Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных вирусов 13
1.1.1. Общая характеристика семейства Picornaviridae 13
1.1.2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae 23
1.1.2.1. Полиовирусы 23
1.1.2.2. Вирусы Коксаки, ECHO и Энтеровирусы 68-71 25
1.1.2.3. Парэховирусы 26
1.1.2.4. Вирус гепатита А 28
1.1.3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических и химических факторов 32
1.1.4. Общая характеристика семейства Adenoviridae 33
1.1.5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы 39
1.2. Методы выявления кишечных вирусов в воде 43
1.2.1. Методы концентрирования вирусов из воды 44
1.2.2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и вирусов на силикагелях 47
1.2.3. Методы выявления кишечных вирусов 49
1.2.4. Молекулярные методы исследования 53
Глава 2. Материалы и методы исследования 60
2.1. Материалы 60
2.1.1. Культуральные штаммы вирусов 60
2.1.2. Клинические образцы и образцы сточных вод 60
2.1.3. Клеточные линии 60
2.1.4. Реактивы , 61
2.2. Методы 61
2.2.1. Молекулярно-биологические методы 61
2.2.2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды 62
2.2.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды 63
2.2.4. Пробоподготовка 63
2.2.4.1. Приготовление фекальных суспензий 63
2.2.4.2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала 64
2.2.5. Реакция обратной транскрипции (ОТ) 64
2.2.6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной
детекцией в режиме реального времени (Taq-Man) 65
2.2.7. Количественная ПЦР-РВ 65
2.2.7.1. Приготовление калибраторов 65
2.2.7.2. Построение калибровочных прямых 66
2.2.8. Электрофорез ДНК в агарозном геле 67
2.2.9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии 68
2.2.10. Методы выявления и идентификации кишечных вирусов 68
2.2.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 68
2.2.12. Статистическая обработка результатов исследований 69
Глава 3. Разработка методов концентрирования вирусов из воды 70
3.1. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды 72
3.2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот 77
3.3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах ММиММ+ 82
Глава 4. Разработка метода мультиплексной пцр-рв с впк для выявления днк и рнк кишечных вирусов 90
4.1. Подбор праймеров и зондов 90
4.2. Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов 93
4.3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР 94
4.4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ 100
4.5. Разработка методов количественной оценки ДНК
и РНК кишечных вирусов 102
Глава 5. Исследование клинических образцов и образцов сточных вод методом ПЦР-РВ 105
5.1. Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ 105
5.2. Анализ сточных вод методом ИКМ-ІІЦР-РВ 108
5.3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ 110
Выводы 112
Благодарности 113
Список литературы
- Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae
- Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды
- Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот
- Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В начале 70-х годов была доказана вирусная этиология небактериальных гастроэнтеритов. С тех пор стало известно, что возбудителями кишечных заболеваний человека могут быть энтеровирусы (ЭВ), ротавирусы, аденовирусы (АВ), калицивирусы, астровирусы, коронавирусы и другие. Все эти вирусы, за исключением коронавирусов, являются безоболочечными, что обусловливает их высокую устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять инфекционность вне организма (например, в воде или на пищевых продуктах) до нескольких месяцев, то^есть дольше, чем колибактерии [55]. Кишечные вирусы имеют фекально-оральный механизм передачи. Порядка 35% от всех острых кишечных инфекций (ОКИ) в РФ имеют водный путь передачи [16]. Вирусы выделяются в очень больших количествах с фекалиями инфицированного человека - больной гастроэнтеритом или гепатитом может экскретировать от 105 до 1012 вирионов с каждым граммом фекалий [18, 34]. Энтеровирусы выделяются из водопроводной воды даже после дезинфекции-[56, 78]. При оптимальных условиях вирусы способны проникать через почву на глубину более 100 метров [55].
Энтеровирусы оказывают самое различное воздействие на организм. Известно 66 серотиповэнтеровирусов способных вызывать более 20 различных синдромов: полиомиелит, миокардит, перикардит, плевралгия, респираторные заболевания, конъюнктивит, гепатит, асептический менингит, энцефалит, ящур, диабет и др. [111]. Около 90-95% случаев полиовирусной инфекции и примерно 50% случаев ECHO и коксакивирусной инфекции протекают бессимптомно [55]. Ротавирусы высококонтагиозны и являются главной причиной детских заболеваний, которые заканчиваются госпитализацией, в очень редких случаях летальным исходом. Более чем у 90% детей антитела к ротавирусам появляются до трехлетнего возраста. Вирус Норволк и другие калицивирусы являются частой причиной вспышек гастроэнтеритов в школах, семьях, больницах, лагерях отдыха [11, ПО, 115]. Большинство подростков имеют антитела к энтеральным калицивирусам. Аденовирусы и астровирусы чаще вызывают гастроэнтериты у детей и ограниченно патогенны для взрослых.
