Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
1. Производные адамантанового ряда 7
1.1 Синтез производных адамантана 7
1.2. Фармакологические свойства адамантана 12
1.3. Устройство вириона вируса гриппа А. Протон-проводящий канал М2 17
2. Аминофосфоновые и аминофосфиновые кислоты. 26
2.1. Химия аминофосфоновых и аминофосфиновых кислот 27
2.2. Биологическая активность аминофосфоновых и аминофосфиновых кислот 32
3. Синтетические пептиды из «шарнирной» области иммуноглобулинов 34
4. Методы получения амидов. 40
4.1. Амидирование карбоновых кислот 40
4.2. Методы синтеза амидов аминокислот и пептидов 41
4.3. Противовирусная активность амидов пептидов в отношении ВИЧ-1 43
ГЛАВА II. Обсуждение результатов 50
1. Подходы к проблеме преодоления резистентности вирусов гриппа А к препаратам адамантанового ряда. 50
1.1. Производные аминоадамантанов (ремантадина и амантадина) 52
1.2. Производные адамантанкарбоновых кислот 61
1.3. Производные адамантандикарбоновых кислот 65
2. Пептиды, содержащие -аминофосфиновые кислоты, и их противовирусные и иммуностимулирующие свойства. 68
2.1. Интерферониндуцирующая активность фосфопептидов 70
2.2. Противовирусная активность фосфодипептидов 71
3. «Шарнирная» область иммуноглобулинов как потенциальный источник противовирусных пептидов 72
3.1. Синтез гептапептидного фрагмента IgG 1 человека 73
3.2. Биологические свойства синтетического гептапептида 78
4. Исследование цитотоксического действия амидов пептидов и их испытание на анти-ВИЧ активность 79
ГЛАВА III. Экспериментальная часть 82
1. Синтез производных адамантана 82
2. Синтез фосфодипептидов 88
3. Синтез амидов ди- и трипептидов 90
4. Синтез гептапептида HClH-Cys(StBu)-Pro-Ala-Pro-Glu-Leu-Phe-OEt 94
Выводы 99
Приложения (масс-спектры наиболее активных соединений) 100
Список литературы 109
- Устройство вириона вируса гриппа А. Протон-проводящий канал М2
- Противовирусная активность амидов пептидов в отношении ВИЧ-1
- Производные адамантандикарбоновых кислот
- Синтез амидов ди- и трипептидов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Важнейшей задачей современной науки является борьба с вирусными инфекциями, которая развивается в двух направлениях. Первое – поиск и создание химических препаратов, способных эффективно взаимодействовать непосредственно с вирусной частицей и тем самым ингибировать процесс ее репликации. Второе – поиск и создание нетоксичных веществ как природных, так и синтетических, способных активировать иммунную защиту организма, в частности за счет индукции интерферона.
Одной из актуальных проблем современной медицины является проблема гриппа. Ее сложность связана со способностью этих вирусов к легкой изменчивости структуры в результате мутаций, рекомбинаций и ассортации, приводящих к изменению биологических свойств.
Несмотря на всемирные усилия по созданию средств химиотерапии и вакцин пандемия 2009/2010 года, вызванная вирусом гриппа A(H1N1)pdm2009, показала как их крайнюю ограниченность, так и недостаточную эффективность. На сегодня имеется лишь два типа противогриппозных соединений - это производные сиаловой кислоты, являющиеся ингибиторами нейраминидазы (осельтамивир и занамивир), и производные адамантана (ремантадин и амантадин), которые ингибируют функцию протонпроводящего канала М2. У всех этих препаратов есть один существенный недостаток: в результате химического прессинга вирусные частицы, легко мутируя, приобретают устойчивость по отношению к ним. Так, к ранее достаточно эффективным препаратам адамантанового ряда у вирусов гриппа А в настоящее время выработалась практически 100%-ная резистентность.
Поэтому очень важна не только разработка новых антигрипппозных препаратов, но и изучение путей «реанимации» активности соединений, утративших свои противовирусные свойства. Объектом такого исследования является синтез новых производных адамантанового карбоцикла на основе ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот.
