Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Влияние пестицидов на микробоценоз почвы 9
1.1 Действие пестицидов на почвенные микроорганизмы 10
1.2 Детоксикация пестицидов в почве с помощью микроорганизмов- деструкторов
Глава 2 Объекты, методика и условия проведения экспериментов 26
2.1 Характеристика почвенной микрофлоры черноземов южных карбонатных Северного Казахстана
2.2 Краткая характеристика гербицидов, используемых в опытах 31
2.3 Методика полевых и лабораторных исследований 33
2.3.1 Определение влияния применения гербицидов в полевых 34
условиях на почвенные микроорганизмы
2.3.2 Поиск тест-объектов из представителей рода Bacillus для оценки влияния гербицидов на почву
2.3.3 Модельные опыты по поиску микроорганизмов-деструкторов 41
2.3.4 Лабораторные опыты по изучению деструктивной активности штамма Fusarium oxysporum
Глава 3 Особенности формирования микрофлоры чернозема южного карбонатного под воздействием гербицидов
3.1 Микрофлора почвы при краткосрочном влиянии гербицидов группы 2,4-Д, феноксапроп-п-этила и клодинафоп-пропаргила
3.2 Некоторые особенности воздействия гербицидов на почвенную микрофлору в длительных стационарных опытах
3.3 Численность некоторых групп почвенных микроорганизмов при применении гербицидов производственных посевах
3.4 Бактерии рода Bacillus как возможные тест-объекты для оценки состояния почвы при воздействии гербицидов
3.4.1 Влияние гербицидов на рост колоний Bacillus megaterium 67
3.4.2 Влияние гербицидов на рост колоний Bacillus mycoides 71
3.5 Поиск штаммов почвенных грибов – деструкторов гербицидов 74
3.5.1 Влияние гербицидов на рост колоний Trichoderma lignorum 74
3.5.2 Влияние гербицидов на рост колоний Fusarium oxysporum 79
3.5.3 Оценка деструктивной активности Fusarium oxysporum 85
Заключение 91
Предложения производству 93
Библиографический список 94
Приложения 110
- Детоксикация пестицидов в почве с помощью микроорганизмов- деструкторов
- Краткая характеристика гербицидов, используемых в опытах
- Поиск тест-объектов из представителей рода Bacillus для оценки влияния гербицидов на почву
- Некоторые особенности воздействия гербицидов на почвенную микрофлору в длительных стационарных опытах
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в Казахстане, как и во всем мире, широкое распространение получают технологии сберегающего земледелия на основе минимизации обработок почвы (Каскарбаев, 2005). Интенсивное и постоянное применения удобрений и пестицидов в таких технологиях приводит к усилению нагрузки на почву и ее обитателей. Почвенные микроорганизмы являются одним из основных факторов, влияющих на разложение ксенобиотиков в экосистеме, а также естественными биоиндикаторами, отражающими изменения в почве, что связано с их огромным значением в почвообразовательных процессах и высокой чувствительностью к воздействию всякого рода загрязнений (Круглов, 1991; Глазовская, 1992). В связи с возрастанием роли химизации в сельском хозяйстве изменения в микробоценозе почвы и мониторинг за динамикой основных групп почвенных микроорганизмов, которые отражают состояние экосистемы почвы, приобретают большое значение (Назарько, 2008).
Северный Казахстан входит в зону рискованного земледелия, где одним из ведущих лимитирующих экологических факторов для сельскохозяйственных растений является недостаток почвенной влаги. Как известно, это снижает и микробиологическую активность почвы, увеличивая токсическое действие пестицидов, в результате чего нагрузка на почвенные микроорганизмы при разложении химических веществ многократно усиливается.
В связи с этим становится актуальным вопрос определения допустимой антропогенной нагрузки на почвенные микроорганизмы, выявления индикаторных микроорганизмов, а также микробов, активно участвующих в разложении гербицидов в засушливых условиях на черноземных почвах Северного Казахстана.
Цель исследований: изучить воздействие гербицидов на основные группы почвенных микроорганизмов чернозема южного карбонатного Северного Казахстана и выявить представителей почвенной микрофлоры для использования их в качестве тест-объектов и возможных деструкторов для широко применяемых и новых регистрационных препаратов.
