Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Характеристика возбудителя бешенства 9
2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по бешенству в России и в мире 14
2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве 19
2.4 Лабораторная диагностика бешенства 22
2.5 Определение уровня антител в сыворотках крови 31
2.6 Меры борьбы с бешенством 34
2.7 Заключение по обзору литературы 45
3 Собственные исследования 47
3.1 Материалы и методы 47
3.2 Результаты собственных исследований
3.2.1 Отбор проб патологического материала 59
3.2.2 Контроль поедаемости оральных антирабических вакцин 60
3.2.3 Разработка метода определения антител к гликопротеину вируса бешенства в сыворотках крови животных в иммуноферментном анализе 79
3.2.4 Разработка метода выявления антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте иммуноферментного анализа 90
3.3 Обсуждение результатов 98
4 Заключение 109
5 Список сокращений 111
6 Список литературы
- Эпизоотологические особенности и ситуация по бешенству в России и в мире
- Определение уровня антител в сыворотках крови
- Результаты собственных исследований
- Разработка метода выявления антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте иммуноферментного анализа
Эпизоотологические особенности и ситуация по бешенству в России и в мире
Фиксированные штаммы вируса бешенства. Фиксированные штаммы имеют большое значение как объект научного изучения и практического использования. Впервые фиксированный штамм ВБ получен Л. Пастером и был использован для изготовления первой антирабической вакцины. Фиксированные штаммы условно подразделяют на вакцинные и лабораторные.
Вакцинные штаммы применяются для производства антирабических вакцин. К вакцинным относятся штаммы SAD, ERA, Flury, Kelev, и др. В России в прошлом для производства инактивированных мозговых вакцин ветеринарного назначения использовался штамм «Овечий». Используя методы селекции, из него были получены фиксированные штаммы «Щелково-51», «0-73 Уз-ВГНКИ», «РБ-71», «Краснопресненский-85», а впоследствии штаммы ТС-80, «ВНИИЗЖ» и РВ-97. Для производства вакцин медицинского назначения используется штамм Внуково-32 [6].
Лабораторные штаммы используются в различных диагностических реакциях, а также при проверке активности антирабических вакцин путем заражения вакцинированных животных. Лабораторные штаммы представлены двумя близкородственными штаммами CVS и PMPV, полученными из Пастеровского штамма вируса бешенства [190].
Механизм и пути передачи возбудителя. Заражение происходит при непосредственном контакте с источниками возбудителя бешенства в результате укуса или ослюнения кожных покровов или слизистых оболочек. Доказаны также аэрогенный, алиментарный и трансплацентарный пути передачи вируса. Описаны несколько случаев заражения людей в результате операции по трансплантации органов и тканей [165].
Инкубационный период при бешенстве зависит от многих факторов: места проникновения вируса в организм, количества проникшего в организм вируса, вирулентности и других биологических свойств вируса.
Чем богаче нервными окончаниями ткань в области ворот инфекции, тем выше вероятность развития инфекции. Наиболее опасны раны в области головы, шеи, плечь, а у людей - в области кистей рук. Укусы на бесшерстных местах кожи животных и на незащищенных частях тела людей особенно опасны, так как одежда и шерсть задерживают значительную часть слюны больного бешенством животного. Имеет значение и степень резистентности организма, зависящая от вида, состояния здоровья, возраста животного и многих других факторов [20].
Источники и резервуары. К ВБ чувствительны все виды теплокровных животных. Повышенной восприимчивостью отличаются дикие представители семейства собачьих (лисица, волк, шакал, енотовидная собака) и куньих, а также грызуны многих видов и домашняя кошка. Менее восприимчивы человек, собака, рогатый скот, лошадь, очень слабо восприимчивы птицы [21]. С учётом характера резервуара возбудителя различают эпизоотии природного типа, когда болезнь распространяют дикие плотоядные, и городского типа, когда источниками вируса и распространителями болезни являются бродячие собаки и кошки.
Рыжие лисицы являются главным распространителем бешенства и наиболее восприимчивым видом в Европейских странах [34, 127]. Вследствие проводимой оральной вакцинации лис практически ликвидировано бешенство в Западной Европе. В последние годы в Европе некоторое эпидемиологическое значение стало приобретать бешенство насекомоядных летучих мышей. Увеличение числа зарегистрированных случаев бешенства у европейских летучих мышей отмечается с 1985 года.
