Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
1.1. Семейство Paramyxoviridae. Генетические и биологические свойства. Классификация. Общие сведения 12
1.2. Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства Paramyxoviridae 17
1.2.1. Вакцины против эпидемического паротита 17
1.2.2. Вакцины против кори 25
1.3. Диагностика заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae 26
1.3.1. Диагностика эпидемического паротита. Генодиагностика эпидемического паротита.26
1.3.2. Диагностика кори 29
1.3.2.1. Методы лабораторной диагностики кори 30
1.3.2.2. Молекулярная эпидемиология и генодиагностика вируса кори 34
1.3.2.3. Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори. Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори 41
1.4. Лечение заболеваний, вызываемых вирусами кори и паротита 46
Материалы и методы 47
2.1. Материалы 47
2.2. Методы 52
2.2.1. Выделение суммарной РНК 52
2.2.2. Проведение реакции обратной транскрипции 53
2.2.3. Проведение ПЦР 53
2.2.3.1. Амплификация фрагментов генома вируса паротита 53
2.2.3.2. Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения вируса кори 54
2.2.3.3. Амплификация кДНК вируса кори из клинических образцов для проведения анализа ДНК-микрочипом 55
2.2.4. Очистка продуктов амплификации после проведения ПЦР 55
2.2.5. Клонирование продуктов ПЦР в плазмидный вектор pGEM-5Zf(+) Е. Coli. 56
2.2.6. Определение последовательности нуклеотидных остатков ДНК 56
2.2.7. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 56
2.2.8. Подготовка молекул одноцепочечной РНК для гибридизации на ДНК-микрочипе... 57
2.2.9. Приготовление ДНК-микрочипов для генотипирования вируса кори 58
2.2.10. Гибридизация молекул одноцепочечной РНК на ДНК-микрочипе 59
2.2.11. Сканирование ДНК-микрочипов и анализ данных 60
2.2.12. Статистический анализ данных 62
Результаты и обсуждение 63
3.1. Расчет олигонуклеотидных праймеров для амплификации и определения полноразмерных последовательностей генома вируса паротита 63
3.2. Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г. Новосибирска 66
3.3. Изучение генетических свойств вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита. 73
3.3.1. Определение полноразмерной последовательности генома штамма Л-3 вируса паротита 73
3.3.2. Исследование состава вирусной популяции в препарате производственного штамма Ленинград-3, применяемого при производстве паротитной вакцины 74
3.3.3. Исследования генетической стабильности живой паротитной вакцины на основе штамма Л-3 75
3.3.4. Сравнительный анализ последовательности генома вакцинного штамма Л-3 с описанными ранее штаммами вируса паротита 78
3.4. Сравнение полноразмерных последовательностей геномов штаммов Ленинград-3 и L-Zagreb 93
3.5. Генотипирование изолятов вируса кори 95
3.6. Разработка олигонуклеотидного микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори 102
3.6.1. Определение генотип- и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе гена N вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа ... 102
3.6.2. Оценка различных платформ для иммобилизации олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа и оптимизация условий метода 108
3.6.3. Первичная характеризация разработанного ДНК-микрочипа для генотипирования изолятов вируса кори 111
3.6.4. Валидация метода генотипирования вируса кори с помощью ДНК-микрочипов 120
Заключение 123
Выводы 130
Список литературы 131
От автора 154
- Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства Paramyxoviridae
- Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори. Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори
- Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г. Новосибирска
- Определение генотип- и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе гена N вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа
Введение к работе
Высокая контагиозность, восприимчивость разных возрастных групп, возможные тяжелые осложнения и продолжительная иммуносупрессия у переболевших характерны для заболеваний, вызываемых вирусами семейства Paramyxoviridae - паротита и кори (Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина, 2000). Успехи вирусологии в разработке эффективных вакцин способствовали широкому использованию иммунизации против данных заболеваний во многих странах мира. Обе инфекции относят к категории заболеваний, контролируемых с помощью вакцинации (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. В.И. Покровского, 1993; Galazka A.M. et ai., 1999).