Вещества, способные стимулировать иммунную защиту организма, в частности индуцировать выработку интерферона, принадлежат к разным классам органических соединений, начиная от полифенола из масла хлопчатника (госсипол) и кончая пептидами из иммуноглобулинов (тафцин). Этих соединений довольно много, но лишь единицы из них рассматриваются как медикаментозные средства, что связано с их токсичностью.
Источниками нетоксичных иммуностимуляторов могут являться пептиды, содержащие аналоги природных аминокислот, такие как аминофосфиновые кислоты, а также пептидные фрагменты «шарнирной» области иммуноглобулинов класса G, которые легко выщепляются сериновыми протеазами. Такие синтетические пептиды будут представлять собой новый класс нетоксичных противовирусных соединений, подконтрольных иммунной системе организма.
Цели работы.
Исследование посвящено двум направлениям. Первое – преодоление резистентность вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2) в отношении соединений ремантадина и амантадина модификацией их аминокислотными, пептидными и другими остатками. Второе – поиск и синтез соединений пептидной природы, способных индуцировать иммунный ответ в организме.
Задачи исследования
-
Синтезировать аминокислотные, пептидные и другие производные ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот и исследовать их противовирусные свойства в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2).
-
Синтезировать новый тип потенциальных индукторов интерферона, включающих в свою структуру -аминофосфиновые кислоты, и исследовать их активность в отношении вируса энцефаломиокардита мышей.
-
В качестве потенциального противовирусного соединения синтезировать гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области IgG человека, включающий остатки пролина и дисульфидную связь, и исследовать его противовирусные свойства в отношении вируса гриппа А.
Научная новизна работы.
-
Впервые осуществлен синтез производных адамантана (ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот) с аминокислотными, пептидными и некоторыми другими остатками. Показано, что среди них есть ряд нетоксичных соединений, обладающих высокой противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию амантадина и ремантадина.
-
Осуществлен синтез дипептидов, включающих нетоксичные -аминофосфиновые кислоты. Впервые показано, что дипептиды, содержащие фосфоаланин, обладают способностью индуцировать интерферон.
-
По специально разработанной схеме синтеза был получен гептапептидный фрагмент из «шарнирной» области IgG человека, включающий дисульфидную связь, который обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009.
-
На основе испытания синтезированных амидов трипептидов, включающих остатки иминокислот и глицина, показано, что противовирусный эффект амида H–Gly-Pro-Gly-OH в отношении ВИЧ-1 может реализоваться только в животной сыворотке, а не в сыворотке человека.
Практическая значимость работы.
-
Среди синтезированных производных адамантана обнаружены нетоксичные соединения с высоким уровнем противовирусной активности в отношении вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), что указывает на практическую перспективность использования этих соединений для расширения ассортимента медикаментозных противогриппозных средств. Показано, что введение дополнительных функциональных групп в молекулу препарата, утратившего противовирусные свойства, является одним из путей преодоления резистентности вирусной инфекции к этому препарату.
-
Синтезированные оригинальные пептиды, включающие остатки -аминофосфиновых кислот, обладают иммуностимулирующими свойствами.
-
«Шарнирная» область иммуноглобулинов может быть источником иммуноактивных пептидов, которые представляют особую ценность в качестве нетоксичных противовирусных средств.
-
На примере N-ацилтрипептидов, включающих -иминокислоты, исследованы и найдены оптимальные условия процесса амидирования пептидов при наличии в них лабильных пептидных связей.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Синтезированные новые производные адамантанового карбоцикла способны подавлять репликацию вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), резистентных к действию ремантадина. Противовирусный эффект достигается введением в молекулы ремантадина, амантадина и адамантанкарбоновых кислот новых функциональных групп за счет аминокислотных, пептидных и других остатков.
-
Синтезированные фосфодипептиды, содержащие фосфиновый аналог аланина, способны индуцировать интерферон в высоком титре.
-
Разработанная оптимальная стратегия синтеза позволила получить гептапептид «шарнирной» области IgG человека, с хорошим выходом конечного продукта. Показано, что этот пептид обладает противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A(H1N1)pdm2009.