В Канаде болеют, главным образом, лисицы, в США - еноты и скунсы [210]. В странах Латинской Америки основным резервуаром бешенства являются собаки и летучие мыши. Наибольшее число случаев бешенства у людей возникает вследствие покуса собаками. Особенно напряжённая в этом отношении ситуация сложилась на Африканском континенте и в некоторых азиатских странах [161].
Для бешенства характерно циклическое течение заболевания [12]. Для развития эпизоотии требуется, чтобы больное животное инфицировало как минимум двух восприимчивых животных. Однако это условие не может выполняться длительное время. Так как многие животные погибают, вследствие чего, количество восприимчивых животных уменьшается, а значит и количество контактов между ними сократщается. Таким образом, эпизоотический процесс бешенства является типичным, как и при других инфекционных заболеваниях, с одной лишь разницей - выздоровление больных особей, как правило, не наступает.
В результате периодического снижения численности восприимчивых животных из-за возникновения вспышки бешенства и восполнения численности популяции инцидентность бешенства колеблется с небольшой амплитудой в течение года и с более значительной в период от трех до пяти лет. При этом определённое влияние оказывают следующие факторы: численность лисиц, плотность их популяции, интенсивность контактов между ними, вирулентность возбудителя, инкубационный период инфекции и т.д. [37].
Экономический ущерб. Страны неблагополучные по бешенству несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели животных, затрат на отлов бродячих животных, карантинные мероприятия, уничтожение больных и подозреваемых в заражении бешенством, а так же затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирование численности диких животных и диагностические исследования.
Ситуация по бешенству в России и в мире. Бешенство - широко распространённое вирусное заболевание животных. В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира. Классическое бешенство не регистрируется в Японии, Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [78, 160]. Особенно сложная ситуация в Африке, Азии и Латинской Америке, где регистрируют городской тип бешенства. В Европе классическое бешенство регистрируют в основном в восточной части, в Западной Европе оно практически ликвидировано.
Определение уровня антител в сыворотках крови
Актуальность темы. Бешенство - широко распространённое вирусное заболевание животных, которое вызывает нейротропный вирус рода Lyssavirus в семействе Rhabdoviridae, отряд Mononegavirales. В пределах рода выделяют двенадцать генотипов [108]. Наибольший интерес вызывает вирус классического бешенства (RABV). В настоящее время бешенство регистрируется на территории более 80 стран мира. Классическое бешенство не регистрируется в Японии, Новой Зеландии, на Гавайях, а также в Австралии и Антарктике [78, 160]. Особенно сложная ситуация в Африке, Азии и Латинской Америке, где регистрируют городской тип бешенства.
Страны неблагополучные по бешенству несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели животных, затрат на отлов бродячих животных, карантинные мероприятия, уничтожение больных и подозреваемых в заражении бешенством животных, а так же затрат на проведение антирабической вакцинации, регулирование численности диких и бродячих животных и диагностические исследования.
Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. С помощью оральной вакцинации было ликвидировано классическое бешенство в большинстве стран Западной Европы. Уменьшение численности диких плотоядных имеет лишь ограниченный эффект [13, 14].
Мониторинг - важная составляющая программы оральной антирабической вакцинации. Он позволяет оценить эпизоотическую обстановку по бешенству в зоне вакцинации, а также качество проводимых мероприятий путем оценки поедаемости вакцинных приманок и уровня серопревалентности.
В Российской Федерации борьбе с бешенством в природной среде с помощью оральной вакцинации диких животных уделяется все большее внимание, как и вопросам мониторинга ее эффективности. Однако проводить исследования по оценке эффективности антирабической вакцинации с использованием классических методов в настоящее время имеют возможность лишь крупные научно-исследовательские учреждения.
Таким образом, актуальной задачей является разработка и усовершенствование существующих методов, позволяющих в ветеринарных лабораториях разного уровня качественно и быстро оценить результаты проведенной оральной антирабической вакцинации.
Степень разработанности темы. Оценке оральной антирабической вакцинации посвящены работы ряда зарубежных [28, 36, 40, 50, 55, 188] и отечественных [5, 8] авторов.