Средством профилактики эпидемического паротита являются вакцины на основе аттенуированных штаммов. Наибольшее применение имеют вакцины, приготовленные на основе штаммов Ленинград-3 (Россия), Leningrad-Zagreb (Египет, Хорватия, Индия), Jeryl Lynn (США, Бельгия), Urabe (Франция, Бельгия, Италия) (Galazka A.M. et al., 1999; ). Одним из факторов, заставляющих настороженно относится к использованию вакцин против вируса паротита на основе аттенуированных штаммов, является их возможная нейровирулентность (Sugiura A. and A. Yamada, 1991; Forsey Т. et al„ 1992; Miller E.M. et al., 1993). ВОЗ предлагает не только выяснить причины нейровирулентности вакцинных штаммов, применяемых при производстве вакцин для профилактики эпидемического паротита, но и осуществлять контроль их генетической стабильности на этапах производства. Такая работа проведена для штамма Jeryl Lynn (Amexis G.S. et al., 2002). Изучение штамма Jeryl Lynn показало, что он генетически гетерогенен и содержит 2 различных субштамма (Afzal М.А. et al., 1993; Amexis G.S. et al., 2002). Вакцина на основе этого штамма достаточно иммуногенна и не вызывает неврологических осложнений у привитых. Известна полноразмерная последовательность генома штамма Urabe (Amexis G. et al., 2001a), однако, работы по изучению генетической стабильности этого штамма в условиях производства не проводятся. В России (ранее в СССР) для производства вакцины против эпидемического паротита используется штамм Ленинград-3 (Л-3). В Хорватии, Индии и Египте используется штамм Leningrad-Zagreb. История появления штамма с таким названием указывает на его связь со штаммом Ленинград-3 (Beck М. et al., 1989). Анализ данных о поствакцинальных осложнениях после иммунизации вакциной на основе штамма Л-3 в России обнаружил чрезвычайно низкую частоту неврологических осложнений (0,018 на 100000 привитых) (Максимова О.А. и др., 2001). В то же время при применении вакцины производства Хорватии и Индии (штамм L-Zagreb) осложнения в виде асептического менингита неоднократно регистрировались (Cizman М. et al., 1989; Kraigher A. and Tesovic G. et al., 1993; da Cunha S.S et al., 2002; da Silveira CM et al., 2002). Многие авторы обсуждают штаммы L-Zagreb и Ленинград-3 как один и тот же штамм. Подобные факты вызывали спекуляции о низком качестве российской вакцины, однако, никто из зарубежных (равно и отечественных) исследователей не сообщали данных о генетических свойствах штамма Ленинград-3. Отсутствие таких данных не позволяет говорить об идентичности штаммов Leningrad-Zagreb и Ленинград-3. Средством, позволяющим положить конец подобным инсинуациям, является изучение структуры штамма Ленинград-3 и его генетической стабильности.
Несмотря на широкое применение профилактических прививок, заболеваемость эпидемическим паротитом в различных странах, включая Россию, остается значительной (4,2 на 100000 человек в 2004 году) (). Данные о генетических свойствах циркулирующих штаммов вируса паротита очень ограничены. На территории России подобные исследования проводятся спорадически и в очень ограниченных масштабах (Heider A. et al., 1997b; Нестеров А.Е. и др., 2004). Общеизвестно, что под давлением иммунной системы вирус способен изменять свои антигенные и другие биологические свойства. Поэтому анализ циркулирующих на отдельной территории изолятов, выделенных в разное время, может предоставить информацию об изменениях в геноме вируса и возможных путях его эволюции. Рїммунизация вакцинным штаммом вируса паротита потенциально может не приводить к формированию полноценного протективного иммунного ответа вакцинированных против различающихся по антигенным свойствам (Orvell, С.A. et al, 1997а; Yates, P.J. et al., 1996) штаммов «дикого» типа. Об этом свидетельствуют случаи заболевания вакцинированных лиц (Hersh, B.S. et al., 1991) и случаи повторного заболевания ранее переболевших при инфицировании вирусами гомологичных генотипов (Nojd, J. et al., 2001). Поэтому сравнение последовательностей эпитопов и других иммунологически и функционально значимых районов белков циркулирующих штаммов «дикого» типа и штаммов, используемых для приготовления вакцин, представляет определенный интерес для выяснения причин названных выше явлений.
В рамках программы по элиминации кори, проводящейся под эгидой ВОЗ и ЮНЕСКО (WHO-UNICEF, 2002) генотипирование изолятов этого вируса является важным компонентом слежения за заболеваемостью (Bellini W.J. and Helfand R.F. 2003; Bellini W.J. and Rota P.A. 1998; Mulders M.N. et al, 2001; Rota J.S. et al., 1996). Исследование генотипов вируса кори, циркулирующих на определенной территории, позволяет отслеживать пути передачи вируса (Rota, J.S. et al., 1996) и помогает отличать поствакцинальные осложнения от случаев заболевания, вызванных инфицированием штаммами "дикого" типа (Bellini W.J. and P.A. Rota, 1998). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований, в совокупности с анализом данных классической эпидемиологии, позволяют корректировать календарь профилактических прививок для повышения эффективности контроля над инфекцией (Mulders M.N. et al., 2001).
Молекулярная характеризация изолятов вируса кори проводится, в основном, крупными лабораториями, расположенными в развитых странах (Featherstone, D.D. et al., 2003). Сложности, связанные с необходимостью транспортировки инфекционных образцов, высокой термолабильностью вируса кори, а также длительным сроком проведения анализа подчас не позволяют эффективно осуществлять генодиагностику заболевания для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий. Из-за изменений в клинической картине и атипичности серологических показателей у вакцинированных против кори (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005), диагностика заболевания рекомендованными ВОЗ методами (WHO Department of vaccines and Biologicals, 1999) затруднена. В случае инфицирования вакцинированных штаммами вируса кори "дикого" типа, принадлежащими генотипу А (идентичному с генотипом вакцины), молекулярные методы (ОТ-ПЦР и генотипирование) являются единственным способом лабораторного подтверждения клинического диагноза (Heider A., 1997b; Atrasheuskaya A.V. et al., 2004; Atrasheuskaya A.V. et al., 2005).
