Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Медиаторы иммунной системы 12
1.2. Характеристика фактора переноса 14
1.3. Химическая природа фактора переноса 16
1.4. Свойства фактора переноса 19
1.5. Механизм действия фактора переноса 20
1.6. Животные, используемые для получения фактора переноса 23
1.7. Получение фактора переноса 24
1.7.1. Выбор доноров 24
17.2. Подготовка антигена 25
1.7.3. Сенсибилизация доноров для репродукции фактора переноса 25
1.7.4. Выделение лимфоцитарнои массы из тканей и жидкостей организма доноров 26
1.7.5. Получение диализата экстракта лейкоцитов 27
1.8. Тестирование активности фактора переноса в диализатах экстрактах лейкоцитов 27
1.8.1. Реакция замедления миграции лейкоцитов 27
18.2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа у животных 29
1.9. Применение препаратов фактора переноса для лечения и профилактики инфекционных болезней животных и человека 32
1.9.1. Применение фактора переноса для лечения болезней людей 32
7.9.2. Экспериментальное изучение фактора переноса на животных 33
1.9.3. Осложнения, возникающие у животных и человека при введении фактора переноса 36
2. Собственные исследования 40
2.1. Материалы и методы 40
2.1.1. Антигены 40
2.12. Вакцины 40
2.1.3. Подопытные животные 40
2.1.4. Оборудование и реактивы 40
2.1.5. Растворы и питательные среды 41
2.1.6. Анализ данных, собранных во время проведения работы 41
2.1.7. Подготовка антигена для сенсибилизации организма животного 42
2.1.8. Отбор доноров для сенсибилизации 42
2.1.9. Получение лимфоцитарной массы из лимфоидных органов, молозива и периферической крови доноров 43
2.1.10. Получение препарата фактора переноса 46
2.1.11. Определение стерильности препарата 47
2.1.12. Проверка безвредности 47
2.2. Тестирование иммунологической активности диализата экстракта лейкоцитов 48
2.2.1. Реакция ингибиции миграции лейкоцитов под слоем агарозы 48
2.2.2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа 50
3. Результаты собственных исследований 53
3.1. Анализ жидкостей и тканей организма, содержащих иммунокомпетентные клетки 53
3.2. Отработка методики получения диализата экстракта лейкоцитов из периферической крови, лимфоидных органов и молозива 55
3.2.1. Выбор оптимальных условий выделения лимфоцитов при цетрифугировании в градиенте плотности 55
3.3. Получение ДЭЛ из периферической крови и лимфоидных органов лабораторных животных, сенсибилизированных различными антигенами и тестирование их иммуногенной активности 58
3.3.1. Получение и тестирование препаратов ФП на основе ДЭЛ против некоторых вирусных инфекций 58
3.3.1.1. Особенности иммунитета при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях молодняка крупного рогатого скота 59
3.3.1.2. Получение и тестирование препарата ФП из периферической крови кроликов-доноров, сенсибилизированных аттенуированной вакциной против парагриппа-3 КРС 61
3.3.1.3. Тестирование диализата экстракта лимфоцитов, полученных из лимфоидных органов и периферической крови кроликов, сенсибилизированных ротавирусом крупного рогатого скота 64
3.3.2. Активация иммунокомпетентных клеток при иммунизации против ротавирусной инфекции: некоторые аспекты клеточного и гуморального ответа 70
3.3.3. Анализ степени активации клеточного и гуморального иммунитета телят при стимуляции их организма препаратами, содержащими вирус ИРТ 74
3.3.4. Тестирование клеточного и гуморального иммунитета стельных коров и их новорожденных телят в разные сроки после отела 81
3.3.5. Тестирование фактора переноса на основе ДЭЛ, полученного молозива коров 83
3.4. Тестирование ДЭЛ из периферической крови и лимфоидных органов лабораторных животных, сенсибилизированных бактериальными антигенами и тестирование их иммуногенной активности 87
3.4.1. Особенности антибактериального иммунитета 87
3.4.2. Получение и тестирование препарата ФП на основе ДЭЛ кроликов, сенсибилизированных аттенуированной вакциной против сальмонеллеза свиней 88
4. Обсуждение результатов исследования 96
Выводы 101
- Характеристика фактора переноса
- Применение препаратов фактора переноса для лечения и профилактики инфекционных болезней животных и человека
- Тестирование иммунологической активности диализата экстракта лейкоцитов
- Активация иммунокомпетентных клеток при иммунизации против ротавирусной инфекции: некоторые аспекты клеточного и гуморального ответа
Введение к работе
Актуальность темы. Общеизвестно, что при многих заболеваниях, вызванных вирусными, бактериальными и другими инфекционными агентами, преимущественно главным фактором защиты организма является специфический гуморальный иммунный ответ [1,2]. Но при всей важности гуморальной формы реагирования отмечают, что, в первую очередь, гуморальные реакции имеют под собой клеточную основу
[3].
Клеточно-опосредованной формой реагирования называют такие формы иммунных реакций, в которых эффекторными клетками являются лимфоциты, имеющие специфические рецепторы к тем или иным антигенам. Клеточно-опосредованный иммунитет (КОИ) передается клетками костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и крови [9].
За клеточно-опосредованный иммунитет ответственны сформированные в тимусе Т-лимфоциты, которые встречаются особенно в тимусзависимых зонах лимфоидных органов, в лимфе (около 80 % всех лимфатических клеток, в выходящей из лимфатических узлов лимфе), а так же крови [5].