Поедаемость оральных антирабических вакцин рекомендуют оценивать с помощью биологических маркеров, которые включают в состав приманок. Обычно в качестве маркера используют антибиотики тетрациклинового ряда (тетрациклины) [143]. Данным способом оценивали большинство кампаний по оральной антирабической вакцинации, проводимых в Европе и Северной Америке. В России метод оценки поедаемости оральных вакцин до 2007 года не использовался. Учитывая тот факт, что оральная вакцинация все чаще применяется для борьбы с бешенством в России, было необходимо освоить и внедрить в лабораторную практику этот метод.
Основным методом оценки эффективности антирабической вакцинации на сегодняшний день является РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток. Этот метод имеет ряд недостатков: он дорогостоящий и требует большого количества времени на постановку. Эпизоотическую обстановку по бешенству принято определять путем проведения лабораторных исследований проб головного мозга с помощью РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Однако этот метод малопригоден при широкомасштабных исследованиях, с использованием большого количества проб, ввиду своей трудоемкости. МЭБ (Международное Эпизоотическое Бюро) предлагает в качестве возможной альтернативы для оценки эффективности вакцинации использовать ИФА (иммуноферментный анализ) для определения количества антирабических антител, а для диагностического мониторинга, в случаях, если отсутствует опасность заражения человека, использовать ИФА для выявления ВБ (вирус бешенства) [142]. В связи с этим целесообразно было разработать ИФА для определения уровней антирабических антител и для диагностики бешенства, оценить возможность использования данных методов для проведения диагностического мониторинга и мониторинга эффективности антирабической вакцинации.
Цели и задачи исследований. Основной целью работы являлась разработка методов, позволяющих оценить качество мероприятий по оральной антирабической вакцинации диких животных и провести диагностический мониторинг по бешенству в зоне вакцинации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: усовершенствовать методику по отбору и пересылке проб с целью диагностики бешенства животных и оценки качества проведения оральной антирабической вакцинации; освоить и внедрить в лабораторную практику метод определения тетрациклина в тканях костей и зубов; бешенства в головном мозге животных; - оценить поедаемость оральных антирабических вакцин с помощью метода определения тетрациклина в тканях костей и зубов в ряде регионов РФ; - провести диагностический мониторинг по бешенству с использованием разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА в ряде регионов РФ.
Научная новизна. Оценена поедаемость оральных антирабических вакцин в ряде регионов Российской Федерации и Республики Беларусь, используя метод обнаружения тетрациклина в тканях зубов и костей животных.
Оценена возможность использования прямого сэндвич-варианта ИФА с целью проведения диагностического мониторинга по бешенству. С помощью ИФА проведен мониторинг по бешенству в Калининградской, Ленинградской областях и Республике Карелия.
Результаты собственных исследований
В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор), контроли и исследуемые пробы из рассчета 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали один час при 37С и затем трижды промывали ТБСТ.
В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного антирабического пероксидазного коньюгата, инкубировали один час при 37 С и промывали пять раз ТБСТ. Рабочее разведение антирабического конъюгата с пероксидазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5% нормальной сыворотки лошади.
Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл Зн H2SO4.
Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра при длине волны 490 нм. Определяли среднюю ОП безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их расчетная ОП превышала расчетную ОП отрицательного контроля на 0,1 оптическую единицы.
Выявление вируса бешенства в твердофазном непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа. ВБ выявляли в соответствии с «Методическими указаниями по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозгу животных в твердофазном непрямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа», разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2005 году.
Подготовка проб для иммуноферментного анализа. В пенициллиновый флакон с Трис-HCl буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве необходимым для приготовления 30% суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 20С.
Обработка результатов. Подсчет уровня антител к гликопротеину в ИФА, статистическую обработку результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, а также построение графиков и диаграмм, проводили с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2010.
Основным способом борьбы с бешенством в дикой природе является оральная вакцинация. Мониторинг является важной составляющей программы оральной вакцинации и направлен на определение трех основных показателей: - поедаемость вакцинных приманок; - уровень серопреволентности; - эпизоотическая обстановка по бешенству в зоне вакцинации. Определение всех трех показателей дает полную картину о качестве проведенных мероприятий направленных на ликвидацию бешенства на вакцинируемой территории. Поэтому нами были разработанны методы позволяющие определять все три показателя, с помощью которых оценивали оральную вакцинацию на примере некоторых районов.