Определение последовательности нуклеотидных остатков продуктов ПЦР в настоящее время является самым точным и эффективным способом идентифицировать генотипы вируса кори (Kremer J.R. et al., 2004). Однако, существует необходимость использовать альтернативные методы, позволяющие быстро проводить генотипирование большого количества образцов. Так же может быть необходимо анализировать несколько областей генома вируса одновременно, например, для повышения точности или чувствительности анализа. Поэтому необходима разработка методов, позволяющих проводить генетический анализ изолятов вируса кори за наиболее короткое время и как можно ближе от мест их выделения. Метод ДНК-микрочипов с применением олигонуклеотидньгх зондов (Pease А.С. et al., 1994; Schena М. et al., 1995; Hoheisel J.D. 2006) представляет одну из возможных альтернатив, т.к. он применим для исследования большого количества образцов и может быть легко модифицирован для одновременного анализа нескольких генов вируса или всего генома.
Целью настоящего исследования являлось изучение генетических свойств вирусов кори и паротита.
Задачами настоящего исследования являлись:
Изучение генетических свойств Российского вакцинного штамма Ленинград-3 вируса эпидемического паротита: определение полной последовательности генома штамма Ленинград-3 (Л-3); сравнение последовательностей генома штамма Л-3 и штаммов вируса паротита с определенными полноразмерными последовательностями (как вакцинных, так и штаммов "дикого" типа); изучение состава вирусной популяции вакцинного штамма Л-3; изучение генетической стабильности штамма Л-3 в готовых вакцинных препаратах и при пассировании на культуре клеток, используемой при производстве вакцины.
Сравнительный анализ последовательностей геномов штаммов вируса эпидемического паротита "дикого" типа, выделенных на территории г. Новосибирска: определение полной последовательности геномов штаммов "Драгун" (генотип С, выделен в 1994 году) и "ПетроНов" (генотип Н, выделен в 2003 году); сравнение полученных последовательностей с ранее определенными последовательностями геномов штаммов вируса паротита, доступных в базе данных GenBank.
Изучение разнообразия генотипов вируса кори, циркулирующих на территории с высоким уровнем охвата населения профилактическими прививками: анализ клинических образцов методом ОТ-ПЦР для определения геномной РНК вируса кори; определение генотипов изолятов вируса кори, циркулирующих на данной территории.
Разработка ДНК-микрочипа для быстрого генотипирования изолятов вируса кори: разработка метода и его оптимизация, используя установленные ВОЗ эталонные штаммы генотипов вируса кори и изоляты "дикого" типа, выделенные на территории различных стран; валидация метода используя панели клинических образцов, собранных от больных корью и лиц, инфицированных другими вирусами, вызывающими экзантемные заболевания; определение чувствительности и специфичности разработанного метода.
Научная новизна работы. Впервые определены полноразмерные последовательности геномов сибирских изолятов вируса паротита (генотипы С и Н). Получена полноразмерная последовательность генома штамма Л-3, применяющегося при производстве паротитной вакцины в России. Показана генетическая стабильность и гомогенность штамма Л-3. Для обработки данных ДНК-микрочипов при генотипировании изолятов вируса кори впервые применен метод иерархического кластерного анализа.
Практическая значимость работы. Выделен и депонирован в коллекцию культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (номер V-330) штамм вируса паротита ПетроНов (генотип Н). Рассчитаны и получены олигонуклеотидные праймеры для амплификации и определения последовательности нуклеотидных остатков генома штаммов вируса паротита. В соответствии с рекомендациями ВОЗ (Global Advisory Committee on Vaccine Safety, Женева 3-4 декабря 2004 г.) охарактеризован штамм Л-3, применяющийся для производства паротитной вакцины в России. Разработан метод генотипирования изолятов вируса кори без использования определения последовательности нуклеотидных остатков участков генома вируса. Положения, выносимые на защиту.
Показана стабильность и генетическая гомогенность штамма Л-3 вируса паротита, применяемого для производства паротитной вакцины в России.
Установлены генетические различия между вакцинными штаммами вируса паротита Л-3 (Росиия) и L-Zagreb (Хорватия, Индия, Египет).
Разработан и апробирован ДНК-микрочип, способный детектировать и эффективно дискриминировать все 23 описанных генотипа вируса кори в клинических образцах.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: "Генодиагностика Инфекционных Болезней" (Москва, 19-21 октября 2004 г.), "IUMS 2004 - Microbes in the changing world. XIII International Congress of Virology" (San Francisco, CA, July 23-28, 2005), "A Century of FDA Science: Pioneering the Future of Public Health. FDA Science Forum" (Washington, DC, April 18-20,2006)
Публикации. По материалам диссертации опубликованно 10 печатных работ.