При воздействии антигена в иммунокомпетентных Т-клетках начинаются процессы деления и дифференцирования, в результате которых образуется популяция специфически сенсибилизированных лимфоцитов.
Сенсибилизированные лимфоциты содержат фактор, способный
переносить опосредованный клетками иммунитет на
несенсибилизированные лимфоциты. Эта способность была открыта в
1949 году, а фактор, отвечающий за перенос клеточно-опосредованного
иммунитета, был назван фактором переноса (ФП). Это низкомолекулярная
антигенспецифическая гетерогенная смесь пептидов и
рибонуклеопептидов, способная специфически переносить ГЗТ к определенным антигенам [6].
Необходимость изучения передачи клеточного иммунитета с помощью фактора переноса обусловлена тем, что эта проблема недостаточно раскрыта. Многие исследователи предполагают, что трансфер фактор (TF) сможет обеспечить защиту организма от заболеваний, вызванных различными инфекционными агентами [15, 27, 43, 62, 69, 95, 107, 118, 122, 129, 136, 144, 162, 173, 182, 205].
Так как для препаратов фактора переноса не существует видового барьера, он может быть универсальным для любого вида животного и человека. Препараты, приготовленные из лимфоцитов крови и лимфоидных органов не иммуногенны, не токсичны, поэтому их применение безопасно. Иммунитет развивается по типу гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и сохраняется от нескольких месяцев до года [2, 25]. Все представленные данные говорят о необходимости изучения передачи клеточно-опосредованного иммунитета с помощью лимфоцитов, полученных от сенсибилизированных организмов.
Для испытания фактора переноса применяют тесты по оценке клеточного иммунитета [20].
В изучении клеточного иммунитета большую роль вносит познание возможности передачи состояния сенсибилизированности от одного организма другому с помощью иммунных лимфоцитов [4]. Реакция организма на введение иммунных лимфоцитов развивается по типу замедленной гиперчувствительности. Это может быть определено соответствующими кожными тестами. Развитие реакции ГЗТ хорошо коррелируетря с реакцией ингибиции миграции лейкоцитов in vitro. Реакция ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ) является наиболее точным тестом для оценки клеточно-опосредованного иммунного ответа.
Заболевания молодняка крупного рогатого скота (КРС) наносят большой экономический ущерб, несмотря на наличие средств специфической и неспецифической профилактики, поэтому необходим новый подход к решению этой проблемы. Использование препаратов ФП в
ветеринарной практике является новым направлением иммунологической науки, и ряд вопросов по этой теме остается не решенным.
Диссертация имеет характер поискового экспериментального исследования, которое является фрагментом научной темы по изучению клеточных медиаторов и новых средств специфической профилактики.
Цели и задачи исследования. Основной целью работы было экспериментальное изучение возможности использования препаратов ФП для профилактики некоторых инфекционных болезней молодняка КРС.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
оптимизировать методику получения лимфоцитарной массы из лимфоидных органов, молозива и периферической крови животных;
получить иммунопотенцирующий препарат фактора переноса на основе диализата экстракта лейкоцитов (ДЭЛ) крови, лимфатических узлов, селезенки, молозива;
протестировать иммунологическую активность ДЭЛ против некоторых бактериальных и вирусных инфекций;
изучить особенности иммунитета, возникающего в ответ на введение препаратов фактора переноса на основе ДЭЛ;
определить взаимодействие клеточного и гуморального
иммунитета при различных способах активации
им мунекомпетентных клеток;
- разработать научно-методическую документацию для оценки
клеточно-опосредованного иммунитета (КОИ) животных.
Научная новизна работы. Научная новизна проведенных экспериментальных исследований состоит в том, что:
- разработана схема сенсибилизации животных доноров ДЭЛ;
- получены препараты ФП на основе ДЭЛ к вирусным и
бактериальным антигенам;
разработана методика получения препаратов TF из периферической крови, лимфоидных органов, молозива;
определена возможность перенесения КОИ ксеногенным животным с помощью ДЭЛ;
определены сроки возникновения клеточного и гуморального иммунитета у животных при иммунизации и гипериммунизации вирусными антигенами;
отмечено равноценное влияние клеточного и гуморального иммунитета при защите организма животных от кишечных инвазий;
Практическая ценность результатов исследования.
Экспериментальные материалы вошли в нормативно техническую
документацию по получению и тестированию препаратов ФП на основе
ДЭЛ, одобренную ученым советом и утвержденную директором
института.
регламент по получению препаратов ДЭЛ из лимфоцитов селезенки, лимфатических узлов и лейкоцитов периферической крови и молозива;
методические рекомендации по тестированию иммунологической активности TF in vitro в реакции замедления миграции лейкоцитов под слоем агарозы;
методические рекомендации по тестированию активности иммуностимулятора in vivo в реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (г. Владимир, ВНИИЖЗ, 2000 г.); «Современные проблемы селекции, ветеринарной генетики и защиты животных» (г. Витебск, Республика Беларусь, 2001 г.); «Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных»
(г. Самарканд, Республика Узбекистан, 2001 г.); «Вет. медицина: Міжвід. тем. наук., зб. 80 рок. ІЕКВМ» (г. Харьков, Республика Украина 2002 г.); «Актуальные проблемы свиней крупного и мелкого рогатого скота» (г. Владимир, 2002 г.), «Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных» (г. Минск, Республика Беларусь, 2003 г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (г. Владимир, 2003 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, приложения. Список литературы включает 209 источников, в том числе 27 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 24 таблицами.