В.» настоящее время известно более 100 патогенных для человека вирусов, циркулирующих в водных объектах, 37 из них обнаруживаются; непосредственно в питьевой воде [57].
В этих условиях необходимость постоянного контроля^ за степенью контаминации кишечными вирусами вод поверхностных водоемов, грунтовых вод, сточной и питьевой воды не вызывает сомнений. Данные мероприятия; необходимо проводить также в связи; с тем, что во многих регионах России качество питьевой водьь не соответствует показателям, регламентируемым санитарными- правилами и нормами №2.1.4.1074-01 «Питьевая; вода: Гигиенические требованиям к качеству воды- централизованных систем питьевого*' водоснабжения: Контроль качества» [14]. Зачастую причиной? возникновения вспышек ОКИК является? загрязнение водопроводной воды сточными водами:
В последние; годы на территории России, имели место многочисленные
вспышки инфекционных заболеваний с водным путем; передачи,! в частности*
гепатита А, ротавирусного гастроэнтерита, энтеровирусного менингита и др. В;
то же время часто регистрировались/ вспышки; инфекционных; кишечных,
заболеванийс неясной этиологией. Затруднения шри;определениивозбудителей;этих
заболеваний отчасти связаньъ с несовершенством используемых методов выявления»
кишечных вирусов.- '.
Наиболее, сложным и несовершенным этапом вирусологического контроля* воды является процесс концентрирования вирусов; В настоящее время- в» распоряжении санитарных вирусологов,имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды [Г, 6], которые нуждаются в оптимизации, в. основном за счет применения новых,, доступных и высокоэффективных адсорбирующих материалов. В- этой связи поиск и изучение новых сорбентов на сегодняшний? день является весьма актуальной задачей.
Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии-человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации
(РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре, чувствительных клеток. В
научных исследованиях эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ), характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН. Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода Enterovirus и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирус гепатита А) с трудом поддаются культивированию. Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией^ продуктов амплификации,* мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени [3, 48, 53, 97].
Цели и задачи исследования.
Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтеровирусов (ЭВ), аденовирусов (АВ) и вируса* гепатита А (ВГА) из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной- і ПЦР в режиме реального времени.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить- следующие задачи:
Синтезировать несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды.
Отработать методы количественного учета ДНК и РНК вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды.
В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов.
Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентной- детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов.
Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦР-РВ и культуры клеток.
6. Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрирования, вирусов из образцов сточных вод; на. наличие АВ, ЭВ; и BFA методами мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР интегрированной с культуральным методом.
Научная новизна работы.
Г. Впервые показана возможность с высокой- эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.
2. Впервые в- России; разработан метод для одновременного выявления
аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А с использованием внутреннего
положительного контроля, основанный. на мультиплексной ПЦР с флуоресцентной
детекцией в режиме реального времени.
3. Для;оценки-эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды
был предложен оригинальный метод, основанный' на- количественном определении
вирусных нуклеиновых кислот С ПОМОЩЬЮ ПЦЕ-РВ;,
Практическая значимость.
Сорбент на основе магнитных микрочастищ покрытых модифицированным? аминогруппами полимером диоксида кремния^ может быть использован» для высокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды. Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным методом» с помощью сильных магнитов, описанным в настоящей работе, не прибегая к центрифугированию больших объемов воды. Метод может быть использован для контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения.
Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией; в режиме реального времени для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита А может использоваться в: качестве тест-системы как. для* контроля, за вирусной контаминацией воды (после стадии концентрирования вирусов), так и для анализа лизатов клеточных культур, зараженных вирусным материалом, а также в диагностике ОКИ.
3. Разработанные методы количественного определения вирусных ДНК и РІЖ могут быть использованы для контроля за активностью вирусной репродукции и эффективностью противовирусной терапии у пациентов, а также в научных исследованиях при испытании противовирусных препаратов в культурах клеток и на лабораторных животных.
Основные положения, выносимые на защиту.