3.2.1 Отбор проб патологического материала
Для получения более качественных образцов проб зубной и костной ткани был усовершенствован метод отбора и пересылки проб патологического материала и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» методические указания (см. Приложение А). В усовершенствованной методике так же представлены несколько способов отбора образцов крови у отстреленных животных и описаны способы отбора проб головного мозга, в том числе более быстрый способ, позволяющий извлекать пробы головного мозга с помощью пластиковых трубок, не прибегая к распиливанию черепной коробки.
Поедаемость приманок с антирабической вакциной оценивали визуально, либо путем определения содержания антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях костей и зубов флуоресцентным методом.
Визуальная оценка поедаемости. Данным методом проводили оценку поедаемости оральной антирабической вакцины Рабивак-О/333, изготовленной из штамма ERA G333, в Краснодарском крае и Владимирской обл. С этой целью были сформированы контрольно-следовые площадки. При этом использовали песок, который разравнивали в форме круга диаметром 1 м. Если естественный грунт в районе проведения испытаний был достаточно рыхлый, удаляли с площадки опавшую листву и ветки (рисунок 9.А, 9.Б). Формировали площадки в местах наиболее вероятного появления животных, в соответствии с рекомендациями службы охоты и рыболовства (по краям полей и опушек лесов, водопоев, на путях передвижения и миграции животных). В центр площадки помещали 2-3 вакцинные приманки. Координаты площадок фиксировали с помощью приборов спутниковой навигации, а также обозначали цветными флажками.
Площадки проверяли ежедневно. Учитывали количество съеденных приманок, наличие и целостность капсул с вакциной, количество и видовую принадлежность следов, оставленных на контрольно-следовой полосе (рисунок 9.В, 9.Г). Также регистрировали погодные условия в районе проведения испытаний и состояние оставшихся вакцинных приманок, в том числе повреждения, нанесенные приманкам нецелевыми видами животных (рисунок 9.Д, 9.Е).
Разработка метода выявления антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич варианте иммуноферментного анализа
Для сравнения результатов разработанного прямого сэндвич варианта ИФА с непрямым сэндвич вариантом ИФА, разработанным ранее, исследовали приготовленные суспензии головного мозга в непрямом методе. Результаты исследований в прямом и непрямом сэндвич вариантах ИФА полностью совпали.
Использование разработанного теста для оценки эпизоотической ситуации по бешенству. Чтобы определить возможность использования разработанного нами прямого сэндвич варианта ИФА для оценки эпизоотической обстановки по бешенству, нами было проведены мониторинговые исследования. С этой целью пробы головного мозга, отобранные в ходе мониторинга в Калининградской области в 2010 году, исследовали в ИФА. Результаты сравнили с результатами, полученными при использовании РИФ (таблица 27). Таблица 27 - Сравнение результатов полученных в РИФ и ИФА при оценке эпизоотической ситуации по бешенству в Калининградской области в 2010 г. Из таблицы 27 видно, что из 146 исследованных проб головного мозга от лис и енотовидных собак вирус бешенства был обнаружен в пяти, что составило 3,4%. Результаты, полученные в прямом сэндвич варианте ИФА, полностью совпали с результатами РИФ.
Подобным образом оценивали эпизоотическую ситуацию в других регионах. Исследовали в РИФ и ИФА в конце 2011 года 15 проб и в начале 2012 года 30 проб головного мозга из Республики Карелия от различных видов животных, а также в 2012 году 13 проб головного мозга от волков, лис и куницы из Ленинградской области. Результаты представлены в таблицах 28 и 29.
Из таблицы 29 видно, что при исследовании 13 проб головного мозга от волков, лис и куницы из Ленинградской области вирус бешенства также не обнаружен. Результаты прямого сэндвич варианта ИФА полностью совпали с результатами РИФ.
На основании полученных результатов были разработаны «Методические указания по выявлению антигенов вируса бешенства в головном мозге животных в твердофазном прямом сэндвич-варианте иммуноферментного анализа» и утверждены заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение Г).
