Введение к работе
Актуальность проблемы. Приобретение способности вируса гриппа птиц (ВГП) вызывать заболевание человека, заканчивающееся в ряде случаев летальным исходом, привлекло внимание вирусологов и эпидемиологов к всестороннему изучению возбудителя инфекции, путей его распространения, разработки эффективных мер диагностики, профилактики и лечения данного заболевания (Бектемиров Т.А., 2005; Липатов с соавт., 2005; Гендон Ю.З., 2006; Львов Д.К., 2006; Онищенко Г.Г., 2006; Peizis J.S. et а!., 2007 и др.). В 2009 г. в 15 странах выявлено свыше 400 случаев тяжелых заболеваний человека с высокой летальностью, вызванных гриппом птиц H5N1, однако в нашей стране заболевание людей этой инфекцией не зарегистрировано (Крылов П.С. с соавт., 2009). По данным ВОЗ, на 21 апреля 2011 г. всего в мире зарегистрировано 552 лабораторно подтвержденных случаев заболевания людей гриппом птиц H5N), из которых 322 закончились летально. С 2005 г. на территории России в различных регионах на путях миграции перелетных птиц отмечались быстро распространяющиеся эпизоотии среди дикой и домашней птицы, вызванные высокопатогенным ВГП се-ротипа H5N1, что потребовало принятия эффективных противоэпидемических мер по защите от данного заболевания не только домашней птицы, но и людей (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).
В первую очередь, это относилось к разработке эффективных способов индикации данного вируса в объектах биотической и абиотической природы. Если во внутренних органах больной или погибшей от вируса гриппа птицы концентрация патогена позволяла не только изолировать отдельные препараты вируса, но и осуществлять его индикацию с использованием иммунохимических и геннодиагностических методов, то выявлять ВГП в объектах окружающей среды, включая воду открытых водоемов, являющуюся фактором передачи инфекции, до настоящего времени не представлялось возможным из-за его низкой концентрации в данных объектах. В связи с этим, разработка новых высокочувствительных и специфичных методов индикации возбудителя, сочетающих возможность осуществлять динамическое, селективное концентрирование ВГП из сильно загрязненных проб воды неограниченного объема, является весьма актуальной задачей, решение которой позволит совершенствовать вирусологический и эпидемиологический мониторинг за данной инфекцией.
Цель исследования - повышение эффективности методов индикации ВГП путем совершенствования суспензионного диагностикума и разработки маг-ноиммуносорбентов (МИС) для концентрирования патогена и последующего использования в иммунохимических и геннодиагностических реакциях.
Основные задачи исследования:
-
Усовершенствовать индикацию ВГП путем применения разработанного суспензионного диагностикума на основе латексной матрицы;
-
Создать МИС для избирательного концентрирования ВГП;
-
Разработать технические устройства, обеспечивающие концентрирование на МИС ВГП, присутствующего в водных объектах в низких концентрациях;
-
Обосновать перспективы получения и использования МИС для выявления ВГП птиц в количественном иммунофлуоресцентном анализе (КИФА);
-
Экспериментально обосновать возможность повышения выявляемое
ВГП в иммуноферментном анализе (ИФА) после предварительного селективного концентрирования патогена из исследуемого материала на МИС;
6. Изучить возможность выявления ВГП, сконцентрированного на МИС, в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Научная новизна. Для специфической индикации ВГП научно обоснованы и разработаны новые диагностические препараты. Диагностикум латексный предназначен для осуществления скрининговых исследований объектов окружающей среды при концентрации патогена 50 нг/мл и выше.
Для концентрирования ВГП, присутствующего в воде в очень низких концентрациях, не позволяющих его обнаружить известными методами (реакция иммунофлуоресценции (РИФ), ИФА, ОТ-ПЦР, созданы МИС на основе алюмосиликата, магнитного порошка и полиглюкина, активированные перхлоратом натрия, применяемые при индикации ВГП с использованием иммунохимических (КИФА), (ИФА) и геннодиагностических (ОТ-ПЦР) методов. Указанные индикационные методы позволяют специфически выявлять 0,25 пг/мл и выше ВГП, присутствующего в воде, объем которой может достигать сотен литров.
Для обеспечения динамического, селективного концентрирования ВГП на МИС из воды открытых водоемов впервые разработана установка «Аквадиамаг».
Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на полезную модель № 64784 от 10.07.2007 г. «Установка для микробиологического мониторинга объектов водной среды», патентом РФ № 2339694 от 27.11.2008 г. «Диагностическая тест-система для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1» и патентом РФ № 2395094 от 20.07.2009 г. «Способ получения раствора, используемого в качестве разводящей жидкости и среды высушивания эрит-роцитарных и латексных диагностикумов».
Теоретическая и практическая значимость работы. Основная теоретическая значимость работы заключается в определении научных аспектов и подходов к созданию индикационных систем для выявления ВГП, присутствующего в водных объектах окружающей среды в низких концентрациях, не позволяющих его обнаруживать традиционными индикационными методами.
Для осуществления скрининговых исследований, направленных на выявление ВГП создан специфический латексный диагностикум. При индикации вируса в методах КИФА, ИФА и ОТ-ПЦР использованы МИС, позволяющие избирательно концентрировать патоген из объектов окружающей среды с низкой концентрацией вируса.
Полученные результаты исследований подтверждены межлабораторными испытаниями в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспо-требнадзора (СтавНИПЧИ) «макетов приборов «Аквадиамаг-1» и «Аквадиамаг-2», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц им-муноферментным анализом (ИФА) и количественным иммунофлуоресцентным анализом (КИФА)», акт испытаний утвержден директором СтавНИПЧИ 12.05.2006 г.; а также «Тест-системы диагностической магноиммуносорбентной для выявления вируса гриппа птиц иммуноферментным методом», акт испытаний утвержден директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 03.07.2006 г.
По материалам проведенных исследований составлены Методические рекомендации «Применение магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа птиц A/H5N1 с последующей постановкой имму-ноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией», утвержденные директором СтавНИПЧИ и директором ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в ноябре 2008 г.
Результаты диссертационных исследований, представленные на конкурсе «Лучшая научно-исследовательская разработка» (Ставрополь-2007 г.) по теме «Технические устройства и диагностические тест-системы, обеспечивающие тысячекратное повышение эффективности обнаружения вируса гриппа птиц», заняли первое место и награждены дипломом.
На «Тест-систему иммуноферментную для выявления вируса гриппа птиц A/H5N1 (МИС - ИФА - Грипп птиц - СтавНИПЧИ)» оформлены: пусковой регламент № 01897080-13-09 на производство, технические условия -ТУ 9388-020-01897080-2009, инструкция по применению, утвержденные директором СтавНИПЧИ на основании решения ученого совета института от 21 мая 2010 г., протокол № 5.
Материалы диссертации используются на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям, в лекциях и практических занятиях по индикации и применению МИС в мониторинге за ВГП в СтавНИПЧИ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Для эффективной индикации ВГП в реакции агглютинации латекса (РАЛ) теоретически и экспериментально обоснована конъюгация латексов с иммуноглобулинами против патогена, позволяющая получать активные, специфичные иммунобиологические препараты.
-
При исследовании сильно загрязненных проб неограниченного объема применение разработанных МИС и сконструированных технических средств для работы с ними упрощает, ускоряет процесс избирательного концентрирования ВГП, повышая выявляемость патогена.
-
Разработанные методы селективного концентрирования ВГП на МИС с последующей индикацией в иммунохимических (КИФА, ИФА) и геннодиагности-ческих (ОТ-ПЦР) реакциях позволяют увеличить чувствительность анализов и использовать их при вирусологическом мониторинге объектов окружающей среды.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского Саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3-5 октября 2006 г.); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-27 апреля 2007 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 9 - 10 октября 2008 г.); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск,
21-22 апреля 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 14-15 мая 2009 г.); X межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 5-6 октября 2010 г.).
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках проекта «Технические устройства и диагностические системы, обеспечивающие тысячекратное повышение эффективности обнаружения возбудителя гриппа птиц в окружающей среде» (2007 г.), научно-исследовательских работ (НИР) по темам «Создание твердофазных магнитоуправляемых тест-систем, обеспечивающих эффективный мониторинг за возбудителями опасных бактериальных и вирусных заболеваний» при поддержке со стороны гранта Президента РФ ведущих научных школ НШ-2486.2008.7. и «Совершенствование экспрессных методов лабораторной диагностики гриппа птиц и детекции его возбудителя в объектах внешней среды» (2008-2010 гг., № Государственной регистрации 01.2008.021.34), отражено в 16 опубликованных научных работах, в том числе три из них - в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ, а также в 3 Патентах РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками, 12 таблицами. Список использованной литературы содержит 208 источников, в том числе 76 зарубежных авторов.
