Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
І.І.Молекулярногбиологическая и эпидемиологическая характеристика респираторных вирусов 12
l.l.l.PHK-содержащие вирусы 12
1.1.1.1. Семейство Orthomyxoviridae 12
1.1.1.2. Семейство Paramyxoviridae 18
1.1.1.3. Семейство Picornaviridae 22
1.1.1.4. Семейство Coronaviridae 25
1.1.2. ДНК-содержащие вирусы 27
1.1.2.1. Семейство Adenoviridae 27
1.1.2.2. Семейство Herpesviridae 30
1.1.2.3. Бокавирус человека 30
1.2. Методы этиологической диагностики респираторных заболеваний 32
1.2.1. Выделение вируса в культуре чувствительных клеток 33
1.2.2. Иммунологические методы выявления респираторных вирусов 35
1.2.2.1. Реакции с использованием химических меток 36
1.2.2.2. Реакции, основанные на феномене агглютинации эритроцитов 39
1.2.2.3. Методы серологической диагностики 40
1.2.3. Методы амплификации нуклеиновых кислот 41
1.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 42
1.2.3.2. Мультиплексная ПЦР 44
1.2.3.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 45
1.2.3.4. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени 47
1.2.3.5. Другие методы амплификации нуклеиновых кислот 47
1.2.3.6. Тип образца и методы пробоподготовки 50
1.2.3.7. Выявление ингибиторов амплификации и контроль контаминации 51
1.2.3.8. Клиническое применение методов амплификации нуклеиновых кислот 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Лабораторные штаммы вирусов 57
2.1.2. Клеточные линии 57
2.1.3. Клинические образцы 59
2.1.4. Реактивы 60
2.2. Методы 60
2.2.1. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 60
2.2.2. Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР 60
2.2.3. Выделение вирусных нуклеиновых кислот 61
2.2.4. Реакция обратной транскрипции 61
2.2.5. Полимеразная цепная реакция (моноспецифический формат) 61
2.2.6. Полимеразная цепная реакция (мультиплексный формат) 62
2.2.7. Электрофорез ДНК в агарозном геле 62
2.2.8. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в
режиме реального времени (TaqMan) 62
2.2.9. Получение калибратора для количественного учета вирусной РНК в
биологических образцах 63
2.2.10.Статистическая обработка результатов исследований 63
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 65
3.1. Подбор праймеров и оптимизация условий выявления ДНК аденовирусов человека в биологических образцах методом ПЦР 65
3.2. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий для дифференциального выявления риновирусов и энтеровирусов в биологических образцах методом ПЦР 70
3.3. Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле 78
3.4. Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления 10 групп респираторных вирусов в биологических образцах 83
3.4.1. Подбор праймеров и зондов, оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ 83
3.4.2. Сравнительный анализ эффективности и чувствительности мультиплексной и моноспецифической ПЦР-РВ 92
3.4.3. Испытание тест-системы на клинических образцах, полученных от больных с симптомами ОРВИ 94
3.5. Количественное определение нуклеиновых кислот респираторных вирусов 102
Заключение 105
Выводы
- Семейство Paramyxoviridae
- Выделение вируса в культуре чувствительных клеток
- Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР
- Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) по распространенности и контагиозности занимают ведущее место среди инфекционных болезней человека. В России на грипп и гриппоподобные острые респираторные заболевания приходится более 90% инфекционной заболеваемости [20]. Основной вклад в структуру ОРВИ вносят вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, риновирусы и некоторые энтеровирусы [85, 87]. Вирус гриппа опасен осложнениями, которые часто возникают после заражения, и является причиной высокой смертности у пациентов с ослабленным иммунитетом [105, 128]. Первичная респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, возникающая обычно у детей первого года жизни, нередко становится причиной смерти новорожденных [4, 213]. Серьезные респираторные заболевания у человека часто вызывают также вирусы парагриппа 1, 2 и 3 типов, аденовирусы, коронавирусы и другие [45, 63, ПО]. На сегодняшний день нет сомнений в том, что некоторые респираторные вирусы (респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и аденовирусы) играют важную роль в развитии аллергических заболеваний дыхательных путей, в том числе бронхиальной астмы [51, 112]. Помимо вирусов, многие виды бактерий, хламидий и микоплазм способны поражать дыхательные пути, вызывая сходные с ОРВИ симптомы [69, 120, 243].