Магнитные микрочастицы, покрытые модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, позволяют с достаточно высокой степенью эффективности концентрировать кишечные вирусы из воды.
Разработанная мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет выявлять аденовирусы, энтеровирусы и вирус гепатита А в клинических образцах, лизатах зараженных клеточных культур, и элюатах, полученных в результате концентрирования вирусов из воды.
Применение метода выделения нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов нуклеиновых кислот (НК), свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.
4. Количественная ПЦР-РВ может быть использована как метод оценки
эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды.
Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae
Последняя вспышка полиомиелита в РФ была зарегистрирована в 1995 году в Чеченской республике из-за нарушения календаря прививок. В результате заболело 143 человека и еще 3 человека - в соседней Ингушетии. В развитых странах это заболевание уже долгие годы не регистрируется.
Первичная репродукция полиовируса (ПВ) происходит в слизистой оболочке полости рта, глотки и тонкого кишечника, лимфатических узлах и пейеровых бляшках. В инкубационном периоде вирус обнаруживается в носоглотке и фекалиях, при появлении клинических симптомов вирус уже не выявляется в носоглотке, но продолжает обнаруживаться в фекалиях. Из лимфатической системы вирус попадает в кровь и проникает в ЦНС, распространяясь вдоль аксонов периферических нервов и далее вдоль волокон нижних двигательных нейронов. В процессе внутриклеточной репродукции вирусы повреждают или полностью разрушают эти клетки, вызывая поражение спинного и головного мозга [95, 96]. Наиболее чувствительны к ПВ клетки передних рогов спинного мозга, деструкция которых вызывает развитие параличей. Пораженные клетки ЦНС, утратившие свою функцию, могут в дальнейшем полностью восстановиться. Кроме поражения ЦНС могут развиваться миокардиты, изъязвление лимфатических фолликулов, гиперплазия лимфатической ткани.
Среди лабораторных животных к вирусу полиомиелита наиболее восприимчивы приматы, которые могут быть заражены перорально, интраназально, подкожно или введением вируса в мозг. Экспериментальная инфекция сопровождается появлением менингеальных симптомов и параличей конечностей. Адаптация- вируса возможна и к другим видам животных, например, хомякам и белым мышам, особенно привнутримозговом! введении [150]. Пассажи на грызунах сопровождаются постепенной потерей патогенности для обезьян и человека.
Существуют следующие клинические формы инфекции, вызываемой вирусом полиомиелита [74]: 1) инаппарантная инфекция без клинически выраженных симптомов; 2) легкие клинические формы болезни без параличей; 3) асептический менингит; 4) паралитический полиомиелит.
Инкубационный период продолжается обычно 7-14 дней, но может колебаться от 3 до 35 дней. Обычно диагноз на ранних стадиях заболевания устанавливают лишь в 1% случаев. Нередко заболевание имеет двухволновое течение, когда одна форма болезни переходит в другую, при этом после легкой формы может наступить улучшение, а затем развиться тяжелая форма полиомиелита [112].
Вируснейтрализующие антитела появляются вскоре после заражения, иногда до появления симптомов болезни. Однако даже высокая концентрация антител в сыворотке больных не предотвращает возникновение параличей после того, как вирус проник в ЦНС [107].
Антитела сохраняются в течение всей жизни. У переболевших развивается стойкий гуморальный иммунитет и резистентность клеток слизистой оболочки кишечника к гомологичному типу вируса. Перекрестный иммунитет слабо выражен и встречается в основном между 2-м и 3-м типами. Материнский иммунитет сохраняется в течение 3-5 недель жизни.
Источником инфекции является человек. Больной полиомиелитом выделяет вирус как в течение всего периода заболевания, так и в период полного выздоровления и еще длительное время спустя. Инфекция часто возникает в результате бытового контакта в семье. Высокая резистентность вируса к факторам внешней среды способствует длительному выживанию его в канализационных водах, фекалиях, некоторых пищевых продуктах. Вирус, накапливающийся в первые дни заболевания в слизистой оболочке верхних дыхательных путей, может, попадая в воздух при- кашле, чихании, обусловливать воздушно-капельный механизм передачи, хотя доминирующее значение имеет фекально-оральный. Возможен также перенос вируса навозными и домашними мухами. Заболевание чаще возникает у детей, нежели" у взрослых, в связи-с появлением у последних приобретенного иммунитета. В то же время при попадании вируса в изолированные популяции взрослые и дети болеют с одинаковой частотой. Часто возникают инаппарантные инфекции, которые обусловливают развитие иммунитета [75].