Задачи исследований:
- дать оценку влияния гербицидов на основе клодинафоп-пропаргила, 2,4-
Д, феноксапроп-п-этила, глифосата, трибенурон-метила, флукарбазон-
флутразалона, хизалофор-п-тефурила, пиноксадена, 3,6-дихлор-2-
метоксибензойной кислоты, пироксулама на численность почвенных бактерий,
грибов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов чернозема южного карбо
натного;
- определить чувствительность Bacillus megaterium и Bacillus mycoides,
широко распространенных в почвах региона, к действующим веществам совре
менных гербицидов;
- оценить способность Trichoderma lignorum и Fusarium oxysporum к росту
на питательной среде, содержащей гербициды, а также деструктивную актив
ность F. oxysporum по отношению к их различным действующим веществам.
Научная новизна работы. Выявлено, что в условиях Северного Казахстана внесение гербицидов приводит к изменению в микробоценозе южного карбонатного чернозема – снижению численности бактерий и увеличению числен-3
ности грибов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Впервые установлено, что применение гербицидов увеличивает коэффициент минерализации почвы за счет изменения численности бактерий, усваивающих органический и минеральный азот, в 2-3 раза. Показана высокая чувствительность бактерий Bacillus mycoides и Bacillus megatermm в лабораторных условиях к низким концентрациям действующих веществ гербицидов (клодинафоп-пропаргил, фенок-сапроп-п-этил, 2,4-Д и клопиралид). Определено, что целлюлозоразлагающий гриб Trichoderma lignorum толерантен к ряду гербицидов. Доказана способность к росту на питательной среде М9 с гербицидами и к деструкции их действующих веществ фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum. Установлено, что почвенные грибы и целлюлозоразрушающие микроорганизмы устойчивы к воздействию гербицидов различных химических групп, значительно меньшей устойчивостью обладают бактерии, ассимилирующие органические и неорганические формы азота.
Основные положения, выносимые на защиту:
однократное применение современных гербицидов на черноземах южных карбонатных Северного Казахстана в условиях дефицита влаги в большей степени снижает численность почвенных бактерий, ассимилирующих органические и неорганические формы азота, практически не изменяет численность цел-люлозрушающих микроорганизмов и грибов; а многократное - увеличивает численность последних в 1,5-2,0 раза; в производственных условиях при комплексном использовании препаратов различного спектра действия фиксируется рост численности почвенных микромицетов в 1,5-3,9 раза;
бактерии рода Bacillus (В. megaterium, В. mycoides) высокочувствительны к гербицидам различных химических групп, что дает основу для разработки методов использования их в качестве тест-объектов для контроля загрязнения почв пестицидами;
почвенные грибы Trichoderma lignorum и Fusarium oxysporum способны к росту на питательных средах, содержащих клодинафоп-пропаргил, фенокса-проп-п-этил, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и клопиралид.
Практическая значимость работы. Показано, что в засушливых условиях Северного Казахстана применение гербицидов в рекомендованных нормах расхода, при низких и следовых содержаниях их остаточных количеств в почве, приводит к изменениям в микробоценозе почвы, что обусловливает необходимость подбора препаратов с учетом их влияния на почвенные микроорганизмы. Поскольку Fusarium oxysporum обладает способностью потреблять гербициды, целесообразно использовать его штаммы на землях несельскохозяйственного назначения для разложения пестицидов, а на землях сельскохозяйственного назначения, где интенсивно применяются гербициды, необходимо проводить за ними постоянный мониторинг.
