Введение к работе
Актуальность темы. Желудочно-кишечные заболевания КРС наносят значительный экономический ущерб в странах с развитым скотоводством. Инфекционные энтериты привлекают внимание ученых и практиков вследствие их широкой распространенности, полиэтиологичности, а также низкой профилактической и терапевтической эффективности проводимых мероприятий.
В настоящее время появляется все больше сообщений о том, что энтериты телят могут вызываться энтеровирусами, парвовирусами, вирусом диареи крупного рогатого скота, герпесвирусом, хламидиями, способными обуславливать заболевание самостоятельно, или в различных сочетаниях. Решение проблемы борьбы с этими болезнями осложняется преимущественно смешанной формой их течения. Нет сомнений, что одной из причин, порождающих трудности в борьбе с этими заболеваниями, является недостаток знаний об их этиологии, о свойствах агентов, их вызывающих, методах диагностики, профилактики и лечения.
Учитывая сходство в течение заболевания, важную роль играет своевременная и точная постановка диагноза с использованием методов лабораторной диагностики. Такие методы выявления данных вирусов, как электронная микроскопия, иммуноферментный анализ, реакция нейтрализации, не всегда обладают достаточной чувствительностью. Это обусловливает необходимость использования методов молекулярной биологии, таких, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), главным достоинством которой является специфичность и чувствительность.
Несмотря на выше сказанное, до настоящего момента в Российской Федерации методы выявления и дифференциации для энтеровируса и парвовирусов КРС не разрабатывались.
Цепи и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка методов выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в биологических образцах с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования, а также изучения распространённости и генетического разнообразия данных вирусов на территории Центрального федерального округа Российской Федерации (ЦФО РФ).
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить первичную структуру исследуемых областей генома ранее изученных штаммов энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1,2,3;
- разработать методы выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов
КРС 1,2,3с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования;
- установить первичную структуру и провести сравнительный анализ
амплифицированных фрагментов генома полевых изолятов энтеровируса КРС и
парвовирусов КРС 1,2,3;
изучить возможность применения разработанных методов для выявления генома энтеровируса КРС и парвовирусов КРС 1, 2, 3 в материалах от естественно инфицированных животных;
изучить распространённость и генетическое разнообразие энтеровируса и парвовирусов КРС на территории РФ с помощью разработанных метода;
Научная новизна и теоретическое значение. Разработаны методы ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием внутреннего контрольного образца (ВКО) и метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 в образцах вируссодержащего материала с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования.
Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей 5' -нетранслируемой области генома полевых изолятов энтеровируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры данных фрагментов генома энтеровируса КРС. Исследованы вероятные филогенетические отношения между выявленными полевыми изолятами и ранее опубликованными последовательностями энтеровируса КРС. Впервые изучено распространение и генетическое разнообразие энтеровируса КРС, циркулирующего на территории РФ.
С использованием разработанного метода определены нуклеотидные последовательности фрагментов геномов полевых изолятов парвовирусов КРС 1, 2, 3, выявленных на территории РФ, изучено их генетическое разнообразие. Изучение парвовирусов КРС 2, 3 в РФ проводилось впервые.
Практическая значимость. В результате проведенных исследований, разработаны:
«Методические рекомендации по выявлению генома энтеровируса КРС с помощью полимеразной цепной реакции» (2008 г.). Методика предназначена для выявления генома энтеровируса КРС в патологическом материале от КРС;
«Методические рекомендации по выявлению генома парвовируса КРС 1, 2, 3 типа с помощью полимеразной цепной реакции» (2009 г.).
Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены ученым советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ».
5 Основные положения, выносимые на защиту:
- метод ОТ ПЦР для выявления генома энтеровируса КРС с использованием
ВКО;
метод выявления генома парвовирусов КРС 1, 2, 3 при помощи полимеразной цепной реакции и секвенирования;
первичная структура исследуемых областей генома ранее изученных штаммов и полевых изолятов энтеровируса КРС, а также его филогенетические взаимоотношения;
- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и полевых
изолятов парвовирусов КРС 1,2,3;
- результаты применения разработанных методов выявления генома
указанных вирусов в материалах от естественно инфицированных животных;
результаты исследований распространенения и генетического разнообразия энтеровируса КРС на территории Центрального Федерального округа РФ с помощью разработанного метода;
результаты исследования генетического разнообразия парвовирусов 1,2,3, обнаруженных в материалах от естественно инфицированных животных на территории РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы в материалах конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (ВНИИВВиМ, г. Покров, 2009 г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2007 - 2009 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 научные работы, две из них опубликованы в журналах «Ветеринария» и «Ветеринарная патология», которые предусмотрены перечнем ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 126 источников, в том числе 14 на русском языке и 112 зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками.