Вирусы Коксаки вызывают у людей различные клинические формы болезни — асептический менингит, герпангину, миокардит, перикардиты, респираторные заболевания, диабет (табл. 1). Вирусы Коксаки делят на 2 группы - А и В.
Некоторые типы вирусов Коксаки А и все типы вирусовч Коксаки В размножаются в культуре клеток эмбриона человека, почек обезьян и других культурах, вызывая выраженное ЦПД. Все типы могут быть выделены при заражении сосунков белых мышей, у которых возникает паралитическая форма инфекции [2].
Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды
Приготовление магнетита. 25 г FeS04 7H20 и 25 г Fe2(S04)3 9H20 растворяли в дистиллированной воде, объем доводили до 500 мл. Порциями выливали этот раствор віл кипящего 5%-ого- гидроксида калия, постоянно перемешивая? стеклянной палочкой. В результате выпадал черный осадок, который, после охлаждения многократно- декантировали и промывали дистиллированной водой до тех пор, пока значение рН не достигало 7-7,5.
Покрытие магнетита полимером диоксида кремния. 50 мл взвеси магнетита смешивали с 230 мл 10%-ого тетраэтилортосиликата (TEOS) и 200 мл глицерина и добавляли дистиллированную воду до объема 480 мл. Хорошо перемешивали и подводили рН до значения 4,6, используя ледяную уксусную кислоту. Реакцию полимеризации проводили при температуре 90С в течение 2 часов- в трехгорлой круглодонной колбе КГУ-3 объемом 500 мл с обратным шаровым холодильником и термометром: Для перемешивания реакционной смеси использовали верхнеприводную мешалку, нагрев проводили в колбогрейке.
После окончания синтеза сорбент промывали сначала деионизованной водой (2 раза по 500 мл) затем этанолом (2 раза по 500 мл) и снова водой (5 раз по 500 мл). Промытый таким образом сорбент использовали в экспериментах в соотношении 1:1 с деионизованной водой по объему (в 1 мл рабочей суспензии сорбента содержалось 25 мг сухого ММ).
Концентрирование вирусов проводили по следующей схеме: к 50 мл водопроводной воды или 150 мл 25мМ глицинового буфера (рН=7,0) добавляли по 10 мкл АВ, ПВ или ВГА (концентрация вирусных НК в исходном материале, оцененная методом количественной ПЦР-РВ, составляла 104-105 копий/мкл) и 50 мкл взвеси сорбента ММ или ММ+ (кіл воды добавляли 1 мл сорбента). Сорбцию проводили при постоянном перемешивании на шейкере в течение 1 часа при скорости вращения 170 об./мин. и собирали частицы сорбента с помощью редкоземельного магнита (сплав неодима, железа и бора, сила сцепления 22 кг). Вирус элюировали добавлением к сорбенту 100-150 мкл (при сорбции из 1 л - 1 мл) раствора следующего состава: 0,5М трис(гидроксиметил)аминометащ 0,5М NaCl, рН=11,0 в течение 15 минут. Далее подводили рН до значения 6,0-7,0 с помощью соляной кислоты и выделяли НК вирусов по методике, описанной в параграфе 2.2.4. получали из лизата зараженных культур клеток. Клетки лизировали 3-х кратным замораживанием-оттаиванием. ВГА экстрагировали из фекалий больных гепатитом А. Диагноз «вирусный гепатит А» у пациентов был подтвержден методом ИФА. Наличие вируса в культуральных и клинических образцах контролировали методом трансмиссивной электронной микроскопии.
Образцы фекалий, смешанные с фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) в соотношении 1:4 по объему, гомогенизировали на встряхивателе до однородной суспензии. Центрифугировали при 10 тыс. об./мин. на микроцентрифуге в течение минут. Далее отбирали супернатант и использовали для выделения нуклеиновых кислот (НК).