Основные положения, выносимые на защиту
- оптимизация методики получения лимфоцитарной массы из
лимфоидных органов, молозива и периферической крови
животных;
способ получения препаратов ФП на основе ДЭЛ, из периферической крови, лимфоидных органов и молозива лабораторных и естественно восприимчивых животных;
результаты по тестированию иммунологической активности ФП в реакциях ингибиции миграции лейкоцитов под слоем агарозы и в реакции гиперчувствительности замедленного типа;
особенности иммунитета, возникающего в ответ на введение препаратов ФП на основе ДЭЛ;
- результаты, полученные при совместной активации клеточного и
гуморального иммунитета при помощи TF и вакцин на
лабораторных и естественно восприимчивых животных;
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1999-2003 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории болезней крупного рогатого скота в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» за практическую и методическую помощь при выполнении и оформлении диссертации.
Характеристика фактора переноса
Так же описана группа медиаторов, обеспечивающих локализацию, концентрирование, фокусирование клеток вблизи чужеродных субстанций. К ним относится широко известный фактор угнетающий миграцию индикаторных клеток (макрофагов, лейкоцитов) (МИФ). Это гетерогенная фракция, продуцируемая лимфоцитами человека и животных. МИФ - термостабилен, устойчив к нейраминидазе, нуклеазам, разрушается трипсином [191,195]. Выделяются медиаторы, которые действуют на лимфоциты, изменяя, регулируя активность иммунокомпетентных клеток. Это факторы: митогенный, трансформирующий лимфоциты, потенцирующий и фактор TF [6, 39, 77]. Отдельно описан колониестимулирующий фактор, усиливающий рост лимфоцитарных, макрофагальных, эозинофильных, мегакариоцитарных и эритроидных колоний. Этот медиатор вырабатывается лимфоцитами под влиянием митогенов [46]. К медиаторам следует отнести также и лимфотоксины, опосредующие эффекторную, киллерную активность Т - лимфоцитов, которые вызывают лизис клеток - мишеней. Таким образом, перечисленные выше лимфокин ы, монокины играют ведущую роль в развитии и регуляции реакций клеточного иммунитета и регулируют пролиферацию и дифференцировку В - клеток. Медиаторы применяются в терапии различных иммунодефицитных состояний, при аутоиммунных заболеваниях, раке и другой патологии, где требуется иммунокоррекция и иммуностимуляция [56, 71, 91,124, 153, 182]. 1.2. Характеристика фактора переноса Сенсибилизированные лимфоциты передают состояние сенсибилизации интактным реципиентам при помощи ДЭЛ. Это было установлено Lawrence в 1949 году. От туберкул инположительного донора с интенсивной кожной реакцией к туберкулину ГЗТ была перенесена не иммунному реципиенту путем зведення живых не разрушенных лимфоцитов периферической крови [106]. В 1955 году впервые был осуществлен перенос гиперчувствительности замедленного типа к туберкулину и белку М. стрептококка экстрактами разрушенных лейкоцитов [107]. Основные этапы переноса представлены на рисунке 1. Экстракт, полученный Лоуренсом, состоит более чем из 200 компонентов с молекулярной массой от 1000 до 20000 и только один из них является антигенспецифическим ФП с молекулярной массой приблизительно 3500 [108]. Он представляет собой низкомолекулярный антигенспецифический рибонуклеопептид [75], присутствующий среди других компонентов диализата лизированных лейкоцитов и способный переносить клеточно-опосредованный иммунитет от иммунного донора неиммунному реципиенту [64,141]. Антигенспецифические свойства ДЭЛ заключаются в том, что реакция ГЗТ развивается у реципиента в ответ на введение антигена, соответствующего тому, к которому был получен ФП [48]. Диализат обладает способностью преодолевать межвидовой барьер. Так, TF полученный из периферической крови КРС, может перенести ГЗТ мышам, кроликам, собакам, обезьянам, людям.