-
Найдено, что оптимальным способом амидирования эфиров трипептидов, содержащих лабильные пептидные связи между остатками глицина и иминокислот, является их взаимодействие с сухим аммиаком в условиях реакции смешанных ангидридов.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и опубликованы в материалах V Российского Симпозиума «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011) и на Международной научно-практической конференции «Синтез, выделение и изучение комплексных свойств новых биологически активных соединений» (г. Душанбе, Таджикский национальный университет, 2011). Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 28 сентября 2009 года.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 6 сообщений, из них в ведущих лицензированных научных журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией – 4. Опубликованы тезисы докладов на одной российской и одной международной конференциях. Зарегистрирована патентная заявка в ФСИС № 2011115151 от 19.04.2011г.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения экспериментального материала, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 120 источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и содержит 29 схем и 40 таблиц.
Устройство вириона вируса гриппа А. Протон-проводящий канал М2
Вирионы вирусов гриппа А имеют диаметр 120 нм и строение, типичное для семейства ортомиксовирусов (Ortomixoviridae). Вирусы гриппа имеют 4 антигена: два внутренних (белок RNP и M-белок) и два поверхностных (гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA)). Гемагглютинины суперкапсида являются основными поверхностными антигенами и могут быть представлены только одним из 16 типов гемагглютининов. Вирусы гриппа человека могут содержать гемагглютинины H1, H2 или H3, тогда как вирусы гриппа птиц и животных – от H1 до H16. Нейраминидаза на поверхности суперкапсида содержится в меньшем количестве, чем гемагглютинин, и так- же может быть представлена одним из 9 известных типов. Вирусы гриппа животных и птиц содержат один из типов нейраминидазы от N1 до N9, вирусы гриппа человека имеют только N1 или N2. Белки М2 выходят на поверхность суперкапсида, являясь третьей разновидностью его «шипов» (рис.2). Под суперкапсидом располагается два неструктурных белка –NS1 и NS2 (синоним NS2 – NEP – белок ядерного экспорта). Геном вируса гриппа А имеет длину 13,6 х 103 нуклеотидов и представлен 8 сегментами РНК. Каждый из восьми сегментов РНК замкнут в кольцо, и соединен с белками RNP, PB1, PB2 и PA. 7-ой и 8-ой сегменты РНК кодируют по два белка, остальные – по одному. Липиды и углеводы, входящие в состав липопротеинов и гликопротеидов суперкапсида, имеют клеточное происхождение.
Гемагглютинин (HA) является сложным гликопротеином, имеющим структуру тримера. Гемагглютинин индуцирует в организме образование вируснейтрализующих антител – антигемагглютининов, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Инфекционная активность вирусов гриппа в значительной мере определяется функциональной активностью гемагглютинина. Нейраминидаза (NA) является тетрамерерным гликопротеином. Нейраминидаза специфически отщепляет остаток сиаловой (N-ацетилнейраминовой) кислоты от полисахаридов мембраны, тем самым, разрушая рецепторы к вирусу на клетках организма-хозяина. Нейраминидаза разрушает -кето-связь между концевой N-ацетилнейраминовой кислотой и соседним углеводным остатком, обычно галактозой. Вирусный фермент демонстрирует некоторое «предпочтение» -23 связям [25]. Роль фермента, разрушающего рецепторы к вирусу, не ясна до конца. Предполагается, что активность нейраминидазы помогает вирусным частицам проникать через секреты слизистых, богатых сиаловой кислотой, для достижения вирионами клеток-мишеней эпителия дыхательных путей [26]. Также экспериментально подтверждена роль фермента в облегчении высвобождения вновь образованных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток, где те могут агрегироваться в результате взаимодействия вирусного гемагглютинина с сиаловой кислотой на мембране клетки [27].
Протон-проводящий канал М2. Данные кристаллографических исследований показывают, что белок М2 содержит 4 одинаковые субъединицы, образующие тетрамер, расположенный в мембране вируса. Эти субъединицы частично спирализованы в левозакрученные -спирали. Матриксный белок М2 длиной 97 аминокислотных остатков подразделяют на три домена: внешний N-концевой (1-23), трансмембранный (24-44) и цитоплазматический (45-97) [28, 29]. Основная функция этого белка нагнетание протонов внутрь вириона.