С точностью идентифицировать респираторные инфекции можно только при помощи лабораторных методов диагностики. Затруднения при дифференциальной лабораторной диагностике этих инфекций вынуждают вести статистический учет по сумме всех случаев, включая их в комплекс ОРВИ. В ранние сроки болезни для диагностики используют различные методы: выделение вируса заражением культур клеток, иммунофлуоресцентное выявление антигенов вируса в цитоплазме эпителиальных клеток носовой полости, определение нарастания титра антител в парных сыворотках [96, 128]. В настоящее время для выявления и идентификации респираторных вирусов широко используют молекулярные методы, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов [59, 118,128,246].
Несмотря на имеющиеся разнообразие методов диагностики вирусных инфекций, остается актуальной проблема быстрой и высокочувствительной диагностики. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, считающиеся «золотым стандартом» диагностики, в то же время обладает рядом недостатков, включающими высокую трудоемкость и продолжительность теста. Вирусы размножаются не на всех культурах клеток, поэтому обычно, клинические образцы инокулируют сразу в несколько типов клеток, для того чтобы обеспечить условия для выделения вирусов, с разной тканевой специфичностью, что значительно увеличивает трудоемкость исследования [147, 236]. Кроме того, ряд респираторных вирусов (например, риновирусы, вирус парагриппа 4 типа, метапневмовирус) с трудом выделяются в культуре клеток. Широкое распространение имеют иммунохимические экспресс-методы выявления вирусных агентов в клинических образцах. Основными их преимуществами являются доступность и простота постановки. Однако, в ряде случаев, они бывают недостаточно информативны и неприменимы в отношении таких респираторных вирусов, как риновирусы и аденовирусы из-за их высокого антигенного разнообразия. Приведенные выше данные обусловливают необходимость совершенствования существующих тест-систем для выявления респираторных вирусов.
Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как различные модификации метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе ПЦР с гибридизационной идентификацией продуктов амплификации, мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Достоинствами метода ПЦР являются высокая специфичность, чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, возможность выявления сразу нескольких патогенов в одной пробирке, при условии наличия в реакционной смеси нескольких пар соответствующих праймеров (мультиплексная ПЦР).
Внедрение метода ПЦР-РВ в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в клинической лабораторной диагностике. Применение ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот. Подобный подход позволяет
отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Некоторые современные приборы для ПЦР-РВ позволяют в одной пробирке проводить и детектировать в режиме реального времени до 6-ти независимых реакций, с использованием зондов, меченных различными флуоресцентными красителями (мультиплексная ПЦР-РВ). Несмотря на очевидные преимущества этого подхода на российском рынке отсутствуют тест-системы на основе мультиплексной ПЦР-РВ для диагностики респираторных вирусных инфекций. Таким образом, разработка мультиплексной ПЦР тест-системы для одновременного выявления в клинических образцах основных возбудителей ОРВИ является весьма актуальной задачей.
Внедрение быстрых тестов на основе мультиплексной ПЦР-РВ
для диагностики инфекций дыхательных путей может улучшить качество оказания
медицинской помощи и снизить частоту неоправданного назначения
антибактериальных препаратов, а также обеспечит эпидемиологические службы
удобным и универсальным инструментом для быстрой и высокоспецифичной
расшифровки вспышек ОРВИ. ':
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлась разработка мультиплексной ПЦР-тест-системы с детекцией в режиме реального времени, позволяющей одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы.
Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
в культуре клеток получить образцы лабораторных штаммов вирусов гриппа А и В, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов, риновирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов и энтеровирусов для использования их на следующих этапах работы в качестве биологических стандартов;
к консервативным геномным последовательностям десяти групп респираторных вирусов подобрать праймеры и зонды (TaqMan) и показать их специфичность в моноспецифической ПЦР в реальном времени;
оптимизировать условия проведения мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР и провести сравнительную оценку эффективности и чувствительности моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ для выявления различных респираторных вирусов;
проанализировать клинические образцы от больных с симтомами ОРВИ с помощью разрабатываемой ПЦР-тест-системы и зарубежного аналога, который применяется в Медицинском центре Лейденского университета (Нидерланды), и провести сравнительный анализ результатов, полученных двумя тест-системами;
отработать методы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов в биологических образцах.
