Введение к работе
з 1.
Актуальность темы. Грипп птиц - вирусное заболевание диких и домашних птиц, характеризующееся, в первую очередь, поражением органов дыхания и пищеварения. На основании антигенных различий поверхностных белков вирус гриппа типа А подразделяют на 16 подтипов по гемагглютинину (НА) и 9 подтипов по нейраминидазе. Особую опасность для птицеводства представляют высокопатогенные штаммы вируса гриппа птиц (ВГП) подтипов Н5 и Н7, способные вызывать высоко контагиозное заболевание со смертностью до 100%.
Вспышки заболевания, вызванного ВГП подтипа Н5, регистрировались повсеместно как среди диких, так и домашних птиц в течение последних 60 лет. Так, ВГП подтипа Н5 был выявлен в 1959 и 1991 гг. в Англии, в 1961 и 2004 г. в Южной Африке, в 1983г. в Ирландии [Alexander D.J., 2008], в 1967г. в России [СюринВ.Н., 1972].
Начиная с 1996г., широкое распространение получил ВГП подтипа Н5 генетической линии A/goose/Guangdong/1/96 и вспышки высокопатогенного гриппа птиц были зарегистрированы на территории стран Европы, Африки и Ближнего Востока [Lupiani В. and Reddy S.M., 2008]. За последние 7 лет ВГП подтипа H5N1, относящийся к генетическим кладам 2.2 и 2.3.2 вызвал многочисленные вспышки заболевания как среди диких, так и домашних птиц в различных странах Европы и Азии [Львов Д. К., 2008; Reid S.M., 2011].
Считается, что птицы отрядов Anseriformes (гусеобразные) и Charadriiformes (ржанкообразные), являющиеся естественным резервуаром ВГП в природе, способны переносить вирус на значительные расстояния во время сезонных миграций [Sharov К., 2009; Prosser J.D., 2011]. В результате мониторинговых исследований, проведенных на территории Европы в период с 1998 г. по 2006 г. [Minister J.V., 2007], было установлено, что наиболее распространенными подтипами ВГП в популяциях диких птиц, являются подтипы НЗ и Н4.
При инфицировании домашних птиц некоторые изоляты ВГП подтипов НЗ и Н4 способны вызывать заболеваемость до 50% и смертность до 5%. Кроме того, смертность может достигать более высоких значений при инфицировании молодняка или ассоциированном течении заболевания [Swayne E.D. and Pantin-JackwoodM.,2008].
Через территорию РФ пролегают пять основных путей миграции птиц, перелетающих на значительные расстояния [Львов Д.К., 2004; Si Y., 2009], причем на территории европейской части РФ и Сибири расположены зоны гнездования не менее 16 видов птиц семейства Anseriformes [Gilbert М., 2008], являющихся естественными хозяевами ВГП. Большинство птиц, имеющих зоны гнездования на территории РФ, мигрируют на зимовку в Африку и Юго-Восточную Азию [Lvov D.K., 2004], неблагополучные по высокопатогенному гриппу птиц.
Учитывая широкую распространенность ВГП подтипов НЗ и Н4, а также возможность заноса дикими мигрирующими птицами вируса подтипа Н5, особую значимость приобретают мониторинговые мероприятия и изучение биологических свойств изолятов вируса.
Степень разработанности проблемы. Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП подтипа Н5 евразийской [Monne et al., 2008] и американской [Spackman et al., 2007] генетических линий, системы мультиплекс-ПНР для выявления вируса гриппа птиц подтипа H5N1 [Payungporn et al, 2006; Wu et al, 2008]. Разработаны системы мультиплекс ПЦР для выявления ВГП подтипов Н5, Н7 и Н9 [Chaharaein et al., 2007], Н5 и Н9 [Saberfar et al., 2007]. Отечественными исследователями разработан методы ОТ-ПЦР для выявления ВГП типа А и подтипов ВГП Н5 и Н7 [Киреев и др., 2007].
Применение метода дуплекс ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления ВГП типа А и подтипа Н5, а также методов ОТ-ПЦР для выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 позволяет сократить затраты времени, труда и
реактивов, необходимых для определения подтипа вируса и оценки его вирулентности.
Цель и задачи исследования. Основная цель данных исследований заключалась в разработке методов выявления ВГП/А подтипов НЗ, Н4 и Н5 с помощью метода ПЦР, изучении биологических свойств и филогенетической взаимосвязи изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выявленных на территории РФ в период 2008-2010 гг.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Разработать метод обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в формате дуплекс в режиме реального времени (ОТ-дПЦР-РВ) для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.
Разработать методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.
Изучить биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.
Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов гена НА изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг.
Научная новизна исследований.
Разработан метод ОТ-дПЦР-РВ для выявления ВГП типа А и идентификации подтипа Н5.
Разработаны методы выявления ВГП подтипов НЗ и Н4 на основе ОТ-ПЦР.
Изучены биологические свойства изолятов ВГП подтипов НЗ и Н4, выделенных в 2008-2010 гг., при их культивировании в куриных эмбрионах и монослое культуры клеток MDCK.
Определены нуклеотидные последовательности фрагментов гена НА 7 изолятов ВГП подтипа НЗ и 7 изолятов ВГП подтипа Н4, выявленных на территории РФ в течение 2008-2010 гг.
Практическая значимость исследования. Разработаны, одобрены Ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические рекомендации:
«Методические рекомендации по выявлению вируса гриппа А птиц и идентификации подтипа вируса гриппа птиц Н5 с помощью ОТ-дПЦР-РВ».
«Методические рекомендации по определению индекса патогенности штаммов вируса гриппа А птиц».
«Методические рекомендации по идентификации вируса гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации».
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2010 гг., опубликованы на Международной научно-практической конференции молодых ученых (Россия, 2010 г.) и международной конференции «Грипп птиц и здоровье человека» (Великобритания, 2009 г.).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования - генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку методов диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВГП, а также исследования биологических и филогенетических свойств изолятов ВГП.
Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 6, 8, 10.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы - в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 258 источников. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 21 таблицей. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