Публикации результатов исследований. Материалы диссертации достаточно полно изложены в 8 печатных работах, 2 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных списком ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, предложений производству и библиографического списка. Рабо-
Детоксикация пестицидов в почве с помощью микроорганизмов- деструкторов
Как было показано выше, реакция почвенных микроорганизмов на действие пестицидов чрезвычайно разнообразна и зависит от многих факторов: химической природы, персистентности препаратов, почвенно-климатических характеристик и пр. (Груздев, 1987; Круглов, 1991). Необходимость исследования взаимодействия пестицидов с почвенными микроорганизмами обусловлена их важнейшей ролью в создании почвенного плодородия и оптимизации условий вегетации растений. Особое значение имеют результаты, достигнутые при применении микробиологического способа очистки почвы от пестицидов (Васильева и др., 1994). В связи с этим ведутся поиски штаммов микробов-деструкторов пестицидов и возможности интродукции их в природные экосистемы (Заборина и др., 1997; Кочетков и др., 1997; Плотникова и др., 2001; Шевелуха и др., 2003). Общий вклад почвенных микроорганизмов в процессы детоксикации оценивается от 10 до 70% (Головлева, Голов-лев, 1980; Алферов и др., 2003). Авторы считают, что такая вариабельность объясняется разнообразием химических соединений, используемых в качестве пестицидов. В то же время частота встречаемости отдельных штаммов-деструкторов в почве невелика. Замечено, что многократное применение пестицидов приводит к изменению микробного ценоза почвы в сторону возрастания в ней относительной доли микроорганизмов, способных разлагать эти ксенобиотики.
Проблема разложения остаточных количеств пестицидов в почве является важным вопросом охраны окружающей среды. Микроорганизмы способны наиболее эффективно разлагать чужеродные для биосферы ксенобио-тические вещества. И эта способность связана с множественностью проводимых ими биохимических реакций и высоким уровнем их адаптации. Способов, альтернативных микробной очистке биосферы от загрязнения пестицидами, в настоящее время не существует. Метод очистки почв, загрязненных агрохимикатами, с применением микроорганизмов - биодеструкторов отличается несомненной эффективностью и экономичностью (Решетов, Ту-гаева, 2012). Кроме того, немаловажно, что биодеструкция является естественным процессом, что делает этот способ приемлемым для общественного сознания (Круглов, 1991).
Ученые считают, что почва как биологическая система, насыщенная разнообразными микроорганизмами и ферментами, способна трансформировать любые природные органические вещества. В результате чего происходит деградация синтетических соединений, в том числе и пестицидов, поскольку они по своей структуре и химическим связям являются аналогами природных соединений, а, значит, способны подвергаться микробиологическому разложению (Карасевич, 1982; Василенок и др., 2000; Алферов и др., 2003; Kokke, 1970; Chacko, 1987; Grunzi, Bread, 1987). Это предположение было выдвинуто еще советским микробиологом Е.Н. Мишустиным (1964), который подчеркивал, что химические соединения (органического или синтетического происхождения) могут использоваться определенными видами почвенных микроорганизмов в качестве источника питания.
По мнению Л.А. Кривошеевой и др. (2003), главным фактором деградации ксенобиотиков в почве является способность микроорганизмов индуцировать синтез ферментов подготовительного цикла для успешной микробиологической трансформации пестицидов. Это подтверждено исследованиями, проведенными В.А. Груздевым (1987), который показал, что способность к деградации в значительной степени зависит от сходства химической структуры молекулы пестицида и природного аналога. По его мнению, механизм разложения пестицидов в почве под влиянием микроорганизмов происходит в результате химических процессов – дегалогенирования, дезалкили-рования, амидного или эфирного гидролиза, окисления, восстановления, разрыва эфирной связи, гидроксилирования ароматического кольца и его разрыва. Необходимо отметить, что во всех химических реакциях, приводящих к распаду органических веществ, главным фактором является способность микроорганизмов выделять тот или иной фермент. Детоксикация и деградация пестицидов в природных экосистемах происходит под действием микроорганизмов, и им отводится ведущая роль в этом процессе (Сингирцев и др., 1994; Леонтьев и др., 2000). Это обусловлено огромным разнообразием почвенных микроорганизмов, лабильностью их клеток, необычайными адаптационными способностями и ферментативной системой, которая высокоспецифична к ксенобиотикам, что обуславливает различные пути разложения пестицидов, среди которых выделяются два: незначительное видоизменение молекулы препарата (трансформация) и полное его разрушение (минерализация).
В результате экспериментальных исследований, проведенных М.Ф. Овчинниковой (1987), было выявлено, что при повышении температуры и влажности почвы происходит усиленное разложение гербицидов, чему предшествует лаг-период, в течение которого определенные виды микроорганизмов адаптируются.