Вклад автора. Результаты изложенных работ, за исключением клинических исследований, получены непосредственно автором.
Профилактика заболеваний, вызываемых представителями семейства Paramyxoviridae
Входными воротами инфекции являются слизистая оболочка дыхательных путей, рта, а также конъюнктива, откуда гематогенным путем вирус распространяется по всему организму. В начальном периоде эпидемического паротита могут наблюдаться явления фарингита, ларингита, иногда - стоматита (Руководство по инфекционным болезням. Под ред. Ю.В.Лобзина, 2000).
Эпидемический паротит характеризуется поражением не только слюнных желез, но, нередко, и других органов (поджелудочной железы, яичек, нервной системы и др.). Несмотря на то, что внедрение вируса в клетки слюнных желез и других органов происходит одновременно, в слюнных железах патологический процесс (репродукция вируса и ответная воспалительная реакция) развивается быстрее, чем в других органах. В 25 - 30 % случаев заражение восприимчивых лиц ведет к развитию бессимптомной формы болезни (Levitt, L.P. et al., 1970). Заболевшие контагиозны, но при этом у этих лиц нет симптомов интоксикации и поражения слюнных желез, происходят лишь изменения в иммунной системе. Эпидемический паротит может приводить к разнообразным необратимым осложнениям, таким как серьезные остаточные явления после паротитных менингитов и менингоэнцефалитов, к развитию глухоты, сахарному диабету, к мужскому и женскому бесплодию из-за тропности вируса к железистому эпителию. Контагиозность эпидемического паротита значительно меньше, чем кори, но восприимчивость всеобщая, приближающаяся к 100 % и сохраняющаяся у серонегативных людей всю жизнь. Заболеваемость эпидемическим паротитом почти повсеместно имеет волнообразный характер, наблюдаются периодические подъемы и спады. Можно отметить, что в странах, где налажен учет заболеваемости, ее подъем наблюдается через каждые 3-5 лет, в ряде стран через 6-7 лет (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. В.И. Покровского, 1993).
Высокий уровень заболеваемости эпидемическим паротитом, большой экономический ущерб, успехи вирусологии в разработке эффективных вакцин явились основными факторами, способствующими широкому распространению активной иммунизации против эпидемического паротита во многих странах мира.
Живые вакцины против вируса эпидемического паротита доступны в виде моновалентной паротитной вакцины, бивалентной вакцины корь-паротит и тривалентной вакцины корь-паротит-краснуха. Требования ВОЗ не определяют минимальное количество вакцинного вируса, содержащегося в одной прививочной дозе (Galazka A.M. et al., 1999). Данный параметр определяется национальным контрольным органом страны-производителя вакцины. Большинство стран используют не менее 1000 ТЦПД50 аттенуированного вируса паротита на одну дозу вакцины (Galazka A.M. et al., 1999).
Ниже представлено сравнение различных аттенуированных вакцинных штаммов вируса паротита по таким параметрам как иммуногенность, эффективность и безопасность.
Вакцинный штамм Jeryl Lynn, названный по имени ребенка, от которого был выделен вирус, получен в США пассированием изолята вируса на РКЭ (развивающихся куриных эмбрионах) и, в последующем, на клеточных культурах КЭ (куриных эмбрионов) (Buynak Е.В. and Hilleman M.R. 1966). Штамм был лицензирован в США в 1967 г., к 1992 г. вакциной на его основе было привито приблизительно 135 миллионов детей и взрослых во всем мире. Клинические исследования, проведенные в развитых странах, показали, что при вакцинации одной дозой вакцины на основе штамма Jeryl Lynn сероконверсия наблюдалась у 80-100 % привитых. Привитые данной вакциной люди оставались серопозитивными до десяти лет после иммунизации (Broliden К. et al., 1998; Davidkin I. et al., 1995). Клиническая эффективность вакцинного штамма Jeryl Lynn, определенная при исследовании вспышки заболевания в США, составляла от 75 % до 91 % (Cochi S.L. et al., 1994). Однако, такие исследования также показали, что риск заболевания паротитом увеличивается с течением времени, прошедшего от момента прививки (Briss Р.А. et al., 1994; Hersh B.S. et al., 1991), что, вероятно, объясняется прежде всего снижением вызванного вакцинацией иммунитета. На основании десятилетнего ретроспективного изучения случаев госпитализации больных с установленным диагнозом "асептический менингит" число случаев данного заболевания составила один на 100 000 доз тривалентной вакцины, содержащий штамм Jeryl Lynn, для контингента детей в возрасте 12-23 месяцев (Black S. et al., 1997). В Германии этот показатель составил 0,1 случай менингита на 100 000 вакцинных доз (Fescharek R. et al., 1990).
