускоренного их развития при колеблющейся температуре (Hemmi, 1940). Жизнеспособность спор септориоза снижается при pH от 9 до 10 и повышается при pH от 3 до 8 (Заостровных и др., 2000). Возбудитель пероноспороза (Peronospora marshurica (Naum.) Syb), относится к представителям воздушно-капельно-семенной подгруппы инфекций. Они нуждаются в наличии капельно-жидкой влаги или высокой относительной влажности воздуха (80-100%) на всех этапах передачи (Гофман, 2007). Распространение конидий происходит особенно интенсивно после дождей и длительных туманов, когда капли воды сохраняются не менее 5 часов (Возбудители…, 1980). По результатам исследований А.М. Овчинниковой (1971а), Ж.Г. Простаковой, А.И. Гани (1983) развитие болезни приостанавливается не только в сухую жаркую погоду, но и в период сильных ливневых дождей, когда конидии смываются с листьев. Для прорастания конидий пероноспоровых грибов необходимо наличие капельно-жидкой влаги в течение определённого времени (Корецкий, 1967; Mckenzie, Wyllie, 1971; Lim, 1978; Новотельнова и др., 1979). Е.С. Наумовой (1986) было отмечено, что в условиях Воронежской области наибольшего развития пероноспороз достигал в 1978 г. Обильные осадки, составившие 136-198% нормы во все три декады июля, повышенная относительная влажность воздуха, длительное сохранение росы на листьях способствовали быстрому распространению и прорастанию конидий гриба. В июле соя находилась в фазе цветения, для которой характерно быстрое нарастание верхушек растений, что также способствовало развитию гриба, поражающего преимущественно молодые растущие ткани (Wyllie, Williams, 1965; Riggle, 1977). Развитию возбудителей пероноспороза способствуют повышенная влажность воздуха и большое количество осадков в сочетании с пониженной температурой. Оптимальной температурой для развития гриба считается 18-20С при относительной влажности воздуха 95-100% (Заостровных, Дубовицкая, 2003). Условиями, способствующими интенсивному развитию церкоспороза и образованию спороношения, являются температура в пределах 20-30С и относительная влажность 90-100%. Сильное развитие заболевания может происходить при частых росах, туманах, высокой с резкими колебаниями относительной влажности воздуха (величина гидротермического коэффициента более 2) (Заостровных, Дубовицкая, 2003).
Оптимальные условия для развития возбудителя болезни пурпурного церкоспороза – относительная влажность воздуха выше 90% и температура 23-28С. Способствуют развитию болезни выпадение обильных осадков, появление туманов или рос, запаздывание с уборкой сои. Заражению растений аскохитозом способствуют влажность воздуха более 90% и температура выше 4С (Заостровных, Дубовицкая, 2003). В Воронежской области в 1980 г. большое количество осадков и повышенная относительная влажность воздуха (до 87%) способствовали нарастанию степени развития аскохитоза на листьях сои до 79,9% в первой половине августа, а в сентябре – до 79,4% на стеблях (Наумова, 1986). Массовому развитию антракноза способствуют высокая относительная влажность воздуха, частые дожди (Жуковская, 1990). Растения, поражённые грибом Sclerotinia sclerotiorum (возбудитель склеротиниоза), погибают в течение 4-5 дней. Белая гниль особенно вредоносна на поливных участках, где условия развития и распространения патогена особенно благоприятны (Соя, 1984). Белая гниль в условиях повышенной влажности воздуха и при достаточно высокой температуре быстро распространяется по посевам и обычно за несколько дней уничтожает значительный процент растений (Кузнецова, 1964). Начальное развитие возбудителя при большинстве инфекционных болезней растений тесно связано с наличием влажности, достаточное количество которой является предварительным условием заражения. Решающим фактором в распространении заболевания являются осадки. Первые этапы развития возбудителей большинства инфекционных болезней растений тесно связаны с наличием капельно-жидкой влаги, достаточное количество которой является предварительным условием заражения, а также зависят от pH среды. Исследования Л.