Как уже было отмечено выше, при преобладающем микробиологическом факторе в разложении пестицидов на кривой динамики содержания пестицидов в почве обычно имеется лаг-период, во время которого происходит адаптация микрофлоры, при этом содержание остатков пестицидов изменяется незначительно. Наличие такого периода, в частности, характерно для гербицидов группы 2,4-Д (Чкаников, 1983).
Краткая характеристика гербицидов, используемых в опытах
В наших исследованиях использовали гербициды, которые широко применяются в сельскохозяйственном производстве и внесены в реестр пестицидов для применения на территории Республики Казахстан (Справочник пестицидов (ядохимикатов)…., 2012). Действующие вещества изучаемых препаратов относятся к различным химическим классам – сульфонилмочевины, арилоксифеноксипропилаты, производные феноксиоцтовой кислоты, пиридинкарбоновых кислот, группа симм-триазинов, хлорацитонилиды. Кроме арилоксифеноксипропилата, у которого второй класс опасности, остальные относятся к третьему. Среди 20 применяемых в полевых опытах гербицидов, одиннадцать препаратов можно сгруппировать по сходным действующим веществам: на основе клодинафоп-пропаргила, феноксапроп-п-этила и 2,4-Д (табл. 1). По объектам применения двенадцать препаратов рекомендовано использовать против однолетних сорняков (табл. 2), и восемь гербицидов – против однолетних и многолетних двудольных сорняков. Данные гербициды различаются по биохимическому механизму действия на сорняки (табл. 3). Лабораторные и полевые исследования были выполнены в 2009-2012 гг. в отделе агрохимии и микробиологии ТОО «Научно-производственный центр зернового хозяйства им. А.И. Бараева» Акмолинской области Республики Казахстан.
Полевые опыты закладывали на черноземе южном карбонатном тяжелого гралунометрического состава. Глубина гумусового горизонта достигает в среднем 50 см. Почвы характеризуются высоким содержанием карбонатов – до 5%. Содержание органического вещества – 3-5%, валовых форм азота – 0,3%, фосфора – 0,1%. Реакция почвенной среды слабощелочная (рН 7-7,9). В поглощающем комплексе преобладает кальций (до 80%) и магний (11%). Коэффициент устойчивого завядания составляет 13% в верхних горизонтах, и до 12% - в глубоких. Обеспеченность подвижным фосфором повышенная – 38 мг/кг, содержание нитратного азота – 25 мг/кг (Кунанбаев, 2008).
В целом, почвы опытных участков типичны для всего массива южных карбонатных черноземов Северного Казахстана, они обладают высокими аг рохимическими показателями и являются благоприятными для развития микробиоты и выращивания сельскохозяйственных растений. Сроки внесения препаратов и их отбор был обусловлен тем, чтобы проверить максимальный токсический эффект гербицидов, когда наблюдается наименьшее количество осадков (июнь – июль). Гербициды вносили с помощью ранцевого опрыскивателя в фазе кущения яровой пшеницы сорта Астана 2 (первая декада июня), выращиваемой по нулевой обработке почвы. Площадь каждой делянки составила 48 м2, по-вторность 3-кратная. Посев пшеницы по нулевой технологии проводили сеялкой СПП- 2,1 с чизельными и дисковыми сошниками. В 2011 году изучали действие гербицидов на почвенные микроорганизмы на стационаре научного центра, где проводятся многолетние испытания регистрационных препаратов (срок закладки стационара 2000 