Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) особое место занимает гомопентамерный а7 нАХР. Данный подтип, вероятно, является наиболее широко распространенным нАХР в организме, где он встречается как в нервной системе, так и за ее пределами. Он также уникален своей аминокислотной последовательностью, фармакологическим профилем и наиболее высокой проницаемостью для ионов кальция. Изменение уровня а7 нАХР в головном мозге наблюдается при шизофрении, а также связано с нарушением холинергической передачи и ухудшением когнитивных способностей при таких нейродегенеративных заболеваниях как болезни Альцгеймера и Паркинсона. В последнее время появились работы, указывающие на возможность изменения уровня нАХР на форменных элементах крови при различных патологических состояниях. Таким образом, как для диагностики, так и для исследования механизмов возникновения и протекания заболеваний очевидна необходимость разработки надежных методов для обнаружения и количественного определения уровня а7 нАХР.
При постановке подобных задач классическим подходом является использование антител, однако недавние исследования показали, что многие широко используемые антитела против а7-субъединицы нАХР неспецифически окрашивают ткани нокаутных по данному гену мышей (а7-/-). Для повышения надёжности результатов в сочетании с антителами применяют а-нейротоксины из ядов змей, являющиеся высокоаффинными специфическими лигандами некоторых подтипов нАХР. В то же время токсины редко имеют сродство только к одному подтипу рецепторов, что часто затрудняет интерпретацию результатов, особенно, учитывая обнаружение в последние годы нАХР в нетипичных для них тканях, а также большее разнообразие их подтипов, чем ранее предполагалось. В связи с этим актуальной является разработка метода избирательной детекции а7 нАХР. Цель работы. Цель настоящего исследования состояла в разработке методов
специфической детекции нейрональных а7 нАХР с использованием антител и
токсинов. Задачами представленной работы стали получение и тестирование набора поликлональных антител против синтетических фрагментов а7-субъединицы нАХР и различных производных длинных а-нейротоксинов из ядов змей, в том числе их коммерчески доступных конъюгатов. Применимость этих инструментов для поставленной цели исследовалась в ряде методов анализа с использованием как рекомбинантных, так и природных а7 нАХР. Главной задачей стала разработка метода избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанного на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов с последующей его апробацией для исследования экспрессии и транспорта а7 нАХР нейронами спинномозговых ганглиев крыс.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе получен набор поликлональных антител против синтетических фрагментов а7 -субъединицы нАХР и впервые проведено комплексное тестирование их специфичности с использованием рекомбинантных экстрацеллюлярного домена а7-субъединицы нАХР и полноразмерного а7 нАХР, природных источников рецепторов, а также тканей мышей, нокаутных по гену а7-субъединицы нАХР. Оптимизирована методика получения мембранных препаратов тканей животных и их стандартизации для последующей количественной оценки содержания а7 нАХР методом радиолигандного анализа. Впервые установлено, что биотинилированный а-кобратоксин может быть использован для детекции а7 нАХР в мембранных препаратах нервной ткани. Разработан метод избирательной гистохимической детекции а7 нАХР, основанный на применении флуоресцентно-меченого а-нейротоксина длинного типа в качестве маркера и комбинации длинных и коротких а-нейротоксинов в качестве специфических ингибиторов. С использованием предложенного метода и дополнительных маркеров впервые были охарактеризованы нейроны спинномозговых ганглиев, экспрессирующие и транспортирующие а7 нАХР. Обнаружено, что по меньшей мере четверть из них являются ноцицептивными
нейронами. В практическом плане разработанные методы детекции важны для изучения роли а7 нАХР в различных патологических состояниях.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), на Восточно-европейском симпозиуме «Центральная и периферическая синаптическая передача» (Варна, Болгария, 2006), конференции «Ионные каналы: структура и функции» (С.-Петербург, 2009), IV российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на 4-й конференции Европейского нейрохимического общества (Лейпциг, Германия, 2009), на конференции Нейробиологического общества по нАХР (Чикаго, США, 2009), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009), на международном конгрессе «Молекулярные механизмы неврологических и психических расстройств» (Мартин, Словакия, 2009), на 4-й конференции Международного нейрохимического общества (Эриче, Италия, 2010), на немецко-российском симпозиуме «Молекулярная нейробиология сегодня и завтра» (Берлин, Германия, 2010). По теме диссертации опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 48 рисунков и 6 таблиц, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 323 наименования.