Научная новизна. '
Впервые в России разработана тест-система, позволяющая методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени выявлять в клинических образцах основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека, в частности, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы и энтеровирусы в присутствии внутреннего положительного контроля. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, используемые в тест-системе, были разработаны в процессе выполнения данной работы, то есть являются оригинальными.
Практическая значимость.
1. Мультиплексная тест-система с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени для одновременного выявления основных респираторных вирусов в клинических образцах может применяться в эпидемиологических службах для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и для мониторинга
эпидемиологической обстановки. В перспективе, с развитием методов специфического лечения респираторных вирусных заболеваний, подобные тест-системы найдут применение в клинической практике для постановки диагноза и назначения адекватного лечения. 2. Разработанные методические приемы для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов могут быть использованы в научных исследованиях, в частности, для контроля уровня вирусной репродукции, наряду с традиционными методами титрования вирусов, при испытании противовирусных препаратов in vitro и in vivo.
Основные положения, выносимые на защиту.
В ходе выполнения работ, были подобраны нуклеотидные последовательности праймеров и зондов TaqMan для выявления в биологических образцах вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиальный вируса, риновирусов и энтеровирусов и показана их специфичность на лабораторных штаммах респираторных вирусов.
Разработана мультиплексная ПЦР-тест-система для одновременного выявления 10 групп респираторных вирусов в клинических образцах.
Анализ клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ показал, что разработанная тест-система не уступает по специфичности зарубежному аналогу.
Разработан алгоритм для количественного учета нуклеиновых кислот респираторных вирусов, который был успешно применен в ряде научных исследований.
Семейство Paramyxoviridae
Молекулярные основы репродукции РСВ [50, 104] и вирусов парагриппа [45, ПО, 238] хорошо изучены. Геном РСВ кодирует 10 субгеномных матричных РНК. Эти мРНК транслируются в 11 белков: 4 белка нуклеокапсида - белок: N нуклеокапсида, фосфопротеин Р, большая субъединица полимеразы L и фактор транскрипционной элонгации М2-1; 3 трансмебранных поверхностных гликопротеина - белок слияния F, белок присоединения G и малый гидрофобный белок SH; 2 неструктурных белка - SH1 и SH2; матриксный белок М; и фактор регуляции РНК М2-2. Гликопротеины G и F являются главными протективными антигенами и индуцируют выработку вируснейтрализующих антител. Последовательность генов в геноме РСВ выглядит как: 3 -NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5 .
Генетические карты вирусов парагриппа имеют сходство с РСВ. Однако, у вирусов парагриппа человека отсутствуют гены NS1, NS2, SH (есть у ВПГ2 и ВПГ4), М2, а Р-ген кодирует несколько дополнительных белков. Например, последовательность генома ВПГЗ выглядит следующим образом: З -N-P/C/D/V-M-F HN-L-5 [238]. Два протективных антигена вирусов парагриппа - это белок присоединения HN и белок слияния F [158].
В 2001 году van den Hoogen B.G. с соавторами, доложил о выделении нового парамиксовируса, названного метапневмовирусом, из носоглоточных смывов детей [232]. В геноме метапневмовируса отсутствуют гены NS1 и NS2, кроме того, последовательность расположения генов отличается от других пневмовирусов (например, РСВ) и выглядит следующим образом: 3 -N-P-M-F-M2-SH-G-L-5 [124, 205].
Парамиксовирусы характеризуются наличием белка F, который вызывает слияние мембран зараженных клеток с окружающими незараженными клетками. В результате этого процесса происходит образование синцитиев - больших многоядерных клеток и распространение инфекции. Такой способ передачи от клетки к клетке позволяет вирусу размножаться, не контактируя с антителами в назальных секретах [63, 104].