К. Дубовицкой (1987) показали, что возбудители корневых гнилей хорошо развиваются в широких пределах pH (5-8,5). Максимальный рост грибов, F. solani, G. roseum, C. destructans, наблюдался при рН близкой к 7. Для проявления и распространения фузариозов большое значение имеет температура в период прорастания семян. Так, в результате исследований в центральной и южной лесостепи Кемеровской области (1996-1998 гг.) было установлено, что при посеве сои 15-16 мая, когда температура почвы составляла 10С, всходы появляются на 13-14-й день, а при посеве сои 26-29 мая (температура почвы 18-19С) продолжительность появления всходов сокращалась почти в 2 раза и при этом значительно уменьшалось количество болезней, в том числе и фузариозов. При понижении температуры почвы появление всходов замедляется, а гриб при этих условиях может интенсивно развиваться (Заостровных, Бакач, Незнамова, 1991). Развитию бактериальных болезней в значительной степени способствуют высокая влажность, температура и слабощелочная или нейтральная реакция среды. Большинство бактерий хорошо развиваются при температуре 18-25С. Для фитопатогенных бактерий наиболее благоприятна повышенная влажность воздуха и почвы. Свет неблагоприятно действует на большинство бактерий, поэтому в загущенных посевах сильнее развивается бактериоз (Яковлева, 1992). Максимальное развитие угловатой пятнистости наблюдается во второй половине июля-августе, когда среднесуточная температура воздуха составляет 22-27С и выпадает значительное количество осадков – до 300 мм и выше. Оптимальная температура для развития возбудителя составляет 22-23С (Дубовицская, Кравцова, 2002). Благодаря теплой погоде и постоянным ветрам болезнь интенсивно развивается и распространяется. Таким образом, различные экологические факторы оказывают существенное влияние на развитие патогенов сои. Развитию возбудителей аскохитоза и пероноспороза способствуют повышенная влажность воздуха и большое количество осадков в сочетании с пониженной температурой. Однако аскохитоз может развиваться в более широком интервале температур (14-28С, оптимальная 18-24С), чем пероноспороз (14-20С, оптимальная 18-20С). Более высокая температура необходима для развития септориоза (26-28С) и церкоспороза (20-30С) в сочетании с повышенной относительной влажностью воздуха (90-100%). Развитию фузариоза способствуют похолодание после посева и избыток влаги весной. Для возбудителей белой гнили сои необходима прохладная и влажная погода во второй половине вегетации растений. Развитию бактериальной инфекции способствуют высокая температура (18-25С), достаточная относительная влажность и сильные ветра.
Изменение активности пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в корнях сои при поражении возбудителями корневой гнили
Подземные части растений живут в гораздо более сложной биологической среде, чем побеги, так как в почве обычно обитает большое количество грибов, бактерий, актиномицетов, простейших, нематод, насекомых и других организмов. Все эти организмы взаимодействуют друг с другом, и, кроме того, на их численность влияют химические и физические условия почвы (Тарр, 1975). Воздействие патогена вызывает значительные изменения в функциональном состоянии растения, а это прежде всего отражается на уровне ферментативной активности. Удельная активность пероксидазы в корнях, пораженных корневой гнилью, как увеличивается, так и уменьшается относительно контроля (здоровые корни). В частности, установлено увеличение удельной активности пероксидазы в пораженных корнях сортов Гармония и Даурия в фазе первого тройчатого листа. Наоборот, у сорта Соната активность пероксидазы снижается по сравнению с контролем (рис. 15, приложение 4). В фазе цветения удельная активность пероксидазы увеличивается в инфицированных корнях сорта Гармония (в 1,5 раза) с 1384 до 2076 ед/мг белка х 10-2. У сортов Даурия и Соната активность фермента соответственно в 1,2 и 1,3 раза ниже, чем в контроле (рис. 15, приложение 4). Результаты исследования показали, что активность пероксидазы в фазе бобообразования у сорта Гармония в 1,7 раза выше, чем в контроле. Вероятно, высокая активность пероксидазы в корнях устойчивых сортов сои наряду с другими механизмами защиты обеспечивает способность этих растений противостоять действию возбудителя. Наименьшая активность пероксидазы в наших исследованиях отмечена в пораженных корнях сорта Соната (454 ед/мг белка х 10-2) (рис. 15, приложение 4).