Хун Мэй и соавт. [30] и Чжоу Хуань-Сян и соавт. [31], исследуя жизнедеятельность вируса гриппа А на атомарном уровне, разобрались в механизме работы мембранного протонного канала, который необходим для размножения вируса в клетке хозяина. Инфицирование начинается с присоединения вирусной частицы к клетке хозяина, затем клетка затягивает вирус внутрь. Проникнув в клетку, вирус начинает размножаться. Сначала на мембране вирусной частицы открывается канал, через который внутрь вируса поступают протоны. Повышая кислотность внутренней среды, вирус запускает процесс, который высвобождает в клетку генетический материал. А затем, используя ферментные системы хозяина, вирус многократно размножает свой геном.
Нормальное функционирование канала во многом осуществляется за счет аминокислотных остатков трансмембранной области белка Val(27), Ala(30), Ser(31), Gly(34), His(37) и Trp(41). Эти аминокислотные остатки, структурно находясь внутри канала М2, обеспечивают ионный транспорт и его регуляцию (рис.3).
Строение трансмембранного домена белка М2 было детально изучено. Оказалось, что ключевым элементом работы протонного канала служит аминокислота гистидин в 37м положении (His37). Остатки гистидина из четырех белковых цепей объединяются в виде тетрамерамерного сопряжения их имидозольных колец. При высоком рН (в щелочной среде) это соединение имидозольных колец гистидинов неподвижно, а при низком рН (в кислой среде) оно изменяет конфигурацию из-за того, что остатки гистидина меняют свою ориентацию на 45 градусов. Поставщиками протонов из клетки-хозяина служат ионы Н3О+. Они подходят к кольцу имидозольного сопряжения и соединяются водородными связями с атомом азота в имидозольном кольце гистидинов, а при изменении конфигурации кольца переходят во внутреннее пространство вирусной частицы [32]. Такая трансформация происходит со скоростью 50 тысяч раз в секунду. Это рабочее состояние для перемещения протонов внутрь вириона.
Индольная группа остатка Trp(41) также вовлечена в процесс транспорта водорода через канал. Четыре плотно упакованных трансмембранных спирали образуют узкий канал, в котором остатки триптофана закрывают пору канала. Понижение pH-фактора дестабилизирует трансмембранную винтовую упаковку, и изменяет расположение остатков триптофана (Trp41), тем самым открывая канал для прохода протонов. А толчком для изменения положения остатков триптофана, как показано, является электростатический скачок, вызванный четырьмя остатками гистидина (His37).
В процессе функционирования протонного канала прокачка протонов происходит через ряд промежуточных конформаций пары His37 - Trp41, называемых ротамерами. Эти положения характеризуются определенным набором торсионных углов, которые приводят пору канала в закрытое состояние (блокировка транспорта протонов) или в открытое состояние, т.е. протонной проводимости (рис.4). При этом межцепочечное расстояние между индольными группами (Trp41) внутри канала остается в значительной степени неизменным на уровне 11 для нейтральной и кислой рН. Предлагается модель, в которой углы ротамера для остатков триптофана и гистидина составляют t -160 и t 90 , и имидазольные кольца His37 расположены близко от индольных колец Trp41. Таким образом, когда pH на входе в канал (наружный) низкий, а внутри канала pH высокий, индольные кольца предотвращают проход протонов. Имидозольные кольца (His37) закрывают пору либо путем формирования димеров имидазол-имидазолия, либо стерически.
Когда pH внутри канала низкий, а снаружи высокий, протоны из окружающей среды (внутриклеточной), проникая с N-конца белка М2, могут протонировать все четыре имидазольных кольца гистидинов. Хотя в основном придерживаются теории, что для электростатического скачка достаточно протонировать три из четырех остатков гистидина в положении 37. Конформационное изменение остатков гистидина после протонирования имидозольных колец является результатом электростатического отталкивания, что открывает сужение канала в районе His37 и пропускает протоны внутрь. Конформационный скачок снимает избыточный заряд ионов имидазолия, и гистидины возвращаются в нейтральное состояние [33].