Парамиксовирусы, как и другие группы вирусов с одноцепочечным РНК геномом негативной полярности (например, Rhabdoviridae), имеют схожую стратегию репликации генома [138]. В клетку геном этой группы вирусов входит вместе с ферментом РНК-зависимой РНК-полимеразой, который копирует вирусный геном, образуя комплементарные молекулы РНК, т.е. (+)РНК, эти комплементарные молекулы РНК выполняют роль мРНК и служат матрицей для синтеза новых молекул (-)РНК. Репликация происходит в цитоплазме зараженных клеток [11].
Эпидемиология парамиксовирусов. Проблема профилактики и лечения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.
Парамиксовирусы распространяются непосредственно от человека к человеку воздушно-капельным путем. Инфекции, вызываемые парамиксовирусами, широко распространены по всему земному шару и чаще всего проявляются зимой и весной. В США ежегодно госпитализируют около 600 000 детей до 18 лет с признаками ОРВИ, при этом приблизительно в 12% случаев причиной являются ВПГ 1, 2 и 3 типов [110]. ВПГ4 выявляют редко. Обычно ВПГ4 ассоциируется с респираторными заболеваниями средней тяжести, иногда, с заболеваниями нижнего респираторного тракта [45].
Данные многочисленных исследований свидетельствуют о том, что метапневмовирус человека вызывает заболевания верхних и нижних дыхательных путей. Количество случаев заболевания зависит от географического расположения региона, времени года и возраста пациентов и составляет от 5 до 15% у детей [41, 42, 54, 84] и 3,4% у взрослых [76, 78].
Среди парамиксовирусов большое клиническое значение имеет РСВ. Как показали исследования ученых различных стран, респираторно-синцитиальная вирусная инфекция возникает обычно у детей первого года жизни [4, 213, 244]. Ежегодно в мире в результате заболеваний нижних дыхательных путей, связанных с РСВ, умирают несколько миллионов детей младше 5 лет [63]. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что перенесенная в детстве респираторно-синцитиальная вирусная инфекция становится фактором развития бронхиальной астмы в будущем [51, 112, 133] и часто является причиной обострения бронхиальной астмы у взрослых [77, 220, 235].
В 1980-х и до середины 1990-х годов активно в качестве средства специфического лечения РСВ использовался рибавирин «Virazole» (ICN, США). Но более поздние исследования поставили под сомнения эффективность этого препарата, хотя рибавирин по-прежнему продолжает применяться у пациентов с ослабленным иммунитетом [108].
Накапливается опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих поликлональных антител против РСВ, полученных из плазмы здоровых доноров - RSV-IGIV «RespiGam» (Medlmmune Inc, Gaithersburg, США) и моноклональных гуманизированных иммуноглобулинов IgG-І, направленных к эпитопам поверхностного гликопротеина F - «Palivizumab» (Medlmmune Inc, Gaithersburg, США). Клинические испытания данных препаратов в настоящее время продолжаются, но очевидно, что их применение будет ограничено из-за очень высокой стоимости [45, 109].
Эффективной вакцины против РСВ в настоящее время не существует. Первые попытки создать вакцину от РСВ в 1960-е годы оказались провальными. Вакцина сенсибилизировала детей к РСВ. У 80% вакцинированных детей кроме развития РСВ-инфекции, развились тяжелые осложнения, такие как пневмония и бронхиолит, потребовавшие госпитализации. В дальнейшем 2 ребенка из вакцинированной группы погибли [63]. Классификация.
Семейство Picornaviridae включает безоболочечные вирусы с одноцепочечным РНК-геномом позитивной полярности. Среди представителей этого семейства много возбудителей респираторных заболеваний человека (риновирусы, энтеровирусы, парэховирусы). Название семейства связано с малым размером вирусов (pico -единица системы мер 10"12) и типом нуклеиновой кислоты вирусного генома пикорнавирусов (RNA - РНК). Современная классификация риновирусов, энтеровирусов и парэховирусов представлена в таблице 2.
Выделение вируса в культуре чувствительных клеток
Методами клинической диагностики врач не может с точностью определить возбудителя респираторного заболевания, поэтому лечение, как правило, является эмпирическим. Известно, что инфекционные заболевания верхних дыхательных путей в большинстве случаев имеют вирусную природу, тогда как этиологическими агентами заболеваний нижнего респираторного тракта могут быть и вирусы, и бактерии [221]. С точностью идентифицировать возбудителя респираторного заболевания можно только при помощи лабораторных методов диагностики.