На основе полученных данных установлена отрицательная корреляционная зависимость между степенью поражения корней и активностью пероксидазы в пораженных корнях сои: средняя в фазе первого тройчатого листа и сильная в фазы цветения и бобообразования (табл. 2). Чем выше активность фермента, тем ниже был балл поражения корней сои.
Каталаза встречается в клетке вместе с пероксидазой. Её биологическая роль заключается не только в защите клеток от образующейся в ходе метаболизма перекиси водорода, но и в снабжении растения кислородом. Результаты нашего исследования показали, что в фазе первого тройчатого листа удельная активность каталазы в пораженных корнях сорта Гармония снижается в 1,5 раза, но возрастает у сортов Соната (в 1,5 раза) и Даурия (в 1,2 раза) (рис. 16, приложение 5).
У сорта Даурия, занимающего промежуточное положение по устойчивости к корневым гнилям, активность фермента достоверно не изменялась по сравнению со здоровыми корнями (рис. 16, приложение 5). У сильно поражаемого корневой гнилью сорта Соната активность фермента в 1,3 раза выше, чем в контроле (рис. 16, приложение 5). Повышение активности каталазы привело к снижению концентрации перекиси водорода, а это лимитирует реакции, катализируемые пероксидазой. Не исключено, что подобные изменения активности каталазы у сорта Соната способствуют формированию совместимых отношений в комбинации хозяин (соя) – патоген. Изучение зависимости поражения сои корневой гнилью от активности каталазы показало, что между указанными параметрами существует положительная корреляция средней силы в фазе первого тройчатого листа и сильная в фазе цветения: чем ниже активность каталазы, тем ниже балл поражения (табл. 3). Однако в фазе бобообразования была выявлена сильная отрицательная взаимосвязь между степенью поражения растений корневой гнилью и активностью каталазы в пораженных корнях сои, при которой с увеличением активности фермента происходит снижение устойчивости (табл. 3).
Динамика изменения удельной активности кислой фосфатазы в инфицированных корнях сорта Гармония следующая: в фазе первого тройчатого листа она снижается на 24%, в фазах цветения и бобообразования достоверного отличия активности этого фермента между больными и здоровыми растениями не выявлено (рис. 17, приложение 6). В пораженных корнях сорта Даурия активность кислой фосфатазы во всех фазах развития ниже, чем у здоровых растений (рис. 17, приложение 6). В пораженных корнях сорта Соната активность кислой фосфатазы в фазе первого тройчатого листа снижается, а затем в фазах цветения и бобообразования увеличивается в 2,0 и 1,6 раза соответственно (рис. 17, приложение 6). Рост активности кислой фосфатазы говорит о возможности усиления литических процессов в пораженных корнях, что может негативно отразиться на гомеостазе фосфорных эфиров. Корреляционный анализ полученных данных позволил выявить сильную положительную связь между степенью поражения корневой гнилью и активностью кислой фосфатазы в фазе первого тройчатого листа. При этом в фазах цветения и образования бобов устойчивость сои к корневой гнили слабо связана с активностью кислой фосфатазы в пораженных корнях (табл. 4).