Противовирусная активность амидов пептидов в отношении ВИЧ-1
С точки зрения удобства, а также для увеличения выхода продукта реакции иногда целесообразно проводить аммонолиз без предварительной кристаллизации или очистки промежуточного ацилированного эфира. В тех случаях, когда исходный эфир ограниченно растворим в метанольном растворе аммиака или не подвергается аммонолизу в этой среде, иногда оказывается более плодотворным использование других систем, таких как этанольный раствор аммиака или жидкий аммиак. Хотя скорость реакции аммонолиза значительно возрастает с повышением температуры, в этих условиях заметно увеличивается опасность расщепления пептидных связей в случае их наличия. Относительные скорости аммонолиза различных ацилированных эфиров во многом зависят от степени стерического экранирования, обусловленного боковой цепью С– концевого аминокислотного остатка, а в случае эфиров ациламинокислот N-ацильным блокирующим заместителем. Так, например, когда боковая цепь аминокислотного остатка относительно мало экранирует сложноэфирную группу (в глицине или в аланине), соответствующий эфир оказывается более чувствительным к действию аммиака; обратная картина наблюдается в случае сильно экранированных производных валина и изолейцина. Наконец, значительная устойчивость к действию аммиака, обычно проявляемая эфирами N-тритилированных аминокислот, не имеет места в соответствующих N-бензилоксикарбонилпроизводных, которые обладают менее объемным N-ацильным заместителем.
Амиды ациламинокислот и в ряде случаев ацилпептидов могут быть получены методами, изложенными выше, но поскольку N-защитные трифторацетильная и фталиьная группы легко отщепляются в присутствии аммиака, амиды, содержащие указанные группы, не могут быть получены аммонолизом соответствующих ацилированных эфиров; в таких случаях амиды пептидов синтезируются путем реакции ациламинокислоты с амидом другой аминокислоты с использованием подходящего метода конденсации.
Амиды N-тритиламинокислот могут быть получены конденсацией соответствующей тритиламинокислоты с амином с помощью DCC. Хотя аммонолиз эфиров бензилоксикарбониламинокислот и пептидов, как правило, протекает гладко с образованием соответствующих амидов (XVII), иногда все же возможны осложнения. Так, Фрутон и Бергман [96] при попытке получить амид бензилоксикарбонил-L-фенилаланилглицина (XVII; R=C6H5CH2) (Схема 22) путем обработки этилового эфира соответствующего ацилпептида (XVIII) метанольным раствором аммиака выделили амид 5-бензилгидантоин-3-уксусной кислоты (XVIX; R=C6H5CH2). Аналогичное явление наблюдалось Деккером, Тейлором и Фруматоном [97] при их попытке превратить этиловый эфир бензилоксикарбонил-L-лейцилглицина (XVIII; R=(CH3)2CHCH2) и этиловый эфир бензилоксикарбонил-L-метионилглицина (XVIII; R=CH3SCH2CH2) в соответствующие амиды. Такого рода реакции, протекающие с отщеплением бензилового спирта (XX), во многом напоминают превращение этилового эфира бензилоксикарбонил-глицил-глицина под действием щелочи в карбонил-бис-глицин с образованием в качестве промежуточного продукта гидантоин-3-уксусной кислоты. Однако большой экспериментальный материал свидетельствуют о том, что аммонолиз эфиров ациламинокислот и ацилпептидов, за исключением отмеченных случаев, протекает, как правило, с образованием соответствующих амидов. Исследованиями последних лет показано, что ряд амидов пептидов может обладать противовирусной активностью [98].
К настоящему времени в мире имеются соединения, угнетающие обратную транскриптазу, ВИЧ-протеазу, вирусную РНК-полимеразу и др. Однако установлено, что в процессе лечения ВИЧ-положительных пациентов наступает адаптация вируса к действию того или иного препарата [99]. В результате растущая у вирусов лекарственная устойчивость делает противовирусные препараты малоэффективными по отношению к процессам ингибирования репликации [100]. Ситуация осложняется тем, что все лекарства применяемые сегодня, проявляют побочные эффекты и зачастую являются опасными для организма человека [101]. Таким образом, существует потребность в нетоксичных препаратах с малыми побочными эффектами, способных ингибировать ВИЧ-1 на других этапах в репликационном цикле, нежели те, что существуют сегодня. Другими словами, нужна новая форма действия, иной подход к подавлению развития вируса.
Слияние вирусной и клеточной мембран является ключевым механизмом, обеспечивающим последующее попадание генетического материала вируса в ядро клетки. Для ВИЧ-1 общепризнано, что основным механизмом проникновения в клетки-мишени является связывание оболочечного вирусного гликопротеида gp120 с клеточным рецептором CD4. Этому взаимодействию способствуют дополнительные белки - корецепторы - CCR5 и CXCR4. Инфицируя CD4-лимфоциты, ВИЧ осуществляет ряд превращений, в результате которых происходит его размножение и гибель клетки-хозяина.