Сенсибилизированные лимфоциты человека могут переносить КОИ от человека морским свинкам, крысам, мышам. ДЭЛ применяют для передачи клеточного иммунитета при различных патологиях, которые сопровождаются снижением реактивности организма, для лечения хронических инфекционных заболеваний, бактериальных и вирусных инфекций, кандидозов, метастаз злокачественных опухолей, аутоиммунных заболеваний. 1.3. Химическая природа фактора переноса Фундаментальные, конструктивные и клинические исследования феномена ФП проводились в течение последних десятилетий. Однако экспериментаторам в чистом виде эту субстанцию выделить не удалось. Это явилось серьезной преградой на пути изучения его молекулярной природы и выявления механизма действия. Выяснили, что диализат представляет собой гетерогенную смесь, в состав которой входит около 200 различных низкомолекулярных соединений [23,74]. Среди них полипептиды и полинуклеотиды [110], урацил, гипоксантин [137], простогландин [197], хемотаксические субстанции для неитрофилов [134], Т-тимозиноподобный пептид и только одна из субстанций ДЭЛ является антигенспецифическим ФП, который влияет на КОИ [8,13,105]. Для установления активной субстанции TF использовали высокоэффективные методы очистки: ультрафильтрация [143], гель-фильтрация на Sephadex G-25 [31,50], HPLC [97], аффинная хроматография [7], этанольная преципитация [101], иммунноаффинная хроматография [29]. На основании этих данных сделан вывод, что неочищенный ДЭЛ содержит большое количество веществ, которые обладают адъювантными и супрессивными свойствами [188]. Диализат экстракта лейкоцитов содержит две структуры противоположной активности: антигенспецифическую и функциональную. Эти активности получили названия индукторного и супрессорного факторов. Механизм действия индукторного фактора 1. Связывается со специфическим антигеном, к которому был получен диализат экстракт лейкоцитов, но не со специфическими антителами. 2. Может быть отделен от антиген-иммуносорбента с помощью 8М мочевины. 3. Обнаружен в Т-хелперах, отсутствует в Т-супрессорах. 4. Адсорбируется Т-супрессорами, макрофагами. 5. Содержится во фракциях диализата с Мм от 3500 до 12000 Da. 6. Придает антигенсвязывающее свойство не иммунным клеткам. Следовательно, индукторному фактору, который синтезируется Т-хелперами, свойственно образование фактора переноса. Кинетика воздействия супрессорного фактора в организме на клеточном уровне 1. Связывается со специфическим lg G, но не с антигеном, может быть выделен с помощью глицин-НСІ-буфера. 2. Содержится в Т-супрессорах, отсутствует в Т-хелперах. 3. Адсорбируется Т-хелперами, макрофагами. 4. Содержится во фракциях диализата с Мм от 5500 до 12000. 5. Блокирует активность индукторного фактора, супрессируя ответ иммунных клеток на специфический антиген in vitro. 6. Угнетает развитие кожных проб на специфический антиген у иммунизированных животных. Следовательно, супрессивный фактор не принимает участие в синтезе TF, а напротив тормозит его образование. Начиная с 60-годов прошлого столетия ученые пытались установить химический состав ФП, и лишь в начале 80-годов был проведен энзимологический анализ, предварительно очищенной фракции ДЭЛ с Мм 2000-4000 и установлена его структурная формула (рис. 2) [49]. При очистке ДЭЛ с помощью гель фильтрации на Sephadex G-25 было установлено, что только одна фракции ФП обладает антигенспецифической активностью [139].
В фракции разделенной с помощью HPLC биологическая активность была выявлена в 2 пиках. Ферментативное изучение этих пиков показало, что имеются 3 субстанции с активностью индукторно/хелперного фактора in vitro [24, 140, 199, 200]. Две из них присутствуют в первом пике HPLC, а третья во втором. Они структурно отличаются между собой. В первой фракции обнаружен предшественник фактора (TF-pre) и секреторный фактор переноса (TF-sec). Другая фракция содержит мембранный фактор переноса (TF-mem). Все три эти субстанции -олигорибонуклеотидной природы. Их биологическая активность (в частности, способность влиять на продукцию фактора ингибиции миграции лейкоцитов) возникает после обработки РІ нуклеазой и проназой, но не после обработки ДНК-азой [36]. TF-sec отличается от TF-pre наличием З -концевого фосфата. TF-mem не имеет фосфата на 3 конце, но имеет фосфат для активации этой субстанции. TF-pre TF-sec содержат пуриновые остатки, TF-mem имеет остатки пиримидина. У всех TF(pre, sec, mem) N-концевой пептид связан с аминонуклеопептидом через 5 фосфат. Пептидная цепь содержит 6-8 аминокислот [181]. С помощью аминокислотного анализа ФП различной антигенспецифичности в пептидном компоненте выделено 18 из 20 известных аминокислот. Это дает возможность утверждать, что антигенспецифичность фактора переноса обусловлена произвольной комбинацией аминокислот в пептидной цепи, что составляет 818 потенциальных комбинаций. 1.4. Свойства фактора переноса Уже в первых исследованиях было установлено, что ДЭЛ переносит КОИ только в тех случаях, когда донор имеет сильную кожную реакцию ГЗТ к антигену, но реакции к данному антигену не переносились реципиентам от доноров с отрицательными кожными реакциями [156].
Применение препаратов фактора переноса для лечения и профилактики инфекционных болезней животных и человека
Впервые ДЭЛ был применен как иммунопотенцирующий агент в 1970 году Levin и сотр. [114]. В дальнейшем препарат был использован для лечения широкого круга патологий, при которых были нарушены клеточные компоненты иммунной реакции [82]. Эти болезни могут быть разделены на 4 группы. 1. Первичные иммунодефицитные состояния, характеризующиеся снижением Т-клеточной активности [193]. 2. Рецидивирующие или острые диссеминированные инфекции, вызванные вирусами, грибами или внутриклеточными бактериями, особенно у лиц с неполноценной иммунной системой [185]. 3. Опухолевые заболевания [68,147,180]. 4. Заболевания предположительно инфекционной этиологии. Больших успехов добились при лечении грибковых заболеваний, препаратами, содержащими трансфер-фактор [98, 205], особенно тех болезней, возбудителем которых является Candida albicans [119,174]. Улучшение клинического состояния при лечении этих заболеваний в некоторых случаях составляло 80 % [113]. Для лечения бактериальных заболеваний медиатор использовали при туберкулезе легких (Mycobacterium tuberculosis) [141,177] и пневмонии, вызванной М. fortuitum [128, 198]. Активное влияние ФП оказывает на клеточный иммунитет при таких бактериальных инфекциях как стафилококк [46, 24,144, 179], сепсис [120, 142]. Диализат использовали при лечении различных паразитарных инвазий, например, лейшманиозе [161,162], криптоспоридиозе [63,121,126],причем антигенспецифический препарат был более эффективным по сравнению с адъювантным [26, 64,159]. Сенсибилизированные лимфоциты использовали при лечении широкого спектра вирусных инфекций [168]. Положительные результаты получены при лечении офтальмогерпеса [71, 148], Herpes simplex [185,1 95], Н. zoster [125], Н. simplex caratites [89, 127, 149], генитального герпеса [52, 145], герпес- вируса человека типа 6 [128, 146], а так же гепатита В [158, 208], острой лимфоцитарной лейкемии [62,172]. В настоящее время проводятся испытания лимфоцитарных препаратов для лечения ВИЧ - инфекционных больных [53 ,181]. Наибольшего успеха ученые добились в борьбе с оппортунистическими инфекциями, развивающимися на фоне состояния иммунодефицита [54, 182]. ДЭЛ применяли для лечения онкологических заболеваний [41, 80], бронхогенной карциномы [83, 84], рака легких [88,189] остеогенной саркомы [69, 95, 114]. Лечение данных заболеваний ФП в сочетании с химиотерапией приводило к улучшению состояния [57, 77, 78]. Препараты применяли так же для лечения меланомы [42, 44, 85], при этом наблюдалась регрессия подкожных злокачественных узлов [131, 160, 161]. Успешным было применение препаратов и при лечении некоторых других онкологических заболеваний : рака молочной железы [138, 165], лимфомы Буркетта [136], болезни Ходжкина [90, 91, 122, 133], детской лейкемии [62], аденокарциномы [60, 132, 153] и назофарингеальной карциномы [83, 84, 115]. 1.9.2.