Проанализированные корреляционные зависимости между активностью пероксидазы, каталазы, кислой фосфатазы и степенью поражения сои корневой гнилью на разных стадиях онтогенеза позволили выявить тесные взаимосвязи, при которых с изменением активности ферментов (убывание или возрастание) возрастает устойчивость. Таблица 4 – Корреляционная зависимость между степенью поражения корневой гнилью и удельной активностью кислой фосфатазы в пораженных корнях сои (в среднем по сортам) Таким образом, инфицирование корней сои корневой гнилью приводит к увеличению активности пероксидазы и снижению каталазы у устойчивого сорта Гармония (активность кислой фосфатазы изменяется несущественно) и, наоборот, к снижению активности пероксидазы и росту активности каталазы и кислой фосфатазы у восприимчивого сорта Соната. Известно (Ильинская и др., 1991; Граскова и др., 2004; Яруллина и др., 2005), что заражение вызывает изменение метаболизма в органах, отдаленных от места внедрения и локализации патогена. В связи с этим нами была определена активность ферментов в листьях сои при поражении корней корневыми гнилями. Важнейшим ферментом, задействованным в формировании защитной реакции растений на внедрение патогена и, в частности, в регуляции уровня перекиси водорода в клетках, является пероксидаза. Развитие заболевания приводит к увеличению активности пероксидазы у устойчивого сорта Гармония не только в корнях, но и в листьях пораженных растений. Повышение удельной активности пероксидазы у сорта Гармония свидетельствует о его высоком адаптивном потенциале (табл. 5, приложение 7). У сортов Соната и Даурия активность пероксидазы в листьях пораженных растений, так же как и в корнях, ниже, чем в здоровых (табл. 5, приложение 7).
Важно заметить, что инфицирование растений через корни приводит к изменению активности фермента в листьях, которые не контактировали с патогеном. Следовательно, можно сделать предположение об участии пероксидазы в развитии системной устойчивости сои при заражении корневыми гнилями. Это согласуется с существующими представлениями о том, что пероксидазу можно рассматривать в качестве маркера системной устойчивости растений при патогенезе (Серова и др., 1982).
Каталаза вместе с другими оксидоредуктазами направляет метаболизм клетки на создание неблагоприятных условий для патогена. Известно о различных ответных реакциях каталазы у устойчивых растений: от сильной активации у овса при заражении корончатой ржавчиной до снижения активности у пшеницы, пораженной стеблевой ржавчиной (Коно, 1961; Нилова, Егорова, 1948).
Под влиянием заражения сои корневой гнилью активность каталазы в листьях сорта Гармония в фазе цветения повышается, а в фазе бобообразования снижается, при этом в пораженных корнях активность фермента в данные фенологические фазы была ниже, чем в контроле (табл. 5, приложение 8).
Участие ферментов в ответных реакциях сои на поражение листо-стеблевыми инфекциями
На следующем этапе работы испытанные на устойчивость к болезням сорта культурной сои (Гармония, Даурия, Соната) и дикорастущая форма КА-1344 анализировались на активность ферментов. Особый интерес представляет дикорастущая соя как уникальный источник генов, обусловливающих экологическую пластичность, высокий гомеостаз, устойчивость к болезням и вредителям, а также скороспелость и повышенную урожайность с одного растения (Ала и др., 2000).
Сорта Гармония и Даурия, а также дикорастущая форма КА-1344 зарекомендовали себя как среднеустойчивые к возбудителю септориоза. Известно, что важную роль в развитии устойчивости растений к патогену играет пероксидаза, которая участвует в детоксикации активных форм кислорода, образующихся в ходе физиологического стресса, вызванного патогенезом (Kawano, 2003). У сорта Гармония активность пероксидазы в пораженных листьях в фазе третьего тройчатого листа увеличивается в 4 раза. В фазах цветения и бобообразования активность пероксидазы также выше в инфицированных листьях, чем в здоровых (рис. 27, приложение 13). После заражения септориозом в фазе третьего тройчатого листа активность пероксидазы в листьях формы КА-1344 увеличивается в 1,8 раза по сравнению с контролем (здоровые листья). В ходе развития патологического процесса активность фермента растёт: в фазе цветения она увеличивается в 1,9 раза, в фазе образования бобов – в 3,8 раза (рис. 27, приложение 13).
В листьях восприимчивого сорта Соната в фазе третьего тройчатого листа активность пероксидазы ниже, чем в контроле, на 18%, в фазе бобообразования достоверного отличия между пораженными и здоровыми листьями не выявлено (рис. 27, приложение 13). Проведенные нами исследования по изучению активности ферментов устойчивых и восприимчивых сортов сои к септориозу показали, что такой характер изменения активности пероксидазы свойствен восприимчивым растениям (Семенова, Титова, Дубовицкая, 2012).