В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных подхода [16]: 1) непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновой кислоты (НК); 2) выделение вируса из клинического материала в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo и его идентификация; 3) серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста антивирусных антител в течение болезни.
Методы диагностики подразделяют также на прямые и непрямые. Прямые методы диагностики вирусных инфекций позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную НК непосредственно в клиническом материале, и являются самыми быстрыми (2-24 ч). К прямым методам диагностики вирусных инфекций относятся: иммунофлуоресцентные (ИФ) и неиммунофлуоресцентные (неИФ)-тесты, а также различные модификации методов амплификации НК. Непрямые методы диагностики вирусных инфекций включают выделение вируса в культуре чувствительных клеток и методы серологической диагностики.
Некоторые авторы разделяют все методы диагностики вирусных инфекций на молекулярные, в которых объектом исследования является НК вирусов и немолекулярные, которые исследуют вирусные антигены и антитела [96, 128, 239].
Культура клеток была первым методом, который использовали для диагностики респираторных вирусных инфекций. До сих пор выделение вируса в культуре клеток остается «золотым стандартом» диагностики. Культуры клеток: первичные, диплоидные и гетероплоидные используются для детекции респираторных вирусов [147]. Главным преимуществом метода выделения вируса в культуре клеток является высокая чувствительность выявления широкого ряда респираторных вирусов [79]: вирусов гриппа А и В, РСВ, вирусов парагриппа 1-3 типов, аденовирусов, энтеровирусов. Однако, некоторые коронавирусы (например, ОС-43) и риновирусы человека плохо размножаются в культуре клеток [158].
Для успешного выделения вируса в культуре клеток необходимо соблюдение ряда условий. Они включают правильную технику отбора, подготовку клинического образца, транспортировку образца в вирусологическую лабораторию при оптимальных условиях. Респираторные образцы, как правило, контаминированы симбиотической микрофлорой дыхательных путей. Поэтому тупферы из дакрона или полиэстера с клиническим образцом следует поместить в вирусную транспортную среду, содержащую антибиотики. Образцы следует хранить при температуре +2-8С до инокуляции, чтобы сохранить инфекционную активность вируса, особенно таких лабильных вирусов как РСВ [81]. Культуральные пробирки обычно инкубируют при 35-37С в течение 7-14 дней в стационарных или вращающихся штативах. Монослой клеток необходимо ежедневно исследовать под микроскопом в поисках дегенеративных морфологических изменений, называемых цитопатическим действием (ЦПД). Вирусы размножаются не на всех культурах клеток, поэтому обычно, клинические образцы инокулируют сразу в несколько типов клеток, для того чтобы обеспечить условия для выделения определенных вирусов. Размножение вирусов к культуре клеток свидетельствует о присутствии в образце инфекционных вирионов. Без применения культуральных методов невозможно установить инфекционнность вируса в образце [96, 128].
Для типирования вирусов применяется реакция биологической нейтрализации (РН), основанная на способности специфических антител прочно соединяться с вирионом. В результате взаимодействия между вирусом и антителами происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вириона с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной к нему биологической системе in vitro или in vivo [19].
Недостатком метода выделения вируса в культуре чувствительных клеток является длительность процедуры (до 14 суток), прямо зависящая от сроков проявления ЦПД [25, 250].
Для сокращения сроков проявления ЦПД применятся формат быстрой культуры чувствительных клеток и комбинация культуры клеток с иммунохимическими методами диагностики. Первое упоминание о применении техники центрифугирования клеток на низких скоростях, в которые был инокулирован цитомегаловирус, относится к 1984 году [97]. Этот прием используют, для того чтобы сократить время, необходимое для выявления вирусов, которые медленно культивируются в традиционной культуре клеток. Сокращение времени, необходимое для проявления цитопатического эффекта, достигается для многих вирусов центрифугированием клеток, после того как к ним был добавлен клинический образец. Центрифугирование обеспечивает более тесный контакт между клетками и вирусом, который присутствует в клиническом образце, улучшая адсорбцию вируса и, тем самым, увеличивая выход вируса. Детекция вирусных белков обычно осуществляется с использованием иммунохимических тестов [96].