Экспериментальное изучение препаратов фактора переноса на животных Большой вклад в изучение феномена TF, его природы и механизма действия имели эксперименты, проводимые на животных, о чем свидетельствует большое число статей по этому вопросу, появившихся в последнее время. Изучение действия ДЭЛ на моделях животных диктуется тремя задачами: 1. Создание системы, с помощью которой можно тестировать препараты иммуностимулятора, давая не только ключ к исследованию возможной активности имеющейся в данном медиаторе, но и путь определения протективной и / или терапевтической ценности этого препарата. 2. Разнообразие видов животных позволяет создать различные модели и протестировать препарат, полученный от одного вида животного на других видах животных и человеке, доказывая его способность преодолевать межвидовой барьер и переносить клеточно-опосредованный иммунитет ксеногенным животным. 3. Экспериментальные исследования на моделях лабораторных животных позволяет использовать ДЭЛ для лечения и профилактики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. Первые исследования по изучению активности диализата были проведены на малых грызунах 1204]. Больших успехов добились по изучению ФП на приматах [123, 124]. Опыты на них легко воспроизводимы так как их иммунная система по организации сходна с таковой у человека [170]. На приматах были исследованы ДЭЛ, полученные от доноров положительных к туберкулезу, антигенам эпидермического паротита, герпес - вирусу типа 1 [171], столбняка, монилиаза, кокцидиоидина [67]. Через 48 часов после инъекции приматы проявляли положительный ответ к антигенам, против которых был сенсибилизирован донор, оставаясь негативными к антигенам, против которых донор не был сенсибилизирован [87,173]. Используя диализат лейкоцитов морских свинок, сенсибилизированных к овальбумину КОИ был перенесен мышам-реципиентам. Причем было доказано, что оральный способ применения по эффективности не уступает внутримышечному и подкожному. Ультрафильтраты, полученные из лимфоцитов селезенки лошадей, сенсибилизированных к герпес-вирусу типа 1 индуцировали у мышей ГЗТ к антигенам вируса простого герпеса [15]. ФП в последнее время все больше и больше стали использовать в ветеринарии для лечения инфекций КРС и свиней. ДЭЛ, специфический к сальмонеллезной инфекции, предупреждает заболевания КРС [129, 130]. На модели лабораторных животных установлено, что диализат, полученный из лимфоидной ткани кроликов, иммунизированных вакциной против Salmonella choleraesuis, способен переносить кожную реактивность к этому возбудителю [43]. Препарат, полученный от кроликов - доноров, сенсибилизированных инактивированной формалином суспензией Е. coli, выделенного от больных эшерихиозом телят обладает высокой активностью и защищает реципиентов от заболевания [22]. Так же использовали ДЭЛ против Eimeria stediai - естественного паразита кроликов и Eimeria bovis - естественного паразита КРС [104, 126]. Инъекция телятам ФП, полученного из лимфоцитов лимфатических узлов животных, сенсибилизированных Е. bovis приводила к значительному уменьшению содержания яиц этого паразита (40 %) [121, 151]. В этих экспериментах препарат в значительной степени обеспечивал защиту и одновременно вызывал антигенспецифический ответ у реципиентов, даже если они были иммунизированы за 2-3 дня перед инъекцией. Высокая заболеваемость весенне-летним клещевым энцефалитом сделала актуальным поиск средств, обладающих антифлавивирусной активностью или повышающих резистентность к этому вирусу.