Недавно было показало [102, 103], что синтетические пептиды длиной в шесть аминокислот, содержащиеся в третьей гипервариабильной области V3-петли ВИЧ-1 гликопротеида gp120, ингибируют ВИЧ-1 инфекцию в человеческих клетках. Принципиальная нейтрализующая детерминанта вируса ВИЧ-1 находится в наружной оболочке белка gp120 и включает 24 аминокислотных остатка. В работе [103] показано, что удаление данной последовательности приводит к неспособности оболочки вызывать образование нейтрализующих антител. В исследовании использовали синтетический пептидный фрагмент RP135 (рис. 10), и нейтрализующая детерминанта из этого пептида (8 аминокислотных остатков) вызывает образование нейтрализующих антител. Эта последовательность содержит в центре трипептид Gly-Pro-Gly. Указанный фрагмент постоянен для различных изолятов ВИЧ-1, а граничащие аминокислоты различаются от изолята к изоляту. Антитела, вызванные пептидом из одного изолята, не нейтрализуют другой изолят, а гибридный пептид вызывает нейтрализующие антитела к обоим изолятам. Использование смеси пептидов этого домена или смеси некоторых гибридных пептидов, вызывало образование специфических нейтрализующих антител. Это является признаком того, что детерминанта, возможно, будет подавлять инфекцию.
Производные адамантандикарбоновых кислот
После омыления сложноэфирных групп в соединении 58 получили соединение 59, которое оказалось неактивным в отношении вируса гриппа А. Необычной модификацией функциональных групп производных адамантана была замена карбоксильной группы аминокислоты на фосфиновую группировку. Так, взаимодействием сукцинимидного эфира 1-адамантановой кислоты с натриевой солью фосфоаланина с выходом 60% получили соединение 61. Однако его противовирусная активность была невысока (27-39%).
В таблице 19 представлены соединения из таблиц 2-18, способные с разной степенью эффективности ингибировать вирусы гриппа A(H1N1)pdm2009 и А(H2N3) и результаты цитопатического действия этих соединений на культуру клеток MDCK. Изучение противовирусной активности проводили при нагрузке препарата 5 мкг/мл. Представленный в таблице процент ингибирования соединений является средним арифметическим из опытов в аналогичных условиях.
Полученные результаты (табл. 2-18) позволяют считать, что адамантановый цикл в качестве мембранотропного носителя способен транспортировать функционально активные группы к белку М2 вирусов гриппа A(H1N1)pdm2009 и A(H3N2), а такие соединения как (Boc)2-Orn-Rem (16В), Boc-Sar-Rem (8В), TOA-Rem (34), H-His-Rem (26), Ad-(CH2-Ser-OMe)2 (60), Hau-Rem (35) могут представлять практический интерес в качестве перспективных противовирусных средств. 2. Пептиды, содержащие -аминофосфиновые кислоты, и их противовирусные и иммуностимулирующие свойства. В настоящее время известно большое количество природных и неприродных соединений, способных воздействовать на иммунную систему. Диапазон этих структур велик, начиная от полифенола госсипола из семян хлопчатника и кончая пептидами, извлекаемыми из иммуноглобулинов. Среди последних особое место занимают пептиды, способные индуцировать интерферон. Например, тетрапептид тафцин (Hre-Lys-Pro-Arg-OH) инициирует фагоцитарную активность, а тетрапептид регин (H-Gly-Gln-Pro-Arg-OH) индуцирует экспрессию дифференцировочных рецепторов на лимфоцитах. Особый интерес представляет семейство природных и синтетических фосфорных аналогов аминокислот, в том числе и большая группа соединений, относящихся к аминофосфиновым (b) и аминофосфоновым (c) кислотам, являющимся аналогами соответствующих аминокислот (a), у которых карбоксильная группа заменена на фосфиновую или фосфоновую. Фосфиновая группа при определенных условиях превращается в двухосновную фосфоновую, которая заметно отличается размерами, геометрией и кислотностью. Существует представление о прямом