В США компанией Diagnostic Hybrids Inc. был разработан коммерческий набор R-Mix (Mixed FreshCells), в основе которого лежит формат быстрой культуры клеток. Производители используют культуру клеток легких норки (MvlLu) и клетки А549, которые поддерживают рост самых распространенных респираторных вирусов. В несколько стеклянных флаконов или 48-96-луночную планшету с подготовленным монослоем клеток инокулируют клинический образец, центрифугируют и инкубируют при 37С в 5% С02. Через 24 и 48 часов монослой обрабатывают пулом вирусспецифических флуоресцентномеченных моноклональных антител (ФМА) к белкам аденовирусов, РСВ, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3 типов. Если флуоресценция детектируется, то используется вторая планшета (или стеклянные флаконы) с клетками, которые обрабатываются отдельными ФМА к разным вирусам.
Методика получения мазков из полости носа для диагностики ОРВИ методом ПЦР
Суммарную нуклеиновую кислоту (НК) выделяли при помощи коммерческого набора «QIAmp Viral RNA Mini Kit» («Qiagen», Германия) или фирмы «Изоген» (Россия), руководствуясь инструкцией фирмы-производителя. В основе коммерческих наборов лежит модификация метода выделения НК,. предложенная Boom R. с соавторами [44] При постановке реакции ОТ. 25 пмоль праймера для ОТ смешивали с 10 мкл РНК и прогревали в течение 5 минут при 65С. Далее, Bf 30 мкл реакционной смеси,, содержащей, помимо смесик праймеров и РНК, буфер дляг ОТ, 0,5 мМ- дНТФ, 5 ед. ингибитора рибонуклеаз, 40 ед. ревертазы вируса лейкоза Мол они в течение 30 минут при 42 С получали кДНК. Фермент инактивировали нагреванием при 95 С в течение 5 минут. Далее, с образцами кДНК проводили ПНР с детекцией? продуктов амплификации в агарозном геле, либо ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Реакционнаясмесь для проведения реакции,ОТ в мультиплексном формате содержала несколько праймеров для ОТ (от Здоб).
Амплификацию проводили в 20; мкл реакционной смеси следующего состава: 10х буфер для; ПНР, 2 мМ Mg012s 0;25 мМ; каждого дНТФ, по 12;5 пмоль каждого праймера (прямого и обратного) 1 ед, Taq-ДНК полимеразы в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Программа ПЦР: 94Є - 3 мин; 94G - 40 сек, 70С - 40 сек, 72Є - 20 сек- Ъ\ цикла; 94С - 40 сек, 65С - 40сек, 72С - 20 сек - 3 цикла; 94G - 40 сек, 60С - 40 сек, 72G - 20 сек - 34 цикла; 72G - 2 мин; 10С -хранение..Далее продукты амплификации визуализировали в агарозном геле.
ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: ПЦР - буфер, 0,15 мМ каждого дНТФ, 2 мМ MgCl2, по 12,5 пмоль каждого из 6 пар прайм еров, 1 ед. модифицированной антителами полимеразы. Далее продукты амплификации визуализировали в агарозном геле.
Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов проводили в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты выявляли и документировали в ультрафиолетовом свете (312 нм) при помощи гель-документирующей системы «Gel Imager» (Россия).
В качестве маркера веса ДЕК использовали плазмиду pBR322 (Invitrogen, США), обработанную рестриктазами Hinfl и Dral (фрагменты 1050, 582, 504, 396, 388, 344, 298, 221, 220, 154, ПО, 75, 19 п.о.) и плазмиду pCMV-SPORT-pGal (Invitrogen, США), обработанную рестриктазой Dral (фрагменты 5246, 1273, 692, 377, 247).
При постановке мультиплексной ПЦР-РВ амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, которая содержала 20 мкл 2,5х реакционной смеси для ПЦР-РВ, смесь 3-х или 4-х пар праймеров (по 15 пмоль каждого праймера), 3 или 4 зонда (по 5 пмоль каждого зонда), 2,5 ед. Hot Start Taq ДНК полимеразы и 5 мкл кДНК. Реакцию проводили в термоциклере АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, Россия). Программа ПЦР: 95С - 120 с; 58С - 40 с, 95 С - 20 с -45 циклов. В моноспецифическом формате реакция отличалась тем, что в реакционной смеси присутствовала только одна вирусспецифичная пара праймеров и один зонд.