Вакцинный штамм Ленинград - 3 (Л-3). Аттенуированный штамм Ленинград-3 вируса паротита был получен в Советском Союзе пассированием выделенного от больного изолята на клеточной культуре ПМС (почек морской свинки) с дальнейшими пассажами на культуре КЭЯП (клеток эмбриона японского перепела) (Smorodintsev А.А. et al., 1970). Вакцины на основе штамма Ленинград - 3 использовались с 1974 г. Приблизительно 8-11 миллионов доз вакцины на основе данного штамма производится ежегодно. Проведенные эпидемиологические исследования Российской вакцины на основе штамма Л-3 показали 89-98% сероконверсию у вакцинированных детей в возрасте 1-7 лет и защитную эффективность 92-99 % (Smorodintsev А.А. et al., 1970). Эффективность вакцины при вспышке заболевания составляла 97 % (Юнанов С.С. и др., 1977). Анализ поствакцинальных реакций после применения живой паротитной вакцины (ЖПВ) на основе данного штамма в 1980-1998 гг. в России выявил крайне низкую частоту возникновения случаев серозного менингита - 0,018 на 100000 привитых (Максимова О.А. и др., 2001).
Методы быстрого определения генотипов циркулирующих изолятов вируса кори. Олигонуклеотидные микрочипы как альтернативный метод генетического анализа циркулирующих штаммов вируса кори
Генотипирование изолятов вируса является важным компонентом программы надзора за корью (Bellini W.J. and Helfand R.F. 2003; Bellini W.J. and Rota P.A. 1998; Mulders M.N. et al., 2001; Rota J.S. et al., 1996). Оно позволяет отслеживать пути передачи вируса и помогает отличать поствакцинальные осложнения от случаев, вызванных инфицированием вирусами дикого типа. Молекулярная характеризация изолятов вируса кори проводится двумя Глобальными Специализированными Лабораториями ВОЗ и иногда некоторыми региональными и национальными лабораториями этой организации (Featherstone D. et al., 2003). Определение первичной последовательности ДНК продуктов ПЦР в настоящее время является самым точным и эффективным способом идентификации генотипа вируса кори. Из-за расширения сети лабораторий ВОЗ необходимо иметь дополнительные методы генетической характеризации вирусов, применимые в лабораториях регионального уровня. Методы с высокой производительностью анализа могут быть необходимы при увеличении количеств исследуемых образцов. Кроме того, в будущем возникнет необходимость проводить анализ больших областей генома или даже полных геномов изолятов вируса кори для увеличения чувствительности молекулярного-эпидемиологического анализа и единовременного исследования нескольких локусов вирусного генома.
На сегодняшний день разработаны несколько альтернативных методов генотипирования изолятов вируса кори. Среди них - исследование полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (Restriction Fragment Length Polimorphism - RFLP) (Mori T. 1994; Takahashi M. et al., 2000), анализ подвижности ДНК-ДНК гетеродуплексов в геле (Heteroduplex Mobility Assay - НМА) (Kreis S. and Whistler T. 1997), рефракторный анализ мутаций (Samuel D. et al., 2003), генотипирование с помощью нуклеотид-специфичной мультиплексной ПЦР (Kremer J.R. et al., 2004) и ПЦР в режиме реального времени (Waku-Kouomou D. et al., 2006).
Метод, основанный на использовании ОТ-ПЦР, с последующим применением методики-RFLP, не требует дорогого оборудования, является технически простым и относительно быстрым. Однако для его применения необходимо наличие в нуклеотидных последовательностях геномных РНК сравниваемых штаммов уникальных и постоянных для каждого генотипа комбинаций сайтов узнования рестрикционных эндонуклеаз. Такие комбинации невозможно найти для всех генотипов вируса кори. Данный метод способен детектировать замены нуклеотидов, находящихся только внутри рестрикционных сайтов и не способен определять мутации в других участках последовательностей (Arens М., 1999). При использовании разумного количества эндонуклеаз рестрикции и стандартных методов разделения получаемых фрагментов ДНК, удается дифференцировать лишь 2-3 генотипа вируса кори (Mori Т. 1994; Takahashi М. et al., 2000). Указанный недостаток метода делает его непригодным для широкого применения для анализа при современном состоянии молекулярной эпидемиологии коревой инфекции.
Анализ подвижности гетеродуплексов ДНК в геле часто требует наличия уникального оборудования или проведение сложных процедур для разделения дуплексов ДНК с очень близкой подвижностью, например электрофорез в градиентном геле или капиллярный электрофорез с температурным градиентом (Margraf R.L. et al., 2004). Минимально детектируемые значения различий нуклеотидных последовательностей между цепями ДНК гетеродуплексов при анализе методом НМА составляет около 2% (Arens М. 1999). Данная величина меньше установленного промежутка (2,5%) для интрагенотипических различий нуклеотидных последовательностей гипервариабельной части гена N вируса кори (WHO, 1998). Кроме того, результаты гетеро дуплексного анализа часто трудно интерпретировать, их воспроизводимость в различных лабораториях низка (Kremer J.R. et al., 2004). Таким образом, разрешение метода НМА не позволяет дифференцировать большинство генотипов вируса кори, в описанном варианте (Kreis S. and Whistler Т. 1997) метод невозможно применить для анализа большого количества образцов.