Суммарную НК из» образцов выделяли, используя коммерческий набор реактивов «Изоген» (Россия) и магнитные микрочастицы, покрытые полимером диоксида кремния (ММ), собственного приготовления. Для выделения вирусных НК к 100 мкл образца добавляли 400 мкл Лизирующего реагента и 20 мкл Nucleo или ММ и суспендировали в течение 5 минут на встряхивателе. Затем добавляли 800 мкл Солевого буфера и центрифугировали при 5000 об./мин. на микроцентрифуге в течение 30 сек. При выделении НК из фекальных суспензий проводили повторную промывку 200-400 мкл Лизирующего реагента. Далее с помощью перистальтического насоса отбирали1 супернатант и ресуспендировали осадок в 1 мл Солевого буфера, центрифугировали приЗООО об./мин. в течение 30 сек. Проводили повторную промывку Солевым буфером, как описано выше, и. высушивали сорбент при 65С 5 минут и проводилиэлюцию раствором Extra Gene Е в течение 10 минут при постоянном перемешивании на встряхивателе. Суспензию центрифугировали при 13000 об./мин: 1 минуту, после чего отбирали 10-мкл элюата на реакцию обратной транскрипции. Приведенная выше последовательность действий представляет собой модификацию метода Boom R. с соавторами [32].
При постановке мультиплексной реакции ОТ 3 мкл эквимолярной смеси праймеров (pHArt, pErt и PIV2rt) или один специфический праймер - при постановке моноспецифической реакции, в концентрации 6,25 пмоль/мкл, смешивали с 10 мкл РНК и прогревали смесь при 65С в течение 5 минут. Далее охлаждали при комнатной температуре в течение 3 минут и добавляли в каждую пробирку по 17 мкл реакционной смеси следующего состава: буфер для ОТ, 0,15 мМ каждого дНТФ, 1,5 ед. ингибитора рибонуклеаз и 40 ед. ревертазьг M-MuLV («СибЭнзим-М», Россия). ОТ проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия): 42С - 5 минут, 94С - 5 минут (инактивация ревертазы).
Качественный и количественный анализ образцов вирусной ДНК и РНК методом ПЦР-РВ проводили на приборах АНК-16 и АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург, Россия). В реакционную, смесь, (буфер для ПНР, 0,15 мМ каждого дНТФ, 2,5 мМ MgCl2) добавляли 5 мкл. вирусной ДНК (кДНК), 3,125 пмоль каждого праймера, 2,5 пмоль каждого зонда (для моноспецифической реакции одну пару праймеров и один зонд) и 1,25 ед. Hot Start Taq ДНК-полимеразы («СибЭнзим-М», Россия), доводя до конечного объема 25 мкл деионизованной водой. Амплификацию проводили по следующей; программе: 95С - 90 сек (1 цикл), 60С - 45 сек, 95С - 20 сек (45 циклов).
Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот
С целью определения механизмов адсорбции и влияния внешних условий на сорбционные процессы был проведен ряд модельных экспериментов по концентрированию белков из воды и выделению НК с помощью сорбента ММ (табл. 3).
В качестве модельного белка был выбран относительно доступный бычий сывороточный альбумин (БСА), так как его изоэлектрическая точка (pi) близка к pi капсидных белков аденовируса (АВ), pi БСА=4,8, pi гексона АВ 4,55 [20]. В ходе экспериментов были подобраны условия сорбции и элюции, определены динамика сорбции и ориентировочная емкость ММ.
Определение емкости ММ проводили путем концентрирования 1,5 мг БСА из 50 мл деионизованной воды. Адсорбцию проводили на 50 мкл магнитных микрочастиц в четырех различных условиях: с незаряженным сорбентом ММ при pH 7,0 и 3;5, и с отрицательно заряженными магнитными микрочастицами (ММ-) прис тех же значениях рН. Сорбент ММ- получали, обрабатывая: ММ 0,05МС раствором NaOH в течение 2 часов при постоянном перемешивании.. Благодаря отрицательному заряду частиц, сорбент ММ- не образовывал агрегатов: Элюцию проводили в 250 мкл раствора следующего состава: 0,5М Трис-буфер, 0,5М NaCl, рН=11,0 или тем же раствором с добавлением лизоцима. Лизоцим добавляли в элюирующиш раствор в качестве белка; конкурирующего с БСА за поверхность ММ. Такой прием; часто используется при элюции белков с МПС или силикагелей, правда, чаще всего применяется мясной экстракт или аминокислоты (глицищ аргинин) [137]. Лизоцим был выбран из-за того; что его изоэлектрическаягточка близка к 11,0, то есть в элюирующем растворе заряд белка близок к нейтральному. В этих условиях лизоцим сорбируется на ММ по гидрофобному механизму. Вторая причина; по которой был выбран лизоцим - это его небольшая молекулярная масса (Г4400 Да), а, соответственно и размер, благодаря которому он способен проникать даже в самые мелкие поры силиката.