Повышенный интерес к данной проблеме послужил толчком к получению и тестированию ДЭЛ, обладающего специфическим иммунотропным действием. Тестирование ДЭЛ против клещевого энцефалита дало положительные результаты и провело к развитию ГЗТ и усилению КОИ в ответ на введение трансферфакторного препарата [27]. Среди этиологических факторов, которые вызывают вспышки желудочно-кишечных заболеваний, часто регистрируется ротавирус. Специфические особенности борьбы с этим заболеванием недостаточно изучены, так как не обеспечивают стабильный профилактический эффект. Поэтому необходимы новые нетрадиционные способы профилактики ротавирусных заболеваний. Для этого использовали ДЭЛ, полученный от быков черно - пестрой породы трехкратно сенсибилизированных ротавирусным антигеном. После введения препарата у бычков -реципиентов наблюдали стойкую кожную реакцию на вводимый внутрикожно ротавирусный антиген [21]. В качестве доноров так же использовали собак [163], овец [154], морских свинок [59, 65]. 1.9.3. Осложнения, возникающие у животных и человека при введении препаратов фактора переноса По данным литературы известно, что для лечения и профилактики заболеваний используются препараты из лейкоцитов периферической крови и лимфоидных органов человека и различных видов животных, приготовленные различными методами. Результаты, полученные в ходе многочисленных экспериментов говорят о том, что препараты ДЭЛ безвредны и не вызывают серьезных осложнений даже при применении высоких доз и на протяжении длительного времени [5]. Большинство ученых не наблюдали никаких осложнений при применении ФП и считают его не антигенным и безвредным. Низкая токсичность его препаратов, так же возможность его применения через рот создают дополнительные преимущества [109]. Однако, следует отметить, что в некоторых случаях наблюдалась боль и эритема в месте инъекции, но они не требовали специального лечения. При лечении синдрома Вискотт-Олдрича отмечалось развитие лимфом [167].
Тестирование иммунологической активности диализата экстракта лейкоцитов
В основе реакции ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ) лежит тот факт, что иммунокомпетентные клетки или ДЭЛ после повторного контакта с антигеном, к которому они были сенсибилизированы или получены, продуцируют различные лимфокины, которые влияли на миграцию индикаторных клеток (лейкоцитов). Как правило, происходит торможение миграции лейкоцитов и лишь в некоторых случаях наблюдается специфическое усиление миграции. Реакция ИМЛ является высокоспецифичной и четко коррелируете/ с реакцией ГЗТ, которую используют для тестирования активности ДЭЛ in vivo. Позитивной реакцией на антиген считается ингибиция миграции не менее чем на 20 % (IM 0.8). Индекс отражает степень сенсибилизации организма, чем ближе IM к 1 и больше зона миграции лейкоцитов, тем ниже уровень сенсибилизации организма к данному антигену, и ниже активность ДЭЛ. Приготовление агарозного геля. 1 гр. порошка агарозы размешивали в 45 см3 дистиллированной воды, расплавляли на кипящей водяной бане и охлаждали до 48С. потом добавляли 45 см3 среды Игла (с двойной концентрацией солей) с антибиотиками (100 ЕД/мл. и 100 мкг/см3 стрептомицина) и 10 см3 сыворотки крови КРС предварительно нагретых до 48С. Приготовление индикаторных клеток (лейкоцитов). К гепаринизированной крови (ЗОМЕ/мл) добавляли раствор хлорида аммония в соотношении 1:3 и оставляли при комнатной температуре на 20 мин. для спонтанной седиментации. Осадок, содержащий лейкоциты отбирали и осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 400 д. Клетки отмывали в растворе Хенкса с антибиотиками, разводили в среде Игла с добавлением 10 % сыворотки и подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Концентрация клеток соответствовала 3.5-4.0x108кл/см3. Приготовление пластин агарозы. Приготовленный агарозный гель, охлажденный до 48С быстро разливали в чашки Петри, толщина агара составляла приблизительно 3-4 мм., затем чашки Петри ставили в термостат для выявления возможной контаминации микрофлорой. Перед внесением суспензии в агарозе проделывали отверстия при помощи штампа. Вырезанные цилиндры агарозы удаляли при помощи пипетки. Приготовление суспензии для внесения в лунки. Сенсибилизированные лимфоциты или ДЭЛ вносили в лунки планшета или в пробирки по 0.1 см3, затем в лунки добавляли 0.1 см3 суспензии лейкоцитов и инкубировали в термостате при температуре 37С 60 мин. После инкубации вносили 0.02 см3 суспензии специфического антигена и помещали в термостат при температуре 37С на 60 минут. В качестве контроля брали суспензию клеток в поддерживающей среде. В лунки агарозы вносили, полученную суспензию и инкубировали при температуре 37С в течение 24 часов, в воздушной среде с С02 (до 5 %).