Во многих странах мира бешенство остается одной из важнейших проблем ветеринарии. Оральная вакцинация является основным способом борьбы с бешенством в дикой природе. Однако в результате различных нарушений применение антирабических вакцин может быть не всегда эффективно, поэтому мониторинг - важнейшая составляющая программы оральной вакцинации. Он позволяет оценить эпизоотическую обстановку по бешенству в зоне вакцинации, а также эффективность проводимых мероприятий.
Для проведения диагностических исследований на бешенство важным фактором является качество используемых проб патологического материала. С этой целью нами были разработаны «Методические указания по отбору и пересылке проб головного мозга сывороток крови и костной ткани с целью диагностики бешенства животных и оценки эффективности оральных антирабических вакцин». В них подробно описаны способы отбора патологического материала для проведения диагностических исследований и требования предъявляемые к его транспортировке и хранению.
Одной из составляющих маниторинга является оценка поедаемости оральных вакцин. Учет поедаемости вакцинных приманок при ручном способе их распространения возможно проводить визуально [148]. Данным методом проводили оценку поедаемости оральной антирабической вакцины Рабивак-0/333, изготовленной из штамма ERA G333 вируса бешенства, в Краснодарском крае и Владимирской обл. Испытания вакцины проводили осенью. В большинстве районов Европы успех борьбы с бешенством лис достигался проведением кампании по оральной вакцинации весной (март-май) и осенью (сентябрь-октябрь) [211].
В условиях Краснодарского края 93,9% приманок были съедены в течение четырех суток. В первые сутки наблюдения целевыми видами животных (лисицы, енотовидные собаки) были съедены 27,2% всех приманок с вакциной. Во Владимирской области в первые сутки было съедено 61,5% вакцины, на третьи сутки - поедаемость составила 84,6%. Большинство исследований показали, что более 50% приманок потребляется за первую неделю и более 80% на 1-3 неделе [81, 111, 148, 220]. В наших исследованиях на первой неделе потреблялось более 80% приманок, что свидетельствует о высокой привлекательности приманок Рабивак-О/333 для целевых видов животных.
При проведении испытаний в местах раскладки приманок были обнаружены блистеры с нарушенной целостностью и следами зубов лисиц и енотовидных собак (вакцинная суспензия в них отсутствовала), что свидетельствует о попадании вакцины в организм целевых видов животных. Однако остается вероятность поедания животным приманки без потребления вакцинной суспензии, о чем свидетельствуют сообщения из некоторых регионов России.
В ряде случаев, на приманках обнаруживали следы зубов мелких мышевидных млекопитающих, которые локализовались по краям. Некоторые вакцинные штаммы опасны для грызунов [2], но как показали исследования, обнаруженные повреждения не достигали капсулы с вакциной. Тем не менее,
100 безопасность вакцинного вируса должна быть проверена на целевых и нецелевых видах, которые могут присутствовать в районе вакцинации [89, 178]. В отношении штамма ERA G333 установлена его апатогенность для взрослых лабораторных мышей при внутримозговом введении [2].
Метод визуального контроля позволяет оценить качество и время поедания приманок, а также определить оптимальные места распределения приманок и погодные условия для их распространения. Однако он довольно трудоемок, что ограничивает применение при проведении широкомасштабных кампаний по оральной вакцинации диких животных.
Чаще для учета поедаемости вакцинных приманок используют биомаркеры, которые включают в состав приманок. Обычно в качестве биомаркера используют антибиотики тетрациклинового ряда [143]. Данный метод использовали для оценки оральных вакцинаций проводимых в ряде регионов нашей страны и за рубежом.
На основании полученных результатов были разработаны «Методические указания по обнаружению флуоресцентным методом антибиотиков тетрациклинового ряда в тканях зубов и костей животных для контроля поедаемости оральных антирабических вакцин» рекомендованые к применению для оценки поедаемости оральных антирабических и других вакцин, содержащих в своем составе в качестве маркера тетрациклины.
В результате проводимого мониторинга в Калининградской области была изучена поедаемость антирабической вакцины в период с 2007 до 2010 года. Перед проведением оральной вакцинации обычно устанавливают фоновую долю тетрациклин-позитивных животных [28, 36, 79, 168, 170] в популяции целевых видов. В нашем случае поедаемость составила 3,9%. Фоновый уровень тетрациклинов, обнаруживаемый у животных в дикой природе, которые они получают, как правило, из сельскохозяйственных источников, составляет менее 5% [36].