Определение значений пороговых циклов осуществляли согласно руководству к прибору АНК-32. Определение порогового цикла может осуществляться двумя способами: автоматическим и ручным. Для большинства случаев рекомендуется автоматический способ. Применение ручного способа подразумевает обработку результатов при непосредственном участии оператора с возможностью коррекции алгоритма обработки и целесообразно в тех случаях, когда невозможно применение автоматического способа расчета. И тот и другой способ расчета значений пороговых циклов осуществлялся при помощи программного обеспечения к прибору «АНК-32».
Для построения калибровочной прямой был использован калибратор - ПНР-продукт с известной концентрацией, вырезанный из геля и очищенный при помощи набора «Wisard Plus. DNA Purification System» («Promega», США). Готовили его 10-кратные разведения. Например - 240 000, 24 000, 2 400, 240 копий на реакционную смесь. Далее, образцы калибраторов в трех повторах и исследуемые образцы анализировали методом ПЦР-РВ (рис. 2) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green-1, либо зонда TaqMan. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси состоящей из реактивов набора для проведения ПЦР-РВ («Синтол», Россия) и 12,5 пмоль каждого праймера в термоцикл ере АНК-32. Программа ПЦР: 95С - 120 сек - 1 цикл; 55С - 50 сек, 95С - 20 сек - 45 циклов. На основе полученных данных строили калибровочную прямую (рис. 3). Расчет пороговых циклов, построение калибровочных прямых, расчет числа копий кДНК проводили при помощи программного обеспечения к амплификатору АНК-32. Далее, выражали количество копий ДНК на 1 мл, используя специальный коэффициент для пересчета.
Выявление респираторных вирусов человека в биологических образцах методом мультиплексной ПЦР с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле
Оснащение лаборатории приборами для ПЦР-РВ (АНК-32) позволило усовершенствовать разработанные тест-системы для выявления респираторных вирусов. Применение флуоресцентномеченных гибридизационных зондов обеспечивает высокую специфичность тестов, а технические возможности прибора АНК-32 позволяют в одной пробирке проводить и детектировать до четырех независимых реакций одновременно.
В настоящем разделе была поставлена цель - разработать тест-систему, позволяющую методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) одновременно выявлять в клинических образцах основных возбудителей ОРВИ: вирусы гриппа А (ВГА) и Б (ВГВ), вирусы парагриппа 1, 2, 3, 4 типов (ВПГ 1-4), аденовирусы (АДВ), респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирусы (РВ) и энтеровирусы (ЭВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК). Таким образом, список вирусов, выявляемых мультиплексной ПЦР с детекцией в агарозном геле (раздел 3.3.) на настоящем этапе работ расширился с 6 до 10 респираторных вирусов и дополнился ВГВ, ВПГ 1, ВПГ4, ЭВ. Праймеры, представленные в таблице 9 были скорректированы, так как для ПЦР-РВ предпочтительными являюся ПЦР-продукты размером до 400 п.о. [125]. Также были подобраны последовательности гибридизационных зондов, нацеленных на область между праймерами. Всего к консервативным областям вирусных геномов были подобраны последовательности 10 пар праймеров и 10 зондов (табл. 11). Праймеры и зонды были направлены к следующим участкам вирусных геномов: ВГА и ВГВ - к М-гену; РСВ - к гену нуклеопротеина N; ЭВ и РВ - к 5 -НТР; АДВ - к гену гексона; ВПГ 1-3 - к гену гемагглютинин-нейраминидазы HN; ВПГ4 - к гену фосфопротеина. Также были подобраны праймеры и зонд для выявления ВПК (табл. 11), представленного нереспираторным РНК-содержащим вирусом (вакцинный штамм вируса краснухи RA 27/3).