Рефракторный анализ мутаций и генотипирование с помощью ПЦР в режиме реального времени также не обеспечивают достаточной специфичности анализа для дискриминации всех генотипов вируса кори. Необходимое оборудование и реактивы сравнимы по стоимости с традиционно используемыми для определения первичной последовательности геномов вирусных изолятов.
Воспроизводимость результатов генотипирования изолятов вируса кори с помощью нуклеотид-специфичной мультиплексной ПЦР в различных лабораториях также вызывает сомнение. Таким образом, из анализа литературы следует, что предложенные методы имеют следующие недостатки: они технически сложны и/или дороги, плохо стандартизуемы. Кроме того, большинство из них не применимо для широкомасштабного скрининга образцов. Чувствительность предложенных методов анализа последовательности изолятов вируса кори часто ниже необходимого минимума для детекции всех существующих генотипов. Результаты использования различных альтернативных подходов нельзя легко депонировать в центральной базе данных, так что результаты, полученные в различных лабораториях не могут быть легко сравнены между собой.
Технология ДНК-микрочипов (Pease А.С. et al., 1994; Schena М. et al., 1995; Hoheisel J.D. 2006) - эффективный инструмент для быстрого генетического анализа микроорганизмов, включая исследование транскрипционных профилей, ре-секвенирование, SNP анализ и генотипирование бактериальных и вирусных инфекционных агентов (Boriskin Y.S. et al., 2004; Butcher L.M. et al., 2004; Cherkasova E. et al., 2003; Chizhikov V. et al., 2001; Laassri M. et al., 2003). Короткие олигонуклеотидные зонды (длинной до 40 и.о.), иммобилизованные на поверхности стеклянного слайда-носителя, позволяют дискриминировать образцы с незначительными генетическими различиями. В описанном выше варианте метод традиционно применяют для дискриминации микроорганизмов на уровне видов (Laassri М. et al., 2003; Boriskin Y.S. et al., 2004; Chizhikov V. et al., 2001). Примеров дискриминация генетических вариантов в пределах одного вида гораздо меньше. Метод определения генотипов ротавирусов группы A (Chizhikov V. et al., 2002) с помощью гибридизации образца с иммобилизованными генотип-специфическими олигонуклеотидными зондами ДНК-микрочипа показал высокую специфичность и полное соответствие результатов тестирования панели кодированных образцов результатам определения генотипов традиционным методом. В работе (Laassri М. et al., 2003) процедура детекции и дискриминации ортопоксвирусов, патогенных для человека, занимала всего около 3 часов. Метод идентификации всех сегментов генома клонов-реассортантов двух высокогомологичных штаммов вируса гриппа B/Beijing/184/93 и B/Shangdong/7/97 с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР и гибридизации образцов на ДНК-микрочипах (Ivshina A.V. et al., 2004) был способен не только верно определять происхождение каждого из 10 геномных сегментов, но также мог детектировать реассортанты с несколькими сегментами одного типа (например сегмента NS).
Генетический анализ изолятов вируса паротита, выделенных на территории г. Новосибирска
Спорадическое изучение изолятов вируса эпидемического паротита в г.Новосибирске проводится лабораторией иммунологической безопасности ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор"с 1994 г. В 1994 г. при изучении вспышки эпидемического паротита в поселке Кольцово Новосибирской области был выделен изолят вируса паротита "Драгун" (Агафонов А.П. и др., 1997). Данный штамм по результатам генотипирования был отнесен к генотипу С (Heider А. et al., 1997). С 2001 г. проводится постоянный мониторинг заболеваемости эпидемическим паротитом, т.е. изучается каждый случай с клиническим диагнозом "эпидемический паротит". В результате, в 2003 г. в г. Новосибирске выделили штамм от больного "ПетроНов" (депонирован в коллекцию микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" (Кольцово, Новосибирской обл., Россия) за номером V-ЗЗО. Для проведения работ по генотипированию выделенного изолята бьша определена последовательность н.о. продукта ПЦР из образца носоглоточного смыва. Генотипирование показало принадлежность штамма "ПетроНов" к генотипу Н. Полные нуклеотидные последовательности штаммов "Драгун" и "ПетроНов" были расшифрованы в ходе выполнения данной работы согласно стратегии, описанной в разделе 3.1 и депонированы для свободного доступа в базе данных GenBank под номерами № AY669145 и AY681495, соответственно. Полученные нуклеотидные последовательности штаммов "Драгун" и "ПетроНов" сравнивали с последовательностями различных изолятов вируса паротита, относящихся как к вакцинным, так и "диким" штаммам, депонированными в базе данных GenBank.