Активность пероксидазы в пораженных листьях сои достоверно отрицательно коррелировала со степенью поражения сои септориозом, особенно в фазе бобообразования: чем выше активность фермента, тем ниже балл поражения (табл. 6).
Существенное снижение активности каталазы (в 2,2 – 3 раза) наблюдается в фазе образования бобов у всех сортов культурной и дикорастущей сои (рис. 28, приложение 14). Снижение каталазной активности в этот период патогенеза может быть обусловлено разрушением хлорофилла. Известно, что под воздействием большинства фитопатогенных грибов уменьшается количество хлорофилла в листьях, так как микроорганизмы разрушают хлоропласты. Согласно исследованиям Б.А. Рубина и М.Е. Ладыгиной (1966), в листьях, в которых происходит частичное или полное разрушение хлорофилла, всегда наблюдается падение каталазной активности.
Устойчивость сои к септориозу значимо и положительно коррелировала с удельной активностью каталазы в пораженных листьях сои только в фазы третьего тройчатого листа и цветения. В то же время в фазе бобообразования взаимосвязь между изучаемыми параметрами была слабой и недостоверной .
По данным корреляционного анализа выявлена средняя положительная связь степени поражения сои септориозом с активностью кислой фосфатазы в пораженных листьях в фазе третьего тройчатого листа, слабая отрицательная (недостоверная) в фазе цветения и отрицательная средней силы в фазе бобообразования (табл. 8). Гармония Даурия Соната КА 1344 Рисунок 31 – Удельная активность каталазы (% к контролю) в листьях G. max и G. soja при поражении пероноспорозом, 2008 – 2011 гг. У изучаемых сортов установлена положительная связь средней силы между степенью поражения пероноспорозом и удельной активностью каталазы в пораженных листьях сои в фазе цветения: чем выше активность, тем выше пораженность сои. В фазе бобообразования связь между анализируемыми параметрами была сильной отрицательной: чем выше активность, тем меньше степень поражения сои (табл. 10). Таблица 10 – Корреляционная зависимость между степенью поражения пероноспорозом и удельной активностью каталазы в пораженных листьях сои (в среднем по сортам) Анализируемая пара Фаза развития сои Коэффициент параметров корреляции степень поражения цветение 0,43 ± 0,06 пероноспорозом – удельная бобообразование - 0,88 ± 0,02 активность каталазы в листьях сои tтеор при Р0,95=1,98 В листьях G. max и G. soja, пораженных пероноспорозом, активность кислой фосфатазы ниже в сравнении со здоровыми листьями. В меньшей степени активность фермента снижается в листьях дикорастущей сои, устойчивой к пероноспорозу, в большей степени – у сортов Даурия и Соната (рис. 32, приложение 18). 120 100 60 20 цветение бобообразование контроль Гармония Даурия Соната КА 1344 Рисунок 32 – Удельная активность кислой фосфатазы (% к контролю) в листьях G. max и G. soja при поражении пероноспорозом, 2008 – 2011 гг. Проанализированная корреляционная зависимость между степенью поражения пероноспорозом и удельной активностью кислой фосфатазы в пораженных листьях сои в фазах цветения и бобообразования оценивается как слабая и недостоверная (табл. 11). Таблица 11 – Корреляционная зависимость между степенью поражения пероноспорозом и удельной активностью кислой фосфатазы в пораженных листьях сои (в среднем по сортам) Анализируемая пара параметров Фаза развития сои Коэффициент корреляции степень поражения пероноспорозом – удельная активность кислой фосфатазы в листьях сои цветение - 0,31 ± 0,52 бобообразование - 0,37 ± 0,50 tтеор при Рo,95=l,98 Корреляционная связь несущественна Цфакт tтеор
По-видимому, снижение активности кислой фосфатазы в листьях пораженных растений связано не с формированием устойчивости, а с нарушением углеводно-фосфорного и липидного обменов, которое происходит под влиянием патогенов.