структурном подобии аминофосфонатов (c) природным аминокислотам. Вместе с тем строение фосфонатов (c) позволяет рассматривать их как стабильные аналоги лабильных переходных состояний. Модификация фосфонатного фрагмента с заменой гидроксильной группы на водород вызывает кардинальные изменения базовых биохимических характеристик фосфоаналогов. Изучение биологической активности этих аналогов показало, что они способны подобно аминокислотам к транспорту через стенки микробов. Биологическая активность фосфинатов (b) оказалась связанной с их способностью к субстратным превращениям и образованию новых фосфорорганических соединений. Таким образом, аминоалкилфосфинаты (b) могут рассматриваться как изостеры природных аминокислот и являться химическими инструментами для энзимологических исследований. Однако до настоящего времени не было систематического изучения их свойств в качестве элементов воздействия на иммунную систему ни в роли противовирусных средств, ни в качестве индукторов интерферона. Попадая в систему сложных биохимических процессов, эти соединения могут оказывать на них сильное влияние, в том числе и на функционирование иммунной системы. Широта использования -аминофосфиновых кислот напрямую зависела от доступности их получения, и после того как в 1978 году Р.М. Хомутовым и соавт. был разработан метод их получения путем взаимодействия оксима и фосфорноватистой кислоты по схеме 15 (см. стр.28), они нашли различное применение. Этот способ получения аминофосфонистых кислот может иметь и препаративное значение, учитывая доступность исходных компонентов, простоту методики и высокие выходы аминофосфинатов. Вначале было важно выяснить токсичность для клетки четырех аминофосфиновых кислот: H-GlyPH, H-AlaPH, H-ValPH, H-LeuPH. В тесте была использована перевиваемая культура лимфобластоидных клеток МТ4 (Рис. 16). Из представленной диаграммы (рис. 16) легко видеть, что a-аминофосфонистые кислоты не проявляют токсичности в клетках в концентрациях до 750 мг/мл. И даже при 1000 мг/мл токсический эффект не слишком велик. Для дальнейшего синтеза был выбран фосфорный аналог аланина. Синтез пептидов, включающих остаток фосфоаланина, осуществляется методом активированных эфиров, исходя из Boc-аминокислот и фосфоаланина в воднодно-диоксановой среде с последующим отщеплением защитной Boc-группы HCl в этилацетате по схеме 25. Продукт реакции загрязнен (Boc)2-Lys-OH и фосфоаланином (H-AlaPH), не вступившим в реакцию. Очистку проводят хроматографией на селикагеле (100/160) в системе элюента метанол-хлороформ (15:60). Полученные фосфодипептиды H-Lys-AlaPH и H-Pro-AlaPH исследовались на способность индуцировать интерферон в милимолярных концентрациях. Изучение иммуномодулирующих свойств проводили in vitro через 5, 24 и 48 часов после индукции лимфоцитов периферической крови. Исследование индукции интерферона in vivo проводили на белых лабораторных мышах. Для этой цели мышам внутрибрюшинно вводили дипептид H-Pro-AlaPH однократно в дозах 0,5; 1,0 мг/кг массы. Титр интерферона определяли в сыворотке крови через 5, 24 и 48 часов после введения дипептида. В качестве референс-индуктора применяли ридостин. Дипептид H-Pro-AlaPH индуцировал синтез позднего интерферона при обеих примененных дозах (320 и 160 ед/мл) на уровне ридостина (табл. 20). Изучение противовирусных свойств проводили in vivo при смертельной экспериментальной инфекции мышей, вызванной вирусом энцефаломиокардита мышей (ЕМС), а также in vitro на вирусе ВИЧ-1 BRU, предоставленном профессором Л.Монтанье (Ин-т Пастера, Франция) и на вирусе гриппа А(H1N1)pdm09. Для исследования in vivo были использованы теже пептиды H-Lys-Ala-PH и H-Pro-Ala-PH. Исследуемые соединения вводили мышам внутрибрюшинно однократно в дозах 0,5; 1 и 10 мкг/кг за 24 часа до заражения. Полученные данные представлены в таблице 21.