В ходе проделанной работы определены полные последовательности геномов двух сибирских изолятов вируса паротита. Последовательность штамма "Драгун" представляет собой первую полную последовательность штамма вируса эпидемического паротита генотипа С, доступную в базе данных GenBank. Сравнение полных геномов штаммов генотипа Н, "ПетроНов" (изолирован в 2003 году в Новосибирске, Россия) и 88-1961 (изолирован в 1988 году в США) (Amexis G. et al., 2003), выявило незначительную дивергенцию их последовательностей (1,67 % для полных геномов). Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена, показал, что между "дикими" (штаммы ПетроНов, Драгун, Dg/1062/Korea/98, 88-1961, Gloucl/UK96) и вакцинными штаммами (Urabe, Jeryl Lynn, Л-3, L-Zagreb) явных отличий нет (рисунок 12). С незначительными перестановками внутри подгрупп деревья для всех генов (N, Р, F, SH, Н, L) были схожи и практически повторяли дерево для полного генома. Однако, при анализе выведенных белковых последовательностей гена М, изоляты генотипа Н (88-1961 и "ПетроНов") группировались вместе с вакцинными штаммами Jeryl Lynn, принадлежащими к генотипу А. При анализе вариабельности различных штаммов вируса паротита относительно штамма "ПетроНов" выявлено, что наиболее редкими являются замены нуклеотидов G - С и С - G (менее 1% от общего количества замен). В наибольшем количестве представлены замены Т - С, С - Т (19-25%) HA-»G,G- A(16- 19%). Штамм "Драгун" находится на втором месте по общему числу нуклеотидных замен относительно штамма Jeryl Lynn major, уступая лишь штамму "ПетроНов". Сравнение последовательностей кодирующих участков генома штамма "ПетроНов" с другими штаммами вируса эпидемического паротита приведено в таблице 3.4. Аналогичные данные для штамма "Драгун" показаны в таблице 3.5. Сравнение некодирующих участков геномов для данных штаммов приведено в таблицах 3.6 и 3.7, соответственно. Наиболее близким к штамму "ПетроНов" является штамм 88-1961 (генотип Н); наибольшие отличия у штамма "ПетроНов" с вакцинными штаммами Jeryl Lynn major, Jeryl Lynn minor и штаммом "дикого" типа Dgl062. При сравнении всех штаммов, для которых известна полная нуклеотидная последовательность, больше всего аминокислотных замен наблюдаются в структурных белках SH, Р и HN. Исследование изменчивость индивидуальных функциональных доменов белков и антигенных детерменант показало, что регионы, несущие различную функциональную нагрузку в геноме двух российских изолятов высоко консервативны. Картированные антигенные детерминанты, напротив, имеют значительную дивергенцию последовательностей с другими штаммами, особенно с вакцинными штаммами генотипа А. Определенные последовательности использованы при сравнительном анализе и генотипировании штамма Ленинград-3 в дальнейшей части работы. Перекрывающиеся фрагменты ДНК, представляющие последовательность вакцинного штамма вируса паротита Л-3, полученного из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, проводили согласно стратегии, описанной в главе 3.1.2. После очистки фрагментов фракционированием электрофорезом и последующей элюцией ДНК из геля, проводили определение последовательности н.о. обоих цепей ДНК каждого фрагмента, используя праймеры, описанные в главе 3.3.1. Для получения полной нуклеотидной последовательности генома вируса было необходимо также определить последовательности нетранслируемых 5 - и 3 -концевых фрагментов генома, которые в силу их терминального положения, невозможно определить стандартным методом. Фрагменты, содержащие последовательности, соответствующие 3 - и 5 - концам геномной РНК, получали при помощи методики быстрой амплификации концов кДНК (Ohara О. et al., 1989): после достраивания к 5 - концу геномной РНК поли-А последовательности, используя терминальную аденилилтрансферазу, проводили ПЦР с олиго-dT праймером и специфическим антисмысловым праймером. Амплификацию 3 -концевого фрагмента осуществляли аналогично, однако, использовали специфический смысловой праймер и олиго-dT праймер, который связывался с природной поли-А последовательностью на 3 -конце геномной РНК. Полученные фрагменты клонировали в плазмидном векторе pGEM-5Zf(+) с последующей трансформацией в Escherichia coli, наработкой рекомбинантной плазмидной ДНК и определением нуклеотидных последовательностей. Для всех процедур использовался набор "5 73 RACE Kit, second generation" (Roche, США), праймеры 3 R 1С, 3 R 2C для амплификации 3 -концевых последовательностей и 5 R 1Ас и 5 R 2 Ас для амплификации 5 -концевых последовательностей геномов (таблица 3.1).