Оценка результатов реакции. Через 24 часа после инкубации измеряли диаметр циркулярных зон, при помощи линейки в рассеянном свете. Для сохранения результатов исследования пластины агарозы инкубировали 30 мин. с метанолом и 30 мин. с формалином, ополаскивали водой. Слой агарозы осторожно отделяли скальпелем. В таком виде они сохранялись практически неограниченное время. Оценку зон миграции в таком случае проводили при помощи проекционного аппарата. Затем высчитывали индекс миграции (IM) по среднему значению 8-10 лунок, по формуле: IM=A/B где, А - среднее значение миграции клеток в исследуемых образцах. В - среднее значение миграции клеток в контроле. 2.2.2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа Сущность реакции ГЗТ состоит в том, что после повторного внутрикожного введения антигена, к которому был сенсибилизирован организм, в месте инъекции уже через 6 часов начинает развиваться уплотнение тканей, сначала в виде эритемы, которая постепенно нарастает и достигает максимума через 24 - 48 часов после введения антигена. При повторном контакте с антигеном происходит активация Т -клеток, которые высвобождают ряд медиаторов (лимфокинов) и привлекают макрофаги и их предшественников в место локализации антигена (кожу), вызывая уплотнение. Приготовление растворов. Для сенсибилизации животных использовали соответствующий антиген. В качестве антигена так же применяли стандартный биопрепарат (вакцину), аттенуированный или инактивированный штамм возбудителя (вирусы, бактерии). Сенсибилизацию осуществляли аппликацией растворимых и взвешенных антигенов в форме водно - масляной эмульсии. Для этого приготавливали смесь антигенов с адъювантом, используя магнитную мешалку. Соотношение антигена и адъюванта чаще всего было 1:1. Сенсибилизация доноров. Для достижения наилучшего результата при сенсибилизации животных соблюдали следующие условия: Четко балансировали химические и физико-химические свойства антигена. Если для сенсибилизации организма животного использовали очищенный антиген, то первое введение проводили с полным адъювантом Фрейда, а последующие введения без адъюванта. Тщательно подбирали дозу и способ введения. Не существует никаких общих правил, для каждого конкретного случая. Дозу антигена, способ и кратность введения подбирали индивидуально в зависимости от вида животного и ожидаемого результата. Добивались достаточной напряженности иммунитета. Степень сенсибилизации организма животного обычно зависит от иммуногенности сенсибилизатора. Для достижения наилучшего результата гипериммунизацию проводили несколько раз (2-3 раза), повторное введение антигена проводили через 7-12 дней после первой инъекции. Рациональный подбор животного. Для сенсибилизации использовали животных различных видов. Из лабораторных животных предпочтение отдавали кроликам, морским свинкам, белым мышам и крысам. Установлено, что у этих животных реакция ГЗТ развивается наиболее наглядно. Учитывали возраст и упитанность животных. Для сенсибилизации чаще использовали молодых животных, так как по мере взросления реактивность организма уменьшается.
В корм животных добавляли витамин С (при отсутствии зелени), так как в условиях авитаминоза полноценная иммунизация невозможна. Учитывали масть животных. Для наглядности брали животных белой масти, так как эритему и уплотнение лучше наблюдать у животных со светлым цветом кожи. Индуцирование ГЗТ. Через 5-6 дней после последнего введения антигена (ДЭЛ) животных рестимулировали тем же аллергеном, которым проводили сенсибилизацию (против которого получен ДЭЛ). Антиген (без адъюванта) вводили внутрикожно в объеме 0.02 см3 кроликам и морским свинкам в область шеи (шерсть в месте инъекции предварительно удаляли), мышам в подушечку задней лапы. В качестве контроля в область шеи с противоположной стороны (лапу) вводили такой же объем ФБР, физиологического раствор, гетерологичный антиген или плацебо. В качестве контрольных животных для тестирования ФП использовали животных, которым вводили неспецифический ДЭЛ или препарат, полученный от несенсибилизированных животных. Оценка результатов исследования. Оценивание результатов реакции проводили по следующим критериям: - Учитывали степень эритемы. Определяли величину эритематознои зоны. Если ее диаметр больше 0.6 см, то считали как положительный результат реакции. Интенсивность эритемы так же оценивали в баллах (крестах) от 0 (отрицательная) до ++++ (темно-красная). - Определяли уплотнение на пике введения. Измеряли толщину складки кожи, образуемой одним и тем же участком поверхности до и после разрешающей инъекции, или путем сравнения с симметричным участком кожи на противоположной стороне тела. Увеличение толщины кожной складки в 2.5 раза по сравнению с исходным значением позволяло считать реакцию ГЗТ существенной. Так же высчитывали коэффициент утолщения по формуле:
Активация иммунокомпетентных клеток при иммунизации против ротавирусной инфекции: некоторые аспекты клеточного и гуморального ответа
Основу иммунологии составляют сведения о том, что для индукции любого вида иммунного ответа различные иммунокомпетентные клетки должны взаимодействовать друг с другом. В специфическом иммунном ответе на антигены любой природы макрофаги представляют антиген Т и В - лимфоцитам, а Т - лимфоциты оказывают В - лимфоцитам помощь при размножении и дифференцировке, происходящей под влиянием того же антигена. Однако к настоящему времени взгляд на механизм антигензависимой активации лимфоцитов при.действии антигена значительно усложнился. Прежде всего активация лимфоцитов оказалась процессом, безусловно, зависимым от межклеточного взаимодействия. Лишь в исключительных случаях можно предполагать изолированную активацию популяций Т или В - лимфоцитов. Нормальный, полноценный процесс развития иммунного ответа требует обязательного присутствия как Т так и В - лимфоцитов, что подразумевает активацию как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета. Первичная элиминация антигена на ранней стадии осуществляется Т - лимфоцитами, тогда как с 7 - 14 дня после первичного контакта активизируется гуморальное звено иммунитета. Целью нашего исследования было проанализировать сроки развития клеточного и гуморального иммунного ответа при различных способах активации Т и В - лимфоцитов у кроликов и телят в ответ на иммунизацию и гипериммунизацию ротавирусным антигеном КРС. Кроликов массой 3 кг. (п=3) трехкратно сенсибилизировали, первый раз препаратом инактивированного ротавирусного антигена КРС (титр 9.0 lg ТЦД so/мл), эмульгированного с масляным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 в дозе 2 см3, вторую и третью иммунизации проводили рота вирусным антигеном без адъюванта в дозе 2 см3, спустя 14 и 21 день. Сроки развития клеточного иммунитета оценивали с помощью реакции ГЗТ in vivo, и гуморального иммунитета по данным реакции диффузионной преципитации. Оценку уровня клеточного и гуморального иммунного ответа проводили перед каждой иммунизацией и через 6 дней после нее. Опыт на сельскохозяйственных животных проводили на 6 телятах Швицкой породы 30 дневного возраста. Двум животным вводили вакцину против ротавирусной инфекции КРС сорбированную инактивированную (ТУ 9384-033-00495527-02). Двум животным вводили вакцину ВНИИЗЖ против ротавирусной инфекции эмульгированную инактивированную. Телятам первой и второй групп за 3 дня до вакцинации был инокулирован препарат, содержащий ФП, полученный из селезенок кур, гипериммунизированных рота вирусом КРС в дозе, эквивалентной 8.5 108 клеток.