Исследованные сорта культурной сои (Гармония, Даурия и Соната) и дикорастущая форма КА-1344 обладали средней устойчивостью к бактериозу. Инфицирование растений бактериозом приводит к изменению активности пероксидазы в пораженных листьях всех образцов, она увеличивается относительно контроля, особенно у дикорастущей сои (рис. 33, приложение 19).
Как видно из данных таблицы 12, существует средняя отрицательная корреляционная зависимость между удельной активностью пероксидазы в пораженных листьях сои и устойчивостью к бактериозу: чем выше активность пероксидазы, тем ниже балл поражения.
Под влиянием заражения удельная активность каталазы в фазе цветения в листьях сортов Соната и Даурия увеличивается в 2,7 – 4,5 раза соответственно, а у сорта Гармония и формы КА-1344 снижается. В фазе бобообразования в листьях культурной и дикорастущей сои активность каталазы была ниже, чем в контроле. Минимальная активность фермента (13 х 10-4 ед/мг белка) обнаружена у G. soja (рис. 34, приложение 20).
Корреляционная связь несущественна Цфакт tтеор Проанализировав корреляционные зависимости между степенью поражения листьев патогенами листо-стеблевой экологической ниши и активностью ферментов, была выявлена отрицательная средней силы связь активности пероксидазы с устойчивостью к септориозу, пероноспорозу и бактериозу. Корреляция активности каталазы с устойчивостью была положительной в фазы третьего тройчатого листа и цветения, отрицательной в фазе бобообразования. Несмотря на то, что связь активности кислой фосфатазы со степенью поражения листьев фитопатогенами в основном была слабой и недостоверной, нельзя не учитывать тот факт, что активность литических ферментов имеет большое значение в исходе противоборства растения-хозяина и патогена.
Поскольку характер взаимодействия патогена и растения-хозяина зависит не только от патогена, но и от растения-хозяина, нами была исследована активность изучаемых ферментов в листьях здоровых растений. При проведении анализа было обнаружено, что удельная активность пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы возрастает в онтогенезе, достигая максимума в фазе образования бобов (приложения 16 – 18), подобные изменения активности ферментов в листьях сои были отмечены в ранее проведенных исследованиях (Семенова, 2006).
Изменение активности каталазы, пероксидазы и кислой фосфатазы в семенах сои при поражении грибной и бактериальной инфекциями
Результаты исследования показали, что удельная активность ферментов различна у здоровых и пораженных болезнями семян изучаемых сортов сои. Изменение ферментативной активности инфицированных растительных тканей свидетельствует о нарушении состояния гомеостаза (Серова и др., 1982). Способность сохранять необходимый уровень метаболических процессов и скорость их перестройки зависят от степени устойчивости сорта (Удовенко, 1975).
В семенах сои, пораженных грибной и бактериальной инфекциями, удельная активность пероксидазы ниже, чем в здоровых (табл. 17, приложение 31). Согласно литературным данным (Рубин и др., 1975; Андреева и др., 1979), снижение активности пероксидазы связано с изменением уровня окислительно-восстановительных процессов инфицированных семян, инфекция вызывает снижение метаболической активности и интенсивности дыхания. В наибольшей степени активность фермента снижается в семенах сортов Гармония и Даурия, пораженных фузариозом (в 3,9 – 4,7 раза соответственно). Следует отметить, что активность пероксидазы в семенах всех сортов, пораженных пероноспорозом, снижается незначительно. Противоположно изменению удельной активности пероксидазы в семенах, пораженных разной инфекцией, активность каталазы увеличивается, что соответствует наличию обратной зависимости между удельной активностью каталазы и пероксидазы (Селихова, 2003). Повышенная каталазная активность способствует снижению концентрации перекиси водорода в клетке, что лимитирует реакции, катализируемые пероксидазой. Данные таблицы 18 показывают, что активность каталазы в семенах сои сорта Соната, пораженных пероноспорозом, аскохитозом, фузариозом, церкоспорозом и пурпурным церкоспорозом, выше в 1,2 – 2,4 раза, чем в здоровых. В семенах сорта Гармония, пораженных