г.), а также отрабатываются регламенты применения гербицидов и их баковых смесей. Сроки посева, норма высева и глубина заделки семян яровой пшеницы Астана 2 – рекомендованные для зоны южных карбонатных черноземов. В наших исследованиях испытывали следующие гербициды: Пума-супер, КЭ (феноксапроп-п-этил + антидот мефенпир-диэтил); Топик, КЭ (клодинафоп-пропаргил); Фокстрот, ВЭ (фенклоразол-этил + антидот мефенпир-диэтил); Мерит, МД (пироксулам); Эстет, КЭ (2,4-Д эфир); Гранстар, СТС (трибенурон-метил); Ди-камба, ВР (3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота); Дианат, ВР (дикамба); Аксиал, КЭ (пиноксаден + антидот клоквинтосет-мексил); 2,4-Д, ВР (2,4-дихлор-феноксиуксусная кислота), которые применяли в рекомендованных нормах расхода в течение 2-х лет (отбор почвенных проб осуществляли во второй год исследований): 1. Контроль 2. Пума-супер, КЭ - 0,9 л/га 3. Фокстрот, ВЭ - 0,45 л/га 4. 2,4- Д, ВР - 1,0 л/га 5. Эстет, КЭ - 0,6 л/га + 2,4-Д, ВР - 1,0 л/га 6. 2,4-Д, ВР - 1,0 л/га + Дикамба, ВР - 0,7 л/га 7. Дианат, ВР - 0,3 л/га 8. Гранстар, СТС - 20 г/га + Тренд, ВР - 0,5 л/га 9. Аксиал, КЭ - 0,75 л/га 10. Топик, КЭ - 0,4 л/га 11. Мерит, МД - 0,45 л/га Опрыскивание гербицидами производили во время ранней фазы роста сорняков, в фазе пшеницы 2-4 листа посевы обрабатывали гербицидами с помощью ранцевого опрыскивателя. Площадь каждой делянки 215 м2 по-вторность 3-кратная. В 2012 году в хозяйстве КХ «Викторовка» Зерендинского района Акмолинской области на производственных посевах была отобрана партия образцов для изучения последействия гербицидов на численность почвенных микроорганизмов. Необходимость проведения обследований была обусловлена тем, что на полях в течение 2-х лет после обработки пестицидами появились участки, на которых отсутствовала всякая растительность. Эти образцы сравнивали с почвой других участков, где такого эффекта не наблюдали. В посевах пшеницы использовались следующие препараты: Раундап, ВР (глифосат), Эстер, КЭ (2,4-дихлофеноксиуксусная кислота); Пантера, КЭ (хи-залофор-п-тефурил); Гранстар, СТС (трибенурон-метил + ПАВ Тренд); Эс-терон, КЭ (2,4-Д); Эверест, ВДГ (флукарбазон-флутразалон). Площадь производственных полей варьировала от 100 до 400 га. Внесение препаратов проводилось опрыскивателем ОП – 2000. Опыт №1 1. Контроль (100 м2) 2. Раундап, ВР (3,0 л/га) перед посевом (100 га) 3. Раундап, ВР (3,0 л/га) перед посевом, Эстерон, КЭ (0,8 л/га) по вегетации (130 га) 4. Раундап, ВР (3,0 л/га) перед посевом, Эстерон, КЭ (0,8 л/га) + Панте ра, КЭ (1,0 л/га) по вегетации (100 га) Опыт №2 1. Контроль (100 м2) 2. Раундап, ВР (1,2 л/га) перед посевом, Эстер, КЭ (1,5 л/га), Гранстар, СТС (10 г/га + ПАВ Тренд 0,15 л/га), Эверест, ВДГ (0,028 кг/га) по вегетации (400 га) 3. Раундап, ВР (1,0 л/га) перед посевом, Эстер, КЭ (0,8 л/га), Гранстар, СТС (10 г/га + ПАВ Тренд 0,15 л/га) по вегетации (300 га) Опыт №3 1. Контроль (100 м2) 2. Топик, КЭ (0,3 л/га) по вегетации (200 га) 3. Эстерон, КЭ (0,6 л/га) + Топик, КЭ (0,8 л/га) по вегетации (240 га) В качестве контрольного участка использовалась защитная полоса, где не проводилось внесение гербицидов. Яровая пшеница высевалась в оптимальные сроки сеялкой СЗС-2,1 с нормой высева 2,8-3,0 млн. всхожих зерен на 1 га посевной площади. Глубина заделки семян 3 см.
Отбор почвенных проб для последующего микробиологического анализа проводили во второй декаде июня, на 7-ой день после применения препаратов в деляночных и стационарных опытах, т.к. в это время токсическое действие гербицидов на микроорганизмы почвы, как правило, проявляется максимально, поскольку они не успевают за этот период значительно разложиться под воздействием абиотических факторов (температура, влажность, осадки) (Банкина, 2002). В производственных условиях почву отбирали на 60-е сутки после обработки гербицидами, в третьей декаде июля. Определяли также и остаточные количества пестицидов в отобранной почве.
Поиск тест-объектов из представителей рода Bacillus для оценки влияния гербицидов на почву
С целью поиска тест-объектов для оценки состояния почвы под воздействием химических средств защиты растений определяли чувствительность микроорганизмов к новым регистрационным препаратам (Эльф, КЭ, Стриг, ВР, и Клинч, КЭ), а также к гербицидам, которые уже применяются на территории Казахстана (Топик, КЭ и Виллан-супер, КЭ) . Для этого использовали готовые штаммы почвенных микроорганизмов (из коллекции лаборатории), выделенные из черноземных почв Северного Казахстана и идентифицированные по определителю Берджи (Хоулт и др., 1997) – B. megaterium, B. mycoides.
В эксперименте была выдвинута гипотеза, что почвенные бактерии – B. megaterium, B. mycoides – хорошо откликаются уже на минимальные рекомендованные нормы расхода гербицидов, и в дальнейшем могут служить индикаторами пестицидной нагрузки в микробоценозе почв Северного Казахстана. Штаммы бактерий высевали на элективный агар Чапека-Докса. Следует отметить, что при высоком содержании азотного и углеродного питания, обеспечивающих максимальный рост бактериальной колонии, может происходить подавление индукции спорообразования. Этому способствует ограничение доступа кислорода и изменение реакции среды, в результате чего даже в случаях, неблагоприятных для роста колонии, не происходит сильного спорообразования (Введение…, 1974). Предварительно агаризованную среду нагревали до жидкого состояния, остужали до 40С, разливали в чашки Петри и вводили препарат в каждую чашку с таким расчетом, чтобы конечная его концентрация соответствовала указанным дозировкам (табл. 4). С этой целью рассчитывали площадь чашки Петри и делали пересчет с литров на гектар, на микролитры на сантиметр квадратный (л/га на мкл/см2). Для того чтобы точно можно было ввести концен трацию гербицида использовали специальный микрогазовый шприц (Hamilton) общим объемом 10 микролитров.
Инкубация штаммов проходила при температуре 28С. После инкубирования на 3-и и 8-е сутки проводили замер диаметра колонии и сравнивали его с контрольным вариантом, тем самым определяя стимулирующее или ингиби-рующее действие на ее рост. Определение диаметра колонии бактерии проводилась визуально, с помощью миллиметровой линейки. Повторность опыта 4-кратная. По изменению диаметра колоний на плотных питательных средах, содержащих те или иные вещества можно судить о влиянии последних на различные виды бактерий (Патент РФ № 2410437).
Исследования проводили в лабораторных условиях в 2010 г. На экспериментальных участках, где закладывались полевые опыты с препаратами Дезормон-эфир, КЭ, Барс-супер, КЭ, Итарр, КЭ, Виллан-супер, КЭ, Авестар, КЭ, методом разведения был выделен фитопатогенный гриб Fusarium oxyspo-rum на среде Чапека-Докса, и целлюлозоразрушающий микроорганизм Tri-choderma lignorum – на среде Гетчинсона. Для получения чистой культуры грибов F. oxysporum и T. lignorum бактериологической петлей, предварительно обожженной на спиртовой горелке, отбирали кусочек мицелия из чашек Петри (где велся учет по численности и составу микроорганизмов) и вносили на агаризованную среду Чапека-Докса, а затем путем отсева выделяли чистую культуру. Предварительно перед высевом чистых штаммов грибов в колбы с ага-ризованной питательной средой М9, содержащей в 1 литре: Na2HPO4 – 6 г, KH2PO4 – 3 г, NaCl – 0,5 г, NH4Cl – 1 г, глюкоза – 15, агар – 12 г на 1 л, нагретой до жидкого состояния, вносили гербициды с помощью микрогазового шприца Hamilton с таким расчетом, чтобы конечная его концентрация соответствовала указанным дозировкам. Подготовленные среды разливали в чашки Петри, затем после того, как они остывали, изучаемые кусочки мице-лиев грибов вносили на поверхность плотной питательной среды М9. Чашки с посевами культивировали в термостате при температуре +28С в течение 8 суток. Контролем служила питательная среда М9 с чистыми культурами без гербицидов. Опыт закладывали в 4-кратной повторности (Ксенофонтова, 2004). После инкубации оценивали диаметр колонии грибов путем периодического замера в двух взаимоперпендикулярных направлениях в четырех проворностях на третьи и восьмые сутки и, сравнивали его с контрольным вариантом (Паников, 1991). Поиск потенциальных микроорганизмов-деструкторов проводили на агаризованной питательной среде М 9. Изучали препараты Топик, КЭ, Виллан-супер, КЭ, Клинч, КЭ, Стриг, ВР, Эльф, КЭ. Данные препараты являлись регистрационными, и фирма – дистрибьютер пестицидов рекомендовала к использованию с нормами расхода, приведенными в таблице 4, причем препараты Стриг, ВР, Эльф, КЭ, Клинч, КЭ были новыми и использовались впервые, для дальнейшей регистрации. Однако нами, исходя из целей и задач исследований, изучался более широкий диапазон концентраций действующих веществ для выявления возможного отклика изучаемых объектов на внесение препаратов в питательную среду.
Некоторые особенности воздействия гербицидов на почвенную микрофлору в длительных стационарных опытах
В опытах с многолетним использованием препаратов в рекомендованных нормах расхода наблюдали повышение численности изучаемых групп почвенных микроорганизмов практически на всех гербицидных вариантах (табл. 8). Так, численность бактерий, усваивающих органические формы азота, повышалась при применении гербицидов 2,4-Д и Дианат, ВР по сравнению с контролем на 50%. На вариантах с использованием Аксиала, КЭ и Дианата, ВР количество бактерий, потребляющих неорганический азот, воз росло в 2 и 3 раза соответственно. На контрольном варианте соотношение численности бактерий, усваивающих неорганические и органические формы азота, составило 1,2. Максимальное соотношение КАА/МПА было зафиксировано на вариантах с препаратами Дианат, ВР, Мерит, МД, Аксиал, КЭ (КАА/МПА = 2,4; 2,3 и 2,0 соответственно). На остальных гербицидных вариантах этот коэффициент варьировал от 1,0 (2,4-Д + Дикамба) до 1,6 (Пума-супер). На южном карбонатном черноземе явное преимущество численности бактерий на среде с минеральным азотом свидетельствует о более активно идущих процессах минерализации в почве (Мишустин, Рунов, 1957; Кашинская, 1975). Аналогичная положительная динамика роста нами была отмечена при изучении почвенных грибов. В среднем по опыту их количество при применении гербицидов по сравнению с контролем возросло в 1,3 раза. Среди них можно выделить гербицидный вариант с баковой смесью Гранстар, СТС + ПАВ Тренд и препарат 2,4-Д, где численность почвенных грибов была максимальна и превысила контрольный уровень в 2,5 раза. Численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов возросла практически на всех вариантах в 2,2 раза, лишь на варианте с Топиком, КЭ она была ниже контрольного уровня. Увеличение численности целлюлозо-литических микроорганизмов, отмеченное в июле, на наш взгляд, было еще обусловлено благоприятными температурными условиями, когда активно шел процесс гумификации почвы. Среди препаратов, применение которых в длительных стационарных опытах приводило к повышению численности бактерий, ассимилирующих органические формы азота, следует выделить гербициды на основе 2,4-Д и дикамбы. Интересно отметить, что их применение в баковой смеси оказывало меньшее воздействие на эти микроорганизмы. Аналогичная высокая численность микроорганизмов, усваивающих неорганические формы азота, была зафиксирована на вариантах с этими же препаратами.