Телят третьей (контрольной) группы иммунизировали вакциной ВНИИЗЖ против ротавирусной инфекции аналогично 1 группе. На протяжении 5 месяцев с интервалом 7-10 дней оценивали степень активации клеточного иммунитета в реакции ингибиции миграции лейкоцитов под слоем агарозы и гуморального иммунитета методом ИФА. Результаты изучения развития клеточного иммунитета в реакции ГЗТ in vivo и гуморального иммунитета по данным РДП представлены в таблице 14. Из данных, приведенных в таблице 15 видно, что ДЭЛ, содержащий иммуностимулирующий ФП приводил не только к стимуляции клеточного иммунитета, что подтверждалось уменьшением ІМ в реакции ингибиции миграции лейкоцитов под слоем агарозы, но и к более выраженной активации гуморального иммунитета, о чем свидетельствовало повышение титров антител по данным ИФА у животных 1 и 2 групп по сравнению с титрами антител у животных 3 группы на 14-21 день после первой вакцинации. Полученные нами результаты позволяют сделать вывод, что иммунная реакция организма на введение антигенов обеспечивалась как клеточными, так и гуморальными факторами. Оценка динамики их развития показала, что иммунный ответ на ранних стадиях инфекционного процесса осуществлялся с помощью популяции специфически сенсибилизированных Т -лимфоцитов, которая начала функционировать уже через 5 дней после введения антигена. При этом нарастание силы клеточного иммунитета носило скачкообразный характер. Гуморальное звено иммунитета начало функционировать значительно позже (на 14 день) и нарастание его силы происходило более плавно. Кроме того, был проанализирован уровень иммунного ответа при применении препаратов, стимулирующих клеточное и гуморальное звенья иммунитета. Результаты, полученные при совместном введении животным стимуляторов гуморального (вакцина) и клеточного (ФП) иммунитета, позволили получить иммунный ответ по интенсивности превышающий ответ на введение только гуморального стимулятора (вакцины). Это опровергло существующее мнение о второстепенной роли клеточного иммунитета при кишечных вирозах молодняка сельскохозяйственных животных и подтвердило гипотезу о необходимости стимуляции каждого звена иммунитета для обеспечения стойкой защиты. 3.3.3. Анализ степени активации клеточного и гуморального иммунитета животных при стимуляции их организма препаратами, содержащими вирус ИРТ Детально известно, что формирование противовирусного иммунитета зависит не только от гуморальных факторов, которые представлены антителами, но и от особых вирусотропных веществ, вырабатываемых на клеточном уровне Т - лимфоцитами и от их способности взаимодействуя с вирусами подавлять их активность. Характер гуморального специфического ответа организма на вирусную инфекцию или иммунизацию вирусными препаратами широко изучался. Имеются достаточно сведений о специфической перестройке организма: известны сроки появления, максимального накопления и снижения специфических антител [19]. Однако, специфические защитные реакции организма на клеточном уровне при вирусных инфекциях освещены в научной литературе недостаточно полно.
Поэтому целью нашего исследования было: 1 - показать, что при стимуляции организма вирусным антигеном кроме антител вырабатываются клеточные медиаторы, которые также играют важную роль при защите организма от возбудителей вирусных инфекций; 2 -проанализировать зависимость между способностью организма вырабатывать специфические противовирусные антитела и продуцировать специфические клеточные медиаторы; 3 - показать существование иммунологической памяти при клеточном иммунном ответе; 4 - получить ДЭЛ из селезенок сенсибилизированных животных и показать способность этого препарата, минуя межвидовой барьер переносить КОИ неиммунным реципиентам; 5 - проанализировать как влияют препараты, содержащие ФП, а так же препараты, содержащие TF и вакцину, и только вакцины на развитие клеточного и гуморального иммунного ответа. Для решения поставленных задач было сформировано три группы телят Швицкой породы 30 дневного возраста. Первая группа - три теленка, были привиты коммерческой вакциной против ИРТ сорбированной инактивированнои производства ВНИИЗЖ (ТУ 9384 - 019 - 00495527 - 00). Три теленка второй группы были привиты экспериментальной инактивированнои эмульсионной вакциной против ИРТ на основе масляного адъюванта Монтанид - 70 (ISA). Третья группа, состоящая из 2 телят, являлась контрольной. Вакцины вводили внутримышечно в область крупа: сорбированную - в дозе 5 см3, эмульсионную - 1 см3. Через 21 день животных ревакцинировали в тех же дозах. За телятами вели наблюдение в течение 157 дней. Периодически у них брали пробы крови. В сыворотках крови определяли уровень гуморальных вирусспецифических антител к вирусу ИРТ КРС в РИГА. Параллельно проводили исследования цитратных проб крови для определения уровня КОИ в реакции ИМЛ под слоем агарозы. Результаты представляли в виде IM, который находится в обратно пропорциональной зависимости от уровня сенсибилизации организма вирусом ИРТ. Результаты исследований представлены в таблице 16.