Синтез амидов ди- и трипептидов
Биологическая активность производных адамантана обусловлена значительной липофильностью жёсткого углеводородного каркаса, что позволяет им легко проникать через биологические мембраны [12]. Введение в молекулы различных биологически активных соединений адамантильного радикала в значительной мере модифицирует их фармакологическое действие. Таким образом, была модифицирована структура ряда антимикробных, противоопухолевых, иммунодепрессивных, гормональных, анальгетических, противовоспалительных, нейротропных средств. Адамантановый цикл, введенный в молекулу действующего вещества, может увеличить продолжительность фармакологического действия препарата. Так, введение радикала адамантила в 1--D-арабинофуранозилцитозин привело к пролонгированию эффекта исходного соединения. При этом молекулярный механизм действия этого вещества не изменяется, так как для проявления им цитостатической активности требуется гидролиз и освобождение от адамантана. Присоединение адамантильного радикала к пуриновому антиметаболиту 6- тиоинозину также усилило иммуносупрессивную активность производного по сравнению с исходным соединением [12]. Предполагают, что изменение биологической активности связано с изменениями пространственного строения, гидрофобности и липофильности соединений, создающими более благоприятные условия для их транспорта через биологические мембраны [9]. С помощью метода спиновых меток было показано, что адамантан, попадая в липидный бислой, способен разрушать гексагональную упаковку метиленовых группировок, характерную для двойного слоя фосфолипидов, и нарушать осевое расположение алкильных цепей фосфолипидов, модифицируя тем самым функциональные свойства клеточных мембран [13].
На данный момент синтезировано более 1000 новых производных адамантана. Фармакологические исследования показали наличие среди них веществ, обладающих выраженной психотропной, курареподобной (препараты для расслабления скелетной мускулатуры), иммунотропной, противовирусной, антикаталептической, противоаллергической активностями, а также соединений, влияющих на ферментативную систему печени [14].
Соединения, содержащие субъединицы адамантана, уже давно представляют интерес для медицинской химии и фармакологии. Некоторые адамантансодержащие соединения могут гораздо лучше проникать в клетки, а также позволяют усовершенствовать способность проникновения сквозь гематоэнцефалический барьер и увеличить накопление этих соединений в липидах. В 1971 году Дж.П.Джонак и др. обнаружили один из первых ингибиторов роста на мышиных клетках аденокарциномы, которым был жирорастворимый противоопухолевый препарат (антифолат) 2,4-диамино-5-адамантил-6-метилпиримидин (ДАМП) [13]. Позже соли этилсульфоната ДАМП прошли первую фазу клинических испытаний и были рекомендованы для исследований II фазы в качестве противоопухолевых агентов [15].
В свою очередь, было показано на мышиных клетках меланомы [16], что некоторые адамантаналкилтио-производные гетероциклов повышают секрецию фактора некроза опухоли (TNF-). Способность стимулировать экспрессию этого цитокина для таких адамантановых производных зависит, среди прочих факторов, от структуры линкера между остатком адамантана и гетероциклическим радикалом. В этой работе исследована серия (1-адамантил)алкилсульфаниловых производных , которые были получены алкилированием соответствующих тиогетероциклов. Испытание новых адамантаналкилтио-соединений в вышеупомянутых клеточных линиях показали, что соединение 2-(2-адамантан-1-ил-этилсульфанил)4-метилпиримидин оказалось наиболее активным стимулятором цитокина (TNF-).
Препараты адамантана против заболеваний центральной нервной системы Другая область применения производных адамантана связана с аминопроизводными адамантана, такими как мидантан, который применяется при лечении некоторых неврологических расстройств: заболевания Паркинсона [17] и некоторых деменций, в частности, болезни Альцгеймера [18].
В 1966 г. в медицинскую практику был введен гидрохлорид 1-аминоадамантана. Это соединение часто называют мидантаном или амантадином, но фирменное название симметрел [13]. Изначально его применяли только как антигриппозный препарат. В настоящее же время амантадин наиболее часто используется в неврологической клинике для лечения болезни Паркинсона и паркинсонического синдрома (паркинсонизм является одним из наиболее распространенных заболеваний центральной нервной системы и встречается у 1-2,5% людей, причем риск заболевания с возрастом увеличивается). Впоследствии вместе с амантадином в клинике прошли испытания других препаратов против заболеваний центральной нервной системы, таких как бемантан (2-(N-бензоиламино)адамантан) (II), димантан (2,2`-ди(адамантил)амин гидрохлорид) (III), кемантан (1-гидроксиадамантан-4-он) (IV) и мемантин (1,3-диметил-5-аминоадамантан) (V) [14].