грибной инфекцией, активность каталазы увеличивается незначительно: в 1,8 раза при заражении пероноспорозом и фузариозом и остается на уровне здоровых в семенах, пораженных аскохитозом, церкоспорозом, пурпурным церкоспорозом и антракнозом (приложение 32). Удельная активность каталазы в пораженных семенах сорта Даурия возрастает в 1,2 – 2,0 раза и в меньшей степени под влиянием возбудителей аскохитоза и церкоспороза. Увеличение активности каталазы выявлено в семенах всех сортов сои, пораженных бактериальной инфекцией. По-видимому, вместе с другими оксидоредуктазами она направляет метаболизм клетки на создание неблагоприятных условий для патогена. Полученные данные показывают, что удельная активность кислой фосфатазы отличается у здоровых и пораженных разными болезнями семян. Активность кислой фосфатазы в пораженных семенах как увеличивается, так и уменьшается по сравнению со здоровыми (табл. 19, приложение 33). Существенное снижение активности фермента ( в 3 раза) было установлено при поражении семян сои фузариозом. Изменение ферментативной активности, вероятно, связано с нарушением углеводно-фосфорного и липидного обменов, которое происходит под влиянием инфекции. Таким образом, удельная активность пероксидазы в семенах сои под влиянием различной инфекции снижается, а каталазы – повышается или остается на уровне здоровых семян, что определяется сортом сои и может характеризовать его устойчивость к заболеванию. Инфицирование семян фузариозом приводит к резкому снижению активности кислой фосфатазы у всех сортов сои. На следующем этапе работы нами была определена удельная активность пероксидазы, каталазы и кислой фосфатазы в проростках сои, полученных из семян, пораженных разной инфекцией. Из данных, представленных на рисунке 46, видно, что активность пероксидазы проростков сои изменяется относительно контроля (проростков из здоровых семян). По-видимому, под влиянием метаболитов патогена нарушается обмен веществ не только в пораженных семенах, но и в проростках, полученных из них. При этом наблюдались различия в реакции проростков разных сортов сои на инфекцию.
Увеличение активности пероксидазы относительно контроля происходит в проростках сорта Соната, полученных из семян, пораженных церкоспорозом (в 1,6 раза) и пероноспорозом (в 1,3 раза). Наоборот, в проростках, полученных из семян, пораженных пурпурным церкоспорозом и бактериозом, активность фермента снижается (приложение 34). В проростках сорта Гармония активность пероксидазы под влиянием инфекции изменяется незначительно (приложение 34). Согласно исследованиям (Серова и др., 1982) стабильная энзиматическая система свойственна устойчивым растениям. К ферментам этой системы принадлежит пероксидаза. У сорта Даурия самая высокая активность пероксидазы (18 х 10-4 ед/мг белка) была в проростках из семян, пораженных антракнозом, самая низкая (6 х 10-4 ед/мг белка) – в проростках из семян, пораженных бактериозом (приложение 34). В зависимости от возбудителя реакция на него, проявляемая в активности каталазы, может быть различной. Активность каталазы в проростках из пораженных семян как увеличивается, так и уменьшается по сравнению с контрольными (рис. 47). Повышается активность фермента в проростках сортов Соната и Гармония, полученных из семян, пораженных пероноспорозом и церкоспорозом, в проростках сорта Даурия – из семян, пораженных пероноспорозом (приложение 35). Существенное снижение активности каталазы (в 1,7 – 2,0 раза) наблюдается в проростках сортов Даурия и Гармония, полученных из семян, пораженных антракнозом. В проростках сортов Соната, Гармония и Даурия, полученных из семян, пораженных пурпурным церкоспорозом и бактериозом, активность каталазы остается на уровне контрольных (приложение 35). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что изменение активности ферментов в пораженных семенах сои и проростках, полученных из них, зависит от генотипа растения и вида возбудителя. Было выявлено, что наибольшей патогенностью обладает возбудитель фузариоза. Согласно изменению активности пероксидазы и каталазы в проростках, полученных из зараженных семян, сорт Гармония проявил себя как наиболее устойчивый к воздействию фитопатогенов.