Лучшие результаты по адсорбции белка были достигнуты в условиях рН близкого- к нейтральному с незаряженным, сорбентом и при? кислом? значении-, рН=3,5 с отрицательно заряженным магнитным?сорбентом. Добавление лизоцимаш элюирующий раствор заметного влияния на элюцию не оказало.
На: рисунке 15 представлены результаты электрофоретического анализа: ; препаратов БСА, полученных в результате элюции с сорбентов ММ и ММ- после сорбции белка при различных значениях рН.
Из полученных результатов можно сделать вывод, что адсорбция БСА происходит как за счет электростатических взаимодействий, так и за; счет гидрофобных. При условии одноименного заряда белка и сорбента;адсорбция БСА не происходила, а при разноименных зарядах были получены схожие результаты с данными, полученными при; незаряженном сорбенте и нейтральном рН. При разноименных зарядах БСА и сорбента несколько снижалось количество элюированного белка по сравнению с незаряженным сорбентом и рН=7,0.
Данные о емкости ММ были получены с помощью спектрофотометрического измерения оптической плотности (при длине волны 280 нм) исходного препарата БСА, супернатанта, отобранного сразу после сорбции БСА, и элюата. Концентрацию белка в растворах определяли используя калибровочную кривую, отражающую зависимость концентрации БСА от оптической плотности при длине волны 280 нм. По данным этих измерений делали вывод о емкости сорбента и эффективности элюции белка (табл. 4).
На снижение количества элюированного белка по отношению к адсорбированному могли повлиять следующие условия: 1. Крупнопористая, сетчатая структура поверхности частиц сорбента ММ, в которой механически могут застревать молекулы БСА. 2. Потери БСА в результате промывок, которые проводились для удаления не связавшегося с сорбентом белка. 3. Потери сорбента ММ в ходе эксперимента.
Модельные эксперименты с БСА показали, что емкость сорбента ММ при нейтральном значении рН и ММ- при рН 3,5 составляла около 20 мг белка на 1 мл взвеси сорбента (табл. 4). Для полной адсорбции 1,5 мг БСА в этих условиях из 50 мл воды требовалось примерно 30 минут (объем сорбента 100 мкл).
Также было проведене сравнение эффективности выделения НК на ММ с эффективностью выделения на сорбентах, представляющих собой обычные силикагели. Первоначально была изучена эффективность сорбции-элюции плазмидной ДНК. С этой целью приготовили растворы, содержащие различные концентрации плазмиды pUC18 («Stratagene», США), 1, 5, 10; 15 и 20 мкг/100 мкл, и выделяли из них ДНК в трех повторах с помощью 3-х различных сорбентов: сорбента из коммерческого набора реактивов фирмы «Изоген», силикатных частиц, полученных измельчением фильтров GF/A («Whatman», США) [33] и с помощью сорбента ММ. Результаты эксперимента оценивали на планшетном флуориметре (Anthos Zenyth 3100, Австрия) при длине волны возбуждения 485 нм и испускания -535 нм, добавляя образцы в буфер, содержащий интеркалирующий краситель SYBR-Green I («Sigma», США) в концентрации 1:10000. Показания прибора в опытном образце сравнивали с показаниями для исходного образца, делая поправку на фон. Эффективность выделения ДНК выражали в процентах элюированной НК от исходной (табл. 5).
Проведенные эксперименты показали, что средняя эффективность выделения плазмиднои ДНК для GF/A, сорбента-фирмы «Изоген» и ММ составила 45,7, 46,1 и 75,2%, соответственно. То есть выход плазмиднои ДНК в элюате, выделенной с использованием ММ, был выше, чем у сорбентов, представляющих собой обычные ; силикатные частицы. Разница показателей была статистически достоверной (t=3,2, Р 0,05).
Далее была оценена эффективность сорбции-элюции вирусной РНК на сорбентах фирмы «Изоген» и ММ. Для этого проводили выделение РНК из образцов, представляющих собой серийные 10х разведения фекальных суспензий от больных с ГА в трех повторах. Результаты оценивали с помощью ОТ-ПЦР-РВ с использованием интеркалирующего красителя SYBR-Green 1 и зонда для ПЦР-РВ. Данные, полученные в этом эксперименте, представлены в таблице 6, где приведены средние значения пороговых циклов (Ct , threshold cycle, - цикл, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции (пороговая флуоресценция), которая детектируется светочувствительной матрицей прибора).
Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов
Данные таблицы 15 свидетельствуют о том, что концентрация НК ЭВ в реакционной смеси составляла 10-10 копий на пробирку, что соответствует, примерно 5 108 копий/мл. Эти данные говорят о том, что для снижения временных затрат на анализ можно значительно сократить время инкубации зараженной культуры клеток с 7 до 1-2 дней [122]. Наличие ингибиторов ПЦР в реакционной смеси контролировали с помощью ВПК с известной концентрацией НК. Отклонение значения Ct от стандартного более чем на 2,5-3 цикла или отсутствие флуоресценции на канале ВПК, свидетельствует об ингибировании ОТ-ПЦР-РВ. Использование метода ИКМ-ПЦР-РВ позволило исключить влияние ингибиторов на реакцию, то есть отклонение Q от стандартного значения у ВПК не превышало 3-х циклов. Вместе с тем, метод ИКМ-ПЦР может значительно снизить эффективность выявления в образцах вирусов, не размножающихся в культуре клеток или имеющих длительный цикл репродукции. Поэтому перед заражением культуры клеток образец необходимо аликвотировать с целью его прямого анализа методом ПЦР на вирусы, не размножающиеся в культуре клеток.
Для испытания разработанного метода мультиплексной ПЦР-РВ на образцах сточных вод из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова были получены 66 образцов воды с очистных сооружений Москвы, и Московской области. Образцы представляли собой элюаты, полученные в результате концентрирования-вирусов на флизелиновых пакетах с МПЄ.
Одной из основных сложностей, возникающих при выявлении кишечных вирусов из образцов сточных вод, является большое количество ингибиторов ОТ и ПЦР; которые могут содержаться в образцах сконцентрированных вирусов: В связи с этим-возникает необходимость эффективного удаления ингибиторов на стадии выделения вирусных НК. В настоящее время для выделения вирусных НК из биологических образцов широко применяются модификации методики Boom R. с соавторами, основанной на сорбции НК на силикагеле по гидрофобному механизму в условиях высокой ионной силы и в присутствии хаотропного агента, как правило, гуанидин изотиоционата [32]. Данный, метод не только прост в исполнении, но и занимает относительно немного времени. В настоящей работе в качестве основного - метода выделения суммарной НК из биологических образцов также применялась методика, предложенная Boom R. с соавторами, принципиально отличающаяся от оригинальной применением в качестве сорбента ММ.
С использованием ММ из образцов сточных вод выделяли суммарную НК, которая была проанализирована методом мультиплексной ПЦР-РВ на наличие АВ, ЭВ и ВГА (рис. 22). Результаты ПЦР-РВ показали, что 29 образцов содержали ДНК АВ, что составило 43,9% от общего количества, 4 образца - РНК ЭВ (6,1%) и 1 образец содержал РНК ВГА (1,5%). Кроме того, 2 образца (ОС Южное Бутово) содержали НК как АВ, так и ЭВ (3,0%), а в одном образце, полученном с Люберецких ОС, содержались НК всех трех групп патогенов (1,5%). В 29 образцах вирусных НК выявлено не было (43,9%). Выявить в образце с помощью КМ сразу несколько подтверждает ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ для эпидемиологических исследований.
Важными критериями при анализе образцов сточных вод методом ПЦР-РВ были значения Q и характер изменения интенсивности флуоресценции для ВПК, как показатель отсутствия или наличия ингибиторов ОТ и ПЦР в препаратах НК. Нужно отметить, что во всех 66 образцах, выделенных модифицированным методом Boom R. на сорбенте ММ, значения Ct для ВПК разных образцов варьировали в пределах 3 циклов относительно среднего значения. Характерные признаки ингибирования ПЦР, такие как отсутствие роста флуоресценции или пологий характер роста кривых для ВПК, отсутствовали.
Таким образом, была показана принципиальная возможность выявлять кишечные вирусы в воде из образцов сточных вод методом мультиплексной ПЦР-РВ с ВПК. Метод выделения НК на сорбенте ММ можно рекомендовать для анализа методом ОТ-ПЦР образцов, содержащих большое количество ингибирующих ОТ-ПЦР агентов, таких как элюаты, полученные в результате концентрирования вирусов из воды, или фекальные суспензии.