Нами отмечена следующая группа химических веществ, при воздействии которых численность почвенных грибов превышала контроль в два и более раз: феноксапроп-п-этил, 100 г/л + антидот клоквинтоцет-мексил, 23 г/л, 2,4-Д, трибенурон-метил, 750 г/кг + ПАВ Тренд, 0,15 л/га и пиноксаден, 45 г/л. Среди препаратов, применение которых приводило к повышению численности целлюлозоразрушающих микроорганизмов в 2 раза по сравнению с контролем, выделились: феноксапроп-п-этил, 100 г/л + клоквинтоцет-мексил, 23 г/л, препарат на основе 2,4-Д и баковая смесь его с дикамбой, 480 г/л, три-бенурон – метил, 750 г/л + ПАВ Тренд и пиноксаден, 45 г/л. Единственное вещество, которое снижало численность данной группы микроорганизмов, был клодинафоп-пропаргил, 80 г/л, который в отличие от других изучаемых препаратов, незначительно стимулировало рост обеих групп бактерий и почвенных грибов. Такое воздействие гербицидов в длительном стационарном опыте было вызвано, на наш взгляд, тем, что микроорганизмы, вероятно, постепенно адаптировались к воздействию различных гербицидов. Таким образом, можно предположить, что длительное использование химических препаратов приводит к изменению видового состава микробоценоза чернозема южного карбонатного Северного Казахстана. Как известно, современные пестициды достаточно быстро разлагаются в почве, тем не менее, их последействие может продолжаться в течение нескольких лет (Бурхан, 2010). В настоящее время одним из основных способов экологического мониторинга пестицидов является определение их остаточных количеств (Ананьева, 2001). Проведенный нами токсикологический анализ почв на содержание предельно-допустимых концентраций (ПДК) одного из самых распространенных гербицидов – глифосата – показал, что его остаточные количества в зависимости от варианта варьировали от 0,142 до 0,222 мг/кг (табл. 9). Таким образом, на варианте с гербицидом Раундап, ВР остаточное количество действующего вещества, не превышало предельно-допустимых концентраций в почве. Согласно О.Ф. Филенко (2013), присутствие множества токсикантов, даже в концентрациях, не превышающих ПДК, может порождать биологические эффекты, которые невозможно предсказать на основе частных химических определений. По мнению М.Г. Жарикова и др. (2010), при многолетнем использовании гербицидов на основе глифосата может происходить изменение структуры микробного сообщества. Поэтому, несмотря на низкие показатели остаточных количеств этого препарата в почве, нами были отобраны образцы почв на производственных полях (КХ «Викторовка») при многолетнем широкомасштабном применении гербицидов, для изучения их воздействия на почвенные микроорганизмы.
Если же по фону применения Раундапа, ВР вегетирующую пшеницу обрабатывали гербицидом Эстерон, КЭ, количество бактерий, растущих на МПА, снизилось практически на 40%, а растущих на КАА – на 30%. Еще большее подавление бактерий, потребляющих органический и минеральный азот, а именно снижение численности в 2 раза, наблюдали в случае, когда по вегетации посевы опрыскивали еще и гербицидом Пантера, КЭ. Уменьшение численности данной группы микроорганизмов является отрицательным фактором, так как они способствуют переводу элементов питания в доступную для растений форму.
Следует отметить достаточно высокое значение коэффициента минерализации на контрольном варианте – 3,8, что, на наш взгляд, связано с интенсивными обработками почвы. Применение гербицидов в производственных условиях увеличивало соотношение бактерий, растущих на средах КАА и МПА, на варианте с применением Раундапа, ВР в 1,2 раза, при дополнительном использовании Эстерона, КЭ – в 1,3, Эстерона, КЭ и Пантеры, КЭ – в 1,1 раза выше контрольного уровня. Судя по соотношению КАА/МПА, на всех вариантах преобладают процессы минерализации азота.
Другую картину наблюдали при учете количества почвенных грибов. Их численность на контроле составила 7,0±0,35 тыс./г почвы. Применение Раун-дапа, ВР в рекомендованной норме увеличило количество почвенных грибов почти в 4 раза. При увеличении пестицидной нагрузки их численность возросла в 2,5 и в 1,5 раза по сравнению с контролем. В нашем опыте применение глифосата без дополнительного использования гербицидов приводило к максимальному увеличению численности почвенных грибов по отношению к контролю.