Определение генотип- и группоспецифических мутаций в гипервариабельном районе гена N вируса кори. Расчет олигонуклеотидных зондов ДНК-микрочипа
Анализ изменчивости гипервариабельной части гена N вируса кори (н.о. 1233-1682) проводили, используя все последовательности, доступные в базе данных GenBank. После удаления идентичных последовательностей, набор данных, использованный для дальнейшего анализа, содержал 405 уникальных последовательностей всех описанных генотипов вируса кори. Он содержал 15 последовательностей, относящихся к генотипу А; 2 к В1; 2 к В2; 18 к В3.1 (эталонный штамм New York.USA/94); 46 к В3.2 (эталонный штамм Ibadan.NIE/97/l); 29 к С1; 36 к С2; 12 к D1; 6 к D2; 22 к D3; 41 к D4; 29 к D5.1 (эталонный штамм Palau.BLA/93); 24 к D5.2 (эталонный штамм Bangkok.THA/93/l); 38 к D6; 7 к D7.1 (эталонный штамм Victoria.AUS/16.85); 6 к D7.2 (эталонный штамм Illinois.USA/50.99); 11 к D8; 4 к D9; 6 к Е; 2 к F; 2 к G1; 3 к G2; 4 к G3; 33 к HI; 7 к Н2.
Для идентификации нуклеотидных замен (мутаций), общих для всех изолятов, принадлежащих каждому генотипу вируса кори, использовали специально разработанное программное обеспечение Oligoscan v. 2.12 (автор Чумаков К.М., FDA, США). Однако, найти мутации, специфичные для всех индивидуальных генотипов вируса кори, не удалось. Чтобы преодолеть возникшее затруднение, использовали мутации, характерные для различных составных групп, включающих изоляты двух и более генотипов. Таким образом, определение генотипов анализируемых образцов вируса кори в данном случае основывалось на комплексном анализе паттерна мутаций, характерных для нескольких перекрывающихся составных групп. Такой подход позволил однозначно идентифицировать генотипы вируса кори, для которых не было найдено специфических мутаций. Идентифицированные мутации в исследованном районе гена N вируса кори использовали для расчета последовательностей олигонуклеотидных зондов для ДНК-микрочипа. Данные "специфические" олигонуклеотидные зонды рассчитывали, используя следующие критерии: температура плавления в составе ДНК-ДНК дуплекса 45С, центральное положение детектируемой мутации в последовательности зонда, максимально возможное количество точечных мутаций с другими (нецелевыми) генотипами или группами вируса кори. Но в большинстве случаев зонды содержали всего одну характерную для генотипа (группы) изолятов замену. Таким образом, для решения поставленной задачи было необходимо детектировать единичные замены нуклеотидов, использую процесс обратной гибридизации нуклеиновых кислот.
Для увеличения надежности и точности генотипирования вируса кори в состав ДНК микрочипа включили дополнительные "контрольные" зонды, которые рассчитывались как антиподы соответствующих "специфических" зондов: оба олигонуклеотида имели идентичные последовательности, однако в ключевой позиции "контрольного" зонда содержался и.о., встречающийся наиболее часто в генотипах вируса кори, отличных от целевых для "специфического" зонда. Рисунок 15 иллюстрирует процесс выбора олигонуклеотидных зондов для идентификации групп вируса кори. Использование отношения интенсивностей сигналов, полученных от "специфических" и "контрольных" зондов каждой пары, позволило значительно улучшить специфичность генотипирования вируса кори на основе ДНК-микрочипа. Свойства олигонуклеотидных зондов рассчитывали с помощью программы "калькулятор свойств олигонуклеотидов" (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html ). Полученная информация использовалась для оптимизации нуклеотидных последовательностей зондов по температуре плавления и отсутствию самокомплементарных участков, отрицательно влияющих на чувствительность и эффективность дискриминации мишеней в процессе обратной гибридизации. Конечная версия ДНК-микрочипа включала 71 пару олигонуклеотидных зондов ("специфических" и "контрольных") для идентификации групп вируса кори, а также три дополнительных олигонуклеотидных зонда: первые два были специфичны к высоко консервативной области С-терминального сегмента гена N изолятов вируса кори (вместе они охватывали все их разнообразие), последний зонд содержал часть последовательности смыслового праймера, используемого для проведения ГЩР на этапе подготовки мишени. Данный зонд использовался для контроля длины синтезируемой РНК мишени, используемой для гибридизации с ДНК-микрочипом, в процессе транскрипции in-vitro. Интенсивность флуоресцентного сигнала, полученного при гибридизации РНК мишени с зондом, содержащим последовательность смыслового праймера (см выше) принимали за точку нормирования сигналов олигонуклеотидов, специфичных для всех изолятов вируса кори. Последовательность, специфичность и другие характеристики зондов ДНК-микрочипа приведены в таблице 3.9. Таблица 3.9. Олигонуклеотидные зонды ДНК-микрочипа для генотипирования изолятов