При отработке условий проведения реакции ОТ оценивали влияние «вынесенных» праймеров на специфичность и чувствительность выявления РНК-содержащих вирусов. «Вынесенные» праймеры представляют собой праймеры для ОТ, нацеленные на область вирусного генома за пределами ПЦР-продукта. Принцип применения «вынесенных» праймеров на примере ВГА представлен на рисунке цепь ВГА-обр Рис. 13. Применение «вынесенных» праїтеров для выявления ВГА. ВГА-от — «вынесенный» праймер для ОТ; ВГА-пр, ВГА-обр - праймеры для ПЦР-РВ; ВГА-з - зонд для ПЦР-РВ.
Предполагалось, что применение «вынесенных» праймеров позволит повысить специфичность анализа, так как помимо двух праймеров для ПЦР и зонда специфичность анализа обуславливает третий праймер. В тоже время, следует учитывать, что его применение, может снизить чувствительность анализа, если «вынесенный» праймер будет неспецифически взаимодействовать с праймерами для ПЦР. Был проведен сравнительный анализ применения в реакции ОТ «вынесенных» праймеров и праймеров, которые используются на стадии ПЦР. В качестве основного критерия в этом анализе учитывались значения пороговых циклов, полученные на R-A или G, Y- С или Т. одном и том же вирусном материале с использованием или «вынесенных» праймеров, или с использованием праймеров, которые участвуют в ПЦР. Такой подход оказался оправданным при выявлении ЭВ, ВГА, ВГВ, РСВ и ВПК. В таблице 11 представлены «вынесенные» праймеры, обозначенные как: ЭВ-от, ВГА-от, ВГВ-от, РСВ-от, ВПК-от, которые в дальнейшем использовались при постановке ОТ. Для выявления РВ, ВПГ 1, 2, 3, 4 на стадии ОТ использовались праймеры NTR-6 (табл. 7), ВПП-пр, ВПГ2-пр, ВПГЗ-пр, ВПГ4-пр (табл. 11), соответственно.
На стадии ПЦР для выявления АДВ использовались праймеры All, А44 (табл. 11), зонд АДВ-з; для ЭВ - праймеры ЭВ-пр, ЭВ-обр, зонд ЭВ-з; для ВПК - ВПК-пр, ВПК-обр, зонд ВПК-з; для ВГВ - праймеры ВГВ-пр, ВГВ-обр, зонд ВГВ-з; для РСВ -праймеры РСВ-пр, РСВ-обр, зонд РСВ-з; для ВГА - ВГА-пр, ВГА-обр, зонд ВГА-з; для РВ - праймеры NTR-3, NTR-6 (табл. 7), зонд РВ-з; для ВПГ 1-4 - праймеры ВПГ1-4пр, ВПГ1-4обр, зонды ВПГІ-4-з. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, которые использовались в мультиплексной ПЦР-РВ, представлены в таблице 11.
Специфичность разработанных праймеров и зондов контролировали в ПЦР-РВ (моноспецифический формат) на лабораторных штаммах вирусов, перечисленных в разделе «Материалы и методы». Выбор используемых в данной работе штаммов обусловлен несколькими причинами. Ежегодный надзор за распространением вирусов гриппа и сравнительный анализ состава вирусных популяций, проводимый ЦЭЭГ, показал, что в течение одного эпидемического сезона, как правило, социркулируют вирусы гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В [6]. Поэтому в исследование был включен ряд вирусов этих серологических подгрупп, как эталонных (рекомендованных ВОЗ в качестве вакцинных), так и эпидемических, в том числе эпидемические штаммы вирусов гриппа А и В сезона 2007-2008 гг. Также в исследование были включены штаммы вирусов гриппа A (H2N2). Этот выбор мы обуславливаем тем, что многие научно-обоснованные аргументы свидельствует в пользу антропонозной природы будущей пандемии, которая может быть связана с возвратом в циркуляцию вируса A (H2N2), бессимптомно персистирующего среди населения с 1968 года или среди животных в составе различных реассортантов [2]. Выбранные для исследования штаммы энтеровирусов по данным литературы могут быть ассоциированы с респираторными заболеваниями верхних дыхательных путей [43, 49, 122, 158, 169, 170, 177]. Выбранные штаммы остальных групп вирусов чаще всего используются исследователями при разработке тест-систем в качестве биологических стандартов [9, 